超聲波輔助堿溶酸沉法提取藜麥麩皮蛋白及特性

孫永杰，趙陽(yáng)，肖穎，王思妤

長(zhǎng)春科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（長(zhǎng)春 130600）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）認(rèn)為藜麥?zhǔn)俏ㄒ灰环N單體植物即滿足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的食物，正式推薦藜麥為最適宜人類的完美“全營(yíng)養(yǎng)性食品”。

藜麥加工過(guò)程中產(chǎn)生大量的麩皮，其被遺棄而未得到合理的利用，造成大量資源浪費(fèi)。近幾年大多學(xué)者對(duì)于藜麥麩皮的研究集中在總皂苷的提取工藝或活性研究方面，但對(duì)藜麥麩皮中蛋白質(zhì)的研究甚少，藜麥麩皮蛋白含量高達(dá)28.86%。試驗(yàn)采用堿溶酸沉的方法，優(yōu)化藜麥麩皮蛋白的提取工藝及特性分析，為將來(lái)藜麥麩皮蛋白的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

藜麥皮（未粉碎），吉林省通榆藜麥種植基地；濃鹽酸、氫氧化鈉，學(xué)校實(shí)驗(yàn)室藥品管理部門。

FPA-4（電磁力）電子分析天平（福州衡之展電子有限公司）；pHS-210實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（廈門和譜儀器有限公司）；HH.S21-Ni8恒溫水浴鍋（北京首易品科技中心）；KH20R實(shí)驗(yàn)用臺(tái)式高速離心機(jī)（天津綜科科技有限公司）；VAPODEST可編程蒸餾式全自動(dòng)凱氏定氮儀（廣州德資格哈特儀器有限公司）；上海昂尼AE300L-P/H/實(shí)驗(yàn)室高速剪切分散乳化機(jī)/分散均質(zhì)機(jī)（南京昕?jī)x生物科技有限公司）；HSCX800W超聲波清洗機(jī)（濟(jì)寧恒碩電子科技有限公司）；透析袋[中科瑞泰（北京）生物科技有限公司]。

1.2 工藝流程

藜麥麩皮→預(yù)處理→調(diào)pH→超聲處理→離心→取上清液→調(diào)pH→離心→取沉淀→透析袋透析→離心凍干

1.3 操作要點(diǎn)

將藜麥皮過(guò)0.425 mm篩洗凈，放在超微粉碎儀中粉碎，在35 ℃干燥，后置于干燥處密封備用。將處理好的麥麩皮，按照一定的料液比混合。用0.5 mol/mL的NaOH調(diào)節(jié)到堿性條件，放置在800 W的超聲波清洗機(jī)中，設(shè)置好時(shí)間和溫度，后將其放置到離心機(jī)中以4 000 r/min離心30 min，提取上清液，用0.5 mol/mL的HCl，調(diào)節(jié)到等電點(diǎn)，放置到離心機(jī)中以4 000 r/min離心30 min，收集沉淀，按一定的料液比溶于水中，調(diào)節(jié)pH 7.0，用透析袋脫鹽36 h，每8 h換1次水，然后在4 ℃的條件下11 000 r/min離心凍干10 min，得到藜麥麩皮蛋白。

1.4 藜麥麩皮等電點(diǎn)的確定

在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶液的黏度、滲透壓均減到最低，增加了蛋白質(zhì)的沉淀。根據(jù)蔡沙等[5]確定的麩皮蛋白等電點(diǎn)的操作方法進(jìn)行。量取270 mL上述麩皮蛋白提取液，平均分成9份，每份30 mL，分別依次調(diào)節(jié)pH至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0，靜置30 min左右，于10 000 r/min離心15 min，取上清液，分別測(cè)定其在595 nm處吸光度，上清液吸光度最小時(shí)對(duì)應(yīng)的pH即為麩皮蛋白等電點(diǎn)。再以上述測(cè)得的等電點(diǎn)為粗等電點(diǎn)，以其對(duì)應(yīng)的pH為中心，以0.1為單位，向前后擴(kuò)散，再各取5個(gè)點(diǎn)，按照上述步驟用相同的方法測(cè)定這5個(gè)點(diǎn)的吸光度，最終測(cè)得吸光度最小的pH，即為麩皮蛋白的等電點(diǎn)。

1.5 單因素試驗(yàn)

以藜麥麩皮蛋白的得率為指標(biāo)，對(duì)影響麩皮蛋白得率的因素[提取液的pH（10.0，10.5，11.0，11.5，12.0和12.5）、提取溫度（35，40，45，50，55和60℃）、提取時(shí)間（25，30，35，40，45和50 min）和料液比（1∶12，1∶15，1∶18，1∶20，1∶25和1∶30 g/mL）]進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在對(duì)某一個(gè)單因素進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，必須保證其他因素的固定。

1.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選取每個(gè)影響因素3個(gè)較優(yōu)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，見表1。

表1 正交因素表

1.7 麩皮蛋白的性質(zhì)研究

1.7.1 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

稱取12 g蛋白樣品溶解于300 mL蒸餾水中，配制4.0%的麩皮蛋白溶液，加入大豆油，按體積比3∶1混合，采用高速分散器（20 000 r/min）均質(zhì)1 min，取出60 mL備用。用加水稀釋的方法依次配制3.5%，3.0%，2.5%，2.0%，1.5%和1.0%的麩皮蛋白溶液，并按照比例加入一定體積的大豆油，重復(fù)以上操作之后以1 500 r/min離心5 min，讀取并記錄乳化層高度，按照式（1）計(jì)算麩皮蛋白乳化性；同時(shí)量取10 mL上述乳化液于離心管中，于85 ℃水浴中恒溫加熱30 min，取出后再以1 500 r/min離心5 min，冷卻放置30 min，后讀取并記錄乳化層高度，按照式（2）計(jì)算麩皮蛋白乳化穩(wěn)定性。以上過(guò)程每個(gè)濃度重復(fù)3次，以平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。

1.7.2 起泡特性的測(cè)定

蛋白質(zhì)起泡特性包括起泡能力和穩(wěn)泡能力，前者是指一定條件下產(chǎn)生泡沫的量，后者則指形成的泡沫穩(wěn)定性。同樣稱取12 g蛋白樣品溶解于300 mL蒸餾水中，配制4.0%的麩皮蛋白溶液，以20 000 r/min在高速分散器下均質(zhì)1 min，迅速取出20 mL于25 mL量筒中，讀取泡沫體積，用加水稀釋的方法再配制3.5%，3.0%，2.5%，2.0%，1.5%和1.0%的麩皮蛋白溶液，并按照比例加入一定體積的大豆油，重復(fù)以上操作后放置30 min，讀取泡沫體積，按照式（3）和（4）計(jì)算起泡性及泡沫穩(wěn)定性。

1.7.3 溶解性測(cè)定

采用Bradford法測(cè)定蛋白樣品的溶解性，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取5 g樣品加入50 mL蒸餾水中，用0.5 mol/L HCl或0.5 mol/L NaOH溶液分別依次調(diào)節(jié)pH至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0和12.0，不同的pH蛋白溶液分別在40，45，50，55和60 ℃下水浴30 min，然后取出，用玻璃棒攪拌30 min，在3 500 r/min的速率下離心15 min，取出上清液，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，測(cè)定其在595 nm下的吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得出含量，按照式（5）計(jì)算溶解性。

2 結(jié)果與分析

2.1 麩皮蛋白等電點(diǎn)結(jié)果分析

由表2可知，麩皮蛋白的初等電點(diǎn)為pH 3.0。由此可以測(cè)定麩蛋白更精確的等電點(diǎn)。結(jié)果如表3所示。

表2 麩皮蛋白的粗等電點(diǎn)

從表3可以看出，麩皮蛋白的等電點(diǎn)是pH 3.1。

表3 麩皮蛋白等電點(diǎn)

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 料液比對(duì)麩皮蛋白提取效果的影響

由圖1可知，隨著料液比的增加，提取效果呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著料液比的增加，溶質(zhì)的擴(kuò)散速度也隨之增加，并促進(jìn)水溶性物質(zhì)的充分溶出，導(dǎo)致提取物的含量升高，當(dāng)擴(kuò)散速度恒定時(shí)，料液比繼續(xù)增加，提取物的濃度就會(huì)下降，提取物的純度也會(huì)隨之下降。當(dāng)料液比1∶18 g/mL時(shí)，麩皮蛋白的得率達(dá)到最大值33.5%。

圖1 料液比對(duì)麩皮蛋白提取效果的影響

2.2.2 pH對(duì)麩皮蛋白提取效果的影響

由圖2可知：麩皮蛋白的得率隨pH的增加呈現(xiàn)先緩慢增加后迅速降低的變化趨勢(shì)，這是因?yàn)楫?dāng)pH為10.0～12.0時(shí)，堿溶度較低，蛋白質(zhì)與淀粉分離不完全；當(dāng)pH為12.0～12.5時(shí)，得率急劇下降，這是由于堿溶度過(guò)大，導(dǎo)致淀粉糊化，也容易使蛋白質(zhì)發(fā)生變性；當(dāng)pH為12.0時(shí)，得率最大，為23%。

圖2 pH對(duì)麩皮蛋白提取效果的影響

2.2.3 溫度對(duì)麩皮蛋白提取效果的影響

由圖3可以看出：麩皮蛋白的得率受提取溫度的影響較大，當(dāng)溫度在55 ℃之前，麩皮蛋白的得率不斷增加，到55 ℃時(shí)達(dá)到最大值23%；溫度繼續(xù)上升，麩皮蛋白的得率就會(huì)不斷地下降。通常情況下，溫度過(guò)高會(huì)使溶液的黏度變大，分子的運(yùn)動(dòng)速度減慢，阻止蛋白質(zhì)溶解到溶液中，同時(shí)由于疏水基團(tuán)的暴露和展開，蛋白質(zhì)分子凝集，使蛋白質(zhì)溶解度下降，還有可能發(fā)生蛋白質(zhì)變性，這些都可能導(dǎo)致蛋白得率下降。

圖3 溫度對(duì)麩皮蛋白提取效果的影響

2.2.4 時(shí)間對(duì)麩皮蛋白提取效果的影響

由圖4可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在25～30 min時(shí)得率緩慢上升，在30～35 min時(shí)得率迅速上升，在35 min時(shí)得率達(dá)到最大值，在35～50 min時(shí)得率緩慢下降。因?yàn)辂滬熤械囊恍A性物質(zhì)和其他物質(zhì)溶出需要時(shí)間，所以隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，麩皮蛋白的得率也會(huì)隨之增大，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，這些物質(zhì)又會(huì)發(fā)生共沉現(xiàn)象，導(dǎo)致得率降低。因此可以看出麩皮蛋白的得率隨時(shí)間呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間35 min時(shí)，麩皮蛋白得率達(dá)到最大，為34.5%。

圖4 時(shí)間對(duì)麩皮蛋白提取效果的影響

2.3 正交結(jié)果分析

從表4中的極差R比較可知，影響麩皮蛋白提取效率的因素的主次順序?yàn)镃＞D＞B＞A，即提取時(shí)間影響最大，提取pH次之。各因素理論最佳提取條件為A3B1C3D2，即料液比1∶25（g/mL），提取溫度50 ℃，提取時(shí)間45 min，提取pH 11.5。而9次處理得到的最優(yōu)組合為試驗(yàn)組7的A3B1C3D2，即料液比1∶25（g/mL），提取溫度50 ℃，提取時(shí)間45 min，提取pH 11.5，與得出的理論最優(yōu)組合一致。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 麩皮蛋白特性結(jié)果分析

通過(guò)試驗(yàn)計(jì)算得出在麩皮蛋白溶液濃度為3%時(shí)具有最好的乳化性及乳化穩(wěn)定性，同時(shí)得到乳化性的最大值69%，乳化穩(wěn)定性是64%；當(dāng)其濃度為3.5%時(shí)麩皮蛋白溶液的起泡性和氣泡穩(wěn)定性較好，分別為52%和37%；當(dāng)pH 4.0時(shí)，麩皮蛋白溶液的溶解度最小，只有27%。

試驗(yàn)中得到的結(jié)果與王棐等[9]、王龍飛等[10]的結(jié)果對(duì)比得出：乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、氣泡穩(wěn)定性、溶解性都受到pH、溫度、含油量、離子強(qiáng)度和超聲波處理中某些因素的影響。

3 結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)超聲波輔助堿法提取麩皮蛋白進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝：料液比1∶25（g/mL）、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間45 min、提取pH 11.5。在此條件下麩皮蛋白的得率為25.75%，并對(duì)優(yōu)選的結(jié)果進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，表明該工藝穩(wěn)定高效。特性試驗(yàn)得出乳化性的最大值是69%，乳化穩(wěn)定性是64%，起泡性最大值是52%，氣泡穩(wěn)定性是37%，溶解度最小值是27%。該試驗(yàn)為將來(lái)藜麥麩皮蛋白的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。