水解度對(duì)牡丹籽蛋白肽乳狀液穩(wěn)定性的影響

張謹(jǐn)華，楊萬明，蘇艷玲，周哲峰

晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系（晉中 030600）

水包油型乳狀液在大多數(shù)食品的加工、配方和感官特性中起著關(guān)鍵作用。乳狀液往往會(huì)受到幾個(gè)機(jī)制的影響產(chǎn)生物理不穩(wěn)定狀態(tài)，包括分散液滴的絮凝、聚集和聚結(jié)等。此外，乳狀液在乳化成小液滴之后，會(huì)增加脂滴的界面面積，這就增加了與氧分子和過渡金屬的接觸。水解的蛋白在乳狀液中不僅能將乳狀液乳化成小分子的液滴，減小乳化液滴的粒徑，還能夠通過終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、螯合金屬離子對(duì)抗油脂的氧化，穩(wěn)定油滴對(duì)聚結(jié)或絮凝的作用，有助于形成穩(wěn)定的乳狀液[1]。一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液的物理不穩(wěn)定性（如聚結(jié)）與油水界面上蛋白質(zhì)膜的性質(zhì)（如形成具有高彈性模量的緊密黏彈性和相互連接的網(wǎng)絡(luò)）之間存在明顯聯(lián)系。

牡丹因其優(yōu)異的觀賞價(jià)值和品種選擇而成為世界范圍內(nèi)的商品植物。牡丹籽粕是榨油后的副產(chǎn)品，僅作為飼料和有機(jī)肥使用，附加值較低。牡丹籽粕蛋白質(zhì)含量較高，是一種營養(yǎng)健康的植物蛋白，在食品工業(yè)中可作為食品原料和功能蛋白的替代來源。牡丹籽蛋白營養(yǎng)價(jià)值高，能作為乳化劑提供物理穩(wěn)定性而常被用于水包油型食品中。牡丹籽蛋白水解物能夠作為牡丹籽蛋白的替代品，擁有更好的功能特性。酶解是一種特別有吸引力的蛋白質(zhì)修飾技術(shù)，因?yàn)樗璧墓に嚄l件較溫和，控制反應(yīng)相對(duì)容易，副產(chǎn)物形成最少。肽鍵的斷裂導(dǎo)致自由氨基和羧基的濃度增加，從而增加溶解度[2]。與天然蛋白質(zhì)相比，低水解度或高水解度的蛋白水解物具有較差的乳化能力，而具有中間水解度的蛋白水解物具有更好的乳化能力。對(duì)蛋白進(jìn)行重度水解能夠產(chǎn)生較多的游離氨基酸和小分子的多肽，使得蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但此時(shí)蛋白質(zhì)已喪失原有的乳化特性[3]。因此，水解度影響著蛋白質(zhì)的功能特性。試驗(yàn)采用堿性蛋白酶對(duì)牡丹籽蛋白水解1，2，3和4 h，并研究水解度對(duì)牡丹籽蛋白水解物制備乳狀液的物理穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

牡丹籽蛋白（杭州景杰生物科技股份有限公司）；堿性蛋白酶（丹麥Novo公司）；大豆油（山東萬得福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；十二烷基硫酸鈉（美國Sigma公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

T18勻漿機(jī)（德國IKA公司）；馬爾文Nano ZS動(dòng)態(tài)光散射儀（馬爾文儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牡丹籽蛋白水解物的制備

將牡丹籽蛋白配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的溶液，在95℃下加熱5 min，用堿性蛋白酶（酶活2.4 AU/g）在pH 8.0，55 ℃水浴中分別水解1，2，3和4 h，水解過程中始終保持pH不變。酶與底物濃度的質(zhì)量比1∶100。水解結(jié)束后，調(diào)至pH 7.0，于95 ℃滅酶5 min，水解物在9 000 r/min下離心10 min，上清液凍干備用。

1.3.2 乳狀液的制備

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的大豆油和質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%的牡丹籽蛋白水解物混合，在13 500 r/min下勻漿2 min后，在40 MPa高壓下均質(zhì)2次。

1.3.3 水解度的測(cè)定

式中：h為水解液中的肽鍵數(shù)，mmol/g；htot為蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)，mmol/g；V為水解所消耗堿量，mL；Nb為堿濃度，mol/L；MP為水解液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；1/α為校正系數(shù)。

1.3.4 溶解度的測(cè)定

將牡丹籽蛋白水解物在5 000 r/min下離心15 min，測(cè)定上清液中的蛋白含量。上清液的蛋白含量與總蛋白含量所得比值即為蛋白溶解度。

1.3.5 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

取50 μL新制備的乳狀液加入到5 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%十二烷基硫酸鈉中充分混勻，在500 nm下測(cè)定吸光度。乳化活性為新制備乳狀液在500 nm下的吸光度，用A500表示。乳化穩(wěn)定性按式（3）計(jì)算。

式中：A0為乳狀液靜置0 h在500 nm下的吸光度；A12為乳狀液靜置12 h后500 nm下的吸光度。

1.3.6 粒徑和電勢(shì)的測(cè)定

取50 μL乳狀液加入到5 mL超純水中混勻，在室溫下測(cè)定乳狀液的粒徑和電勢(shì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)操作3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用IBM Spass statistics 25和Orign 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹籽蛋白水解物的水解度和溶解度

由表1可知：酶解蛋白質(zhì)的水解時(shí)間與水解度呈正比例關(guān)系，隨著水解時(shí)間增加，水解度顯著增加（p＜0.05）。水解前的加熱處理能夠打開蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，這讓氨基酸殘基得以足夠表露，能夠使水解變得更加完全[4]。隨著水解的進(jìn)行，溶解度呈現(xiàn)顯著增加的變化趨勢(shì)（p＜0.05），牡丹籽蛋白通常以高度聚集的形式存在，導(dǎo)致其溶解性差且分散性差。水解所得到的小肽比非水解蛋白中多肽的極性更強(qiáng)，能與水形成較強(qiáng)的氫鍵，從而更易溶于水溶液。預(yù)熱處理使蛋白容易產(chǎn)生聚合物，使其在后續(xù)的水解中依然存在一部分并未得到完全溶解，并且在最終階段蛋白酶會(huì)與暴露出的疏水基團(tuán)反應(yīng)，引發(fā)基團(tuán)的進(jìn)一步暴露[5]。

表1 牡丹籽蛋白水解物的水解度和溶解度

2.2 水解度對(duì)牡丹籽蛋白水解物制備乳狀液乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

表2結(jié)果表明：隨著水解度的增加，乳狀液的乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)（p＜0.05）。水解度為10.91%時(shí)，油滴在乳狀液中分散得更好，體系表現(xiàn)出更高的乳化活性。蛋白質(zhì)經(jīng)過水解后，蛋白質(zhì)的分子特性發(fā)生改變，如分子量變小，親水和疏水基團(tuán)的數(shù)量和位置發(fā)生改變。牡丹籽蛋白水解物通過吸附在界面上并篩選油水分子間的不利相互作用來降低界面張力，并且能夠吸附在油和水的界面上，使乳狀液達(dá)到均一、穩(wěn)定的狀態(tài)。水解度超過10.91%時(shí)，過度水解使暴露出來的疏水位點(diǎn)遭到破壞或是蛋白質(zhì)之間的聚集物會(huì)掩蓋一部分的疏水位點(diǎn)，致使表面疏水性降低，蛋白質(zhì)的乳化活性降低，乳狀液的乳化穩(wěn)定性降低[6]。

表2 水解度對(duì)牡丹籽蛋白水解物制備乳狀液乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

2.3 水解度對(duì)牡丹籽蛋白水解物制備乳狀液粒徑的影響

如圖1所示：隨著水解度增加，由牡丹籽蛋白水解物制備乳狀液的粒徑呈現(xiàn)先降低后增加趨勢(shì)（p＜0.05）；水解度為10.91%時(shí)，乳狀液的粒徑最小。這是由于隨著水解度增加，水解會(huì)使多肽鏈增加，牡丹籽蛋白的分子構(gòu)象發(fā)生改變，降低油水界面張力，從而使牡丹籽蛋白水解物的乳化性增強(qiáng)。蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的非共價(jià)相互作用（例如氫鍵、疏水相互作用）減弱，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性以及蛋白質(zhì)聚集體的解離[7]。在堿性蛋白酶作用下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的斷裂會(huì)更加均勻，這有助于聚集蛋白質(zhì)顆粒的逐漸破碎和其尺寸的減小。然而，水解度超過10.91%時(shí)，過度水解破壞了牡丹籽蛋白內(nèi)部的氫鍵、離子鍵和范德華力等，破壞蛋白質(zhì)本身的乳化性，導(dǎo)致乳狀液發(fā)生聚集和凝結(jié)等現(xiàn)象。

圖1 水解度對(duì)牡丹籽蛋白水解物制備乳狀液粒徑的影響

2.4 水解度對(duì)牡丹籽蛋白水解物制備乳狀液ζ-電勢(shì)值的影響

圖2表明：水解度對(duì)牡丹籽蛋白水解物制備乳狀液的ζ-電勢(shì)值的影響較為顯著（p＜0.05）。隨著水解度增加，乳狀液的ζ-電勢(shì)值先升高后降低，水解度為10.91%時(shí)，乳狀液的ζ-電勢(shì)值最高。蛋白質(zhì)經(jīng)過水解后液滴所帶電荷的電荷量增加，蛋白質(zhì)上的極性基團(tuán)能夠吸附在液滴表面，在相鄰液滴間形成靜電斥力，使液滴間保持一定的分離距離從而抵抗液滴間的聚集，從而增加乳狀液的穩(wěn)定性[8]。高水平的表面電荷，使吸附的蛋白質(zhì)在液滴周圍形成黏彈性保護(hù)界面層，乳狀液聚結(jié)的可能性較小，因此穩(wěn)定性增加。水解度超過10.91%時(shí)，乳狀液的ζ-電勢(shì)值顯著降低（p＜0.05）。用水解度較高的水解物穩(wěn)定的乳狀液的ζ-電勢(shì)值降低，這可能是較少量的蛋白質(zhì)吸附在界面上，液滴尺寸越大，蛋白質(zhì)的吸附量越小，液滴越少，界面面積越小。此時(shí)，吸附在界面上的蛋白質(zhì)產(chǎn)生空間排斥和靜電排斥減弱，從而使乳狀液物理穩(wěn)定性降低。

圖2 水解度對(duì)牡丹籽蛋白水解物制備乳狀液ζ-電勢(shì)值的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，水解后牡丹籽蛋白以膠狀聚集體形式存在于溶液中，并形成較強(qiáng)的氫鍵，從而使牡丹籽蛋白以溶解性良好的小分子形式存在。水解能夠增加蛋白質(zhì)的乳化性，當(dāng)水解時(shí)間2 h，水解度為10.91%時(shí)，乳狀液具有最好的物理穩(wěn)定性。適度水解的牡丹籽蛋白在乳狀液中分散得更好，表現(xiàn)出更高的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。水解能夠使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)斷裂，并有助于聚集蛋白質(zhì)顆粒破碎、乳化液滴尺寸減小。水解后液滴所帶電荷的電荷量增加，在相鄰液滴間形成靜電斥力，抵抗液滴間的聚集，從而增加乳狀液的穩(wěn)定性。高度水解是不可取的，當(dāng)水解度超過10.91%時(shí)，蛋白質(zhì)被水解為分子量極小的多肽，這多肽缺乏所需的表面功能特性，乳狀液的物理穩(wěn)定性降低。