冷凝回流法制備直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物

劉華玲，閔照永，王永剛，許真，張洋，汪松,3*

1. 鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院（鶴壁 458000）；2. 鶴壁市綠色食品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（鶴壁 458000）；3. 中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所（北京 100101）

L-色氨酸具有生物學(xué)活性，在動(dòng)植物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化成為5-HT、褪黑素、尼克酸等生物活性物質(zhì)，并影響血壓、痛覺、情緒、睡眠與覺醒及神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)，參與代謝調(diào)控過程，色氨酸是一種非神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸，在體內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、免疫和消化功能。L-色氨酸是一種必需氨基酸，在人體內(nèi)無法合成，需要從食物中攝取[1]。色氨酸也是構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種常見氨基酸之一。膳食中缺乏色氨酸會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)水平并抑制免疫功能，從而導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)疾病感染、發(fā)病率和死亡率的增加[2]。各種研究表明，色氨酸在免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，影響巨噬細(xì)胞的吞噬作用。膳食色氨酸的增加可以促進(jìn)血清免疫球蛋白的合成并增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的防御。色氨酸是營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸，對(duì)動(dòng)物免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)具有活性[3]。淀粉作為碳水化合物在細(xì)胞中重要的儲(chǔ)存方式，廣泛存在于自然界中，可以作為人體攝取能量的重要來源之一[4]。淀粉主要由直鏈淀粉與支鏈淀粉組成，支鏈淀粉主要是由α-1, 4糖苷鍵和α-1, 6鍵連接而成的聚合物[5]，直鏈淀粉主要是由D-葡萄糖通過α-1, 4-糖苷鍵連接的線性多糖[6]，可以與各種配體形成復(fù)合物[7]。根據(jù)X-射線衍射圖譜，淀粉可分為A型、B型和C型晶體結(jié)構(gòu)[8]。

在B型微晶淀粉和色氨酸的作用下，采用冷凝回流方式來制備直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物，以復(fù)合物的相對(duì)結(jié)晶度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合物的制備工藝，并對(duì)結(jié)晶度最佳的復(fù)合物進(jìn)行掃描電子顯微鏡（SEM）、X-射線衍射（XRD）、紅外光譜（FT-IR）、熱重（TG）和拉曼光譜（RAMAN）分析和測(cè)試，進(jìn)一步研究直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)和表觀特征。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

馬鈴薯淀粉，固原長(zhǎng)城淀粉有限公司；色氨酸，上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、鹽酸，均為分析純化學(xué)試劑。

SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；LG10-2.4A型高速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；PhilipsXL-3型掃描電子顯微鏡（SEM）：日本日立公司；BrukerTENSOR27型紅外光譜儀（FTIR）、BrukerD8型X-射線衍射儀（XRD）：德國(guó)布魯克公司；TG/DTA-A型綜合熱分析儀（TG）：日本；便攜式拉曼光譜儀BWS465-785S（RAMAN）：美國(guó)BWTEK公司；Scientz-12N壓蓋型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 直鏈淀粉的制備

按照參考文獻(xiàn)[9]的制備方法制備得到。取一定量的馬鈴薯淀粉，用2.2 mol/L的鹽酸配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的淀粉懸浮液，在35 ℃下恒溫酸解3 d，抽濾，用去離子水洗滌4次，再用無水乙醇洗滌3次，收集固體，室溫晾干備用。將酸解得到的馬鈴薯淀粉配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的懸浮液，加熱煮沸使其充分糊化，自然冷卻到室溫，離心分離除去不溶物，上層清液在-18℃下冷凍12 h。將冷凍樣品在室溫下緩慢解凍，當(dāng)殘余有少量冰晶時(shí)，及時(shí)抽濾，并用冷水洗滌，收集濾餅，在室溫下晾干，即為直鏈淀粉。

1.2.2 直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物的制備

稱取1.00 g直鏈淀粉與一定量L-色氨酸于三口燒瓶中，加入20 mL去離子水，接冷凝回流管，加熱煮沸至透明。將一定量的無水乙醇加入熱的淀粉溶液中，混合均勻后，加熱回流10 min，關(guān)閉電源，隨后按不同的結(jié)晶溫度將溶液冷至室溫，靜置結(jié)晶完成后，離心分離，冷凍干燥后得直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

不同淀粉/色氨酸配比對(duì)復(fù)合物結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)31.03%、結(jié)晶溫度60 ℃，淀粉/色氨酸配比分別為6∶1，8∶1，10∶1，12∶1和14∶1。

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)復(fù)合物結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響：固定結(jié)晶溫度60 ℃、淀粉/色氨酸配比10∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為31.03%，35.48%，39.39%，43.86%和45.95%。

不同結(jié)晶溫度對(duì)復(fù)合物結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)31.03%、淀粉/色氨酸配比10∶1，結(jié)晶溫度分別為55，60，70，80和90 ℃。

1.2.4 掃描電子顯微鏡（SEM）

觀察樣品之前，利用噴涂?jī)x對(duì)樣品進(jìn)行鍍金處理，在操作電壓為20 kV時(shí)，使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀測(cè)樣品的微觀形貌。

1.2.5 X-射線衍射（XRD）

取樣品粉末置于長(zhǎng)方形鋁片的孔中（孔大小為15 mm×20 mm，厚為115 mm），隨后壓緊，用BurkerD8型X射線衍射儀測(cè)定，所用波長(zhǎng)為0.154 2 nm的單色Cu-Kα射線。測(cè)試條件：管壓3 kV，管流20 mA，掃描速度4°/min，掃描區(qū)域5°～60°，采樣步寬0.04°，掃描方式為連續(xù)，重復(fù)次數(shù)為1。相對(duì)結(jié)晶度的計(jì)算，采用Nara等[10]所利用的XRD譜圖計(jì)算相對(duì)結(jié)晶度的方法。

1.2.6 紅外光譜（IR）

稱取約2 mg樣品研細(xì)，加入150 mg干燥KBr，混合均勻并研細(xì)、壓片，壓片厚約0.5 mm，隨后將該薄片進(jìn)行紅外掃描。測(cè)試條件：掃描波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。采用DTGS檢測(cè)器，以空氣為空白，掃描3次后取平均值得到樣品的紅外光譜圖。

1.2.7 熱重分析（TG）

取約3 mg試樣置于陶瓷試樣皿中，將樣品盤壓緊密封，測(cè)試條件為掃描范圍30～600 ℃、升溫速率10℃/min。

1.2.8 拉曼光譜分析（RAMAN）

拉曼光譜測(cè)試采用了美國(guó)BWTEK公司的BWS465-785S型便攜式拉曼光譜儀，激發(fā)波長(zhǎng)為785 nm，激光功率小于300 mW，20倍長(zhǎng)焦物鏡背向散射測(cè)量模式，掃描次數(shù)20次，曝光時(shí)間10 s。使用100 mW的激光照射，在180°范圍內(nèi)搜集散射輻射，波數(shù)范圍為175～3 200 cm-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

利用Origin 6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到X-射線衍射圖譜及紅外光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物制備條件的優(yōu)化

2.1.1 淀粉/色氨酸配比對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的影響

圖1為不同直鏈淀粉/色氨酸配比時(shí)，所得復(fù)合物的XRD圖。探究直鏈淀粉/色氨酸配比對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的影響，則需固定乙醇體積分?jǐn)?shù)31.0%、結(jié)晶溫度60℃，改變直鏈淀粉/色氨酸配比，制得復(fù)合物。5種復(fù)合物衍射曲線均在15.16°，17.47°和23.35°左右出現(xiàn)了衍射峰，為A型結(jié)晶結(jié)構(gòu)。當(dāng)直鏈淀粉/色氨酸配比為14∶1時(shí)，衍射峰在三個(gè)衍射角的強(qiáng)度均較弱。將圖1所得各衍射曲線進(jìn)行處理，得出各衍射峰強(qiáng)度、峰面積和結(jié)晶度，列于表1。

圖1 不同直鏈淀粉/色氨酸配比時(shí)所得復(fù)合物的XRD圖

從表1可以看出，隨著直鏈淀粉/色氨酸比例的升高，相對(duì)結(jié)晶度先增加后減少，這表明色氨酸的添加量直接影響復(fù)合物的結(jié)晶度。當(dāng)直鏈淀粉/色氨酸配比由6∶1上升至8∶1時(shí)，復(fù)合物的相對(duì)結(jié)晶度由50.15%上升至54.69%；當(dāng)直鏈淀粉/色氨酸配比由8∶1上升至14∶1時(shí)，復(fù)合物的結(jié)晶度由54.69%下降至47.14%；當(dāng)直鏈淀粉/色氨酸的配比達(dá)到8∶1時(shí)，直鏈淀粉重結(jié)晶形成的復(fù)合物結(jié)晶結(jié)構(gòu)最佳，色氨酸的量過多或過少都會(huì)影響復(fù)合物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。因此，淀粉/色氨酸的最佳配比為8∶1，相對(duì)結(jié)晶度可達(dá)54.69%。

表1 不同直鏈淀粉/色氨酸配比時(shí)所得復(fù)合物結(jié)晶度和相關(guān)衍射數(shù)據(jù)

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的影響

圖2為不同乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，所得復(fù)合物的XRD圖。探究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)復(fù)合物結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響，固定直鏈淀粉/色氨酸質(zhì)量配比10∶1、結(jié)晶溫度60 ℃，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)，制得復(fù)合物。從圖2中可以看出，5種復(fù)合物衍射曲線均在15.16°，17.38°和23.60°左右出現(xiàn)了衍射峰，說明色氨酸與B型淀粉復(fù)合形成了A型結(jié)構(gòu)。將圖2所得各衍射曲線進(jìn)行處理，得出各衍射峰強(qiáng)度、面積和結(jié)晶度，列于表2。

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)所得復(fù)合物的XRD圖

表2中相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，衍射峰的強(qiáng)度和尖銳程度均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)復(fù)合物結(jié)晶結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。這是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)過高造成淀粉沉積時(shí)間過短，淀粉在溶劑中溶解度下降，未能形成較好的晶型[11]。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，復(fù)合物的結(jié)晶度先增大后減少，乙醇體積分?jǐn)?shù)為39.39%時(shí)，復(fù)合物的結(jié)晶最好，其結(jié)晶度為41.00%。

表2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下所得復(fù)合物結(jié)晶度和相關(guān)衍射數(shù)據(jù)

2.1.3 結(jié)晶溫度對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的影響

圖3為不同結(jié)晶溫度時(shí)，所得復(fù)合物的XRD圖。從圖3可以看出，各衍射曲線的基線較高，表明復(fù)合物中無定型結(jié)構(gòu)居多，5種樣品衍射曲線均在15.21°，17.28°和23.06°左右出現(xiàn)了衍射峰，為A型結(jié)晶結(jié)構(gòu)的特征峰。將圖3所得各衍射曲線進(jìn)行處理，得出各衍射峰強(qiáng)度、相對(duì)峰面積和相對(duì)結(jié)晶度，列于表3。

圖3 不同結(jié)晶溫度時(shí)所得A型復(fù)合物的XRD圖

從表3可以看出，結(jié)晶溫度在55～80 ℃時(shí)，復(fù)合物的特征峰和尖銳程度均無顯著變化，但超過80 ℃后，明顯看到復(fù)合物的特征峰減弱，相對(duì)結(jié)晶度顯著下降，原因可能是高溫可以讓B型復(fù)合物和色氨酸的活性增強(qiáng)，從而影響復(fù)合物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)[12]。根據(jù)A型復(fù)合物相對(duì)結(jié)晶度的計(jì)算可知，復(fù)合物制備的最佳結(jié)晶溫度為60 ℃時(shí)，此時(shí)結(jié)晶度最大，為36.52%。

表3 不同結(jié)晶溫度下所得復(fù)合物結(jié)晶度和相關(guān)衍射數(shù)據(jù)

2.2 最佳制備條件下所得A淀粉的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 掃描電鏡分析（SEM）

圖4是馬鈴薯淀粉、B型微晶淀粉、空白對(duì)照組和直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物的掃描電子顯微鏡圖。圖4（a）顯示，馬鈴薯淀粉呈橢球狀和球狀結(jié)構(gòu)，似馬鈴薯外形，表面光滑，形狀大小不一，無黏連現(xiàn)象。馬鈴薯淀粉經(jīng)過酸解和重結(jié)晶后得到B型微晶淀粉，其顆粒球晶的尺寸相對(duì)均勻，直徑約為2 μm。晶粒之間有輕微的黏附，這是因?yàn)樗峤庵频玫奈⒕У矸郾砻婢w結(jié)構(gòu)不完整，解凍后部分晶粒之間發(fā)生融合。另外，由于溶液中冷凍和冰之間的擠壓作用，一些淀粉顆粒的形狀不平滑。圖4（c）顯示，空白對(duì)照組的淀粉樣品表面粗糙，部分晶體之間有一些的黏連，可能是因?yàn)樵诟稍镞^程中淀粉鏈在晶體表面沉積以及部分淀粉表面結(jié)晶不完整，從而發(fā)生了形變。從圖4（d）可以看出，直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物顯示出直徑約1 μm或更小的小球形結(jié)構(gòu)，并且表面相對(duì)光滑。

圖4 電子掃描顯微鏡

2.2.2 紅外光譜分析（FT-IR）

圖5分別是馬鈴薯淀粉、B型微晶淀粉和復(fù)合物的紅外光譜圖。從圖5可以看出，3種淀粉樣品有很多共同的紅外吸收峰，是淀粉基團(tuán)的紅外特征吸收峰。3 380 cm-1附近出現(xiàn)的強(qiáng)而寬的吸收峰為淀粉中—OH基團(tuán)的伸縮振動(dòng)吸收峰，2 928 cm-1附近出現(xiàn)了明顯的—CH2—的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 640 cm-1的峰是淀粉的醛基振動(dòng)峰，1 000～1 300 cm-1處的吸收峰為C—O—C鍵的伸縮振動(dòng)峰[13]。1 000 cm-1以下是指紋區(qū)，不代表官能團(tuán)。通過紅外光譜圖可以看出3種淀粉樣品的衍射峰位置并沒有發(fā)生明顯的變化，說明復(fù)合物中淀粉與色氨酸并沒有形成新的化學(xué)鍵。復(fù)合物的衍射峰強(qiáng)度和尖銳程度均較高，可能是由于色氨酸放大了復(fù)合物紅外散射的信號(hào)。

圖5 紅外光譜圖

2.2.3 熱重分析（TG）

分別對(duì)B型微晶淀粉和復(fù)合物進(jìn)行熱重分析，以研究淀粉樣品的熱穩(wěn)定性，圖6是B型微晶淀粉和復(fù)合物的TG和DTG圖譜。表4是對(duì)應(yīng)圖6的熱降解數(shù)值匯總。

圖6 TG和DTG圖

表4 B型微晶淀粉和復(fù)合物的熱降解數(shù)據(jù) 單位：℃

淀粉的分解過程有三個(gè)階段：第一個(gè)階段是自由水分的蒸發(fā)；第二個(gè)階段是樣品快速分解；第三個(gè)階段是樣品分解完全階段。從熱重分析圖中可知，當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃左右，B型微晶淀粉與復(fù)合物的外延起始溫度相同，當(dāng)溫度達(dá)到300 ℃左右，DTG圖顯示復(fù)合物在312.1 ℃達(dá)到峰值，此時(shí)的分解速率達(dá)到最大，這個(gè)階段主要涉及淀粉的分解。B型微晶淀粉在305.2 ℃達(dá)到峰值，與復(fù)合物相比，其峰值溫度較低，說明復(fù)合物可以提高淀粉的熱穩(wěn)定性。當(dāng)溫度超過350 ℃，淀粉樣品完全分解，B型微晶淀粉與復(fù)合物的剩余量基本一致。

2.2.4 拉曼光譜（RAMAN）

圖7為馬鈴薯淀粉、B型微晶淀粉和直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物的拉曼光譜圖與局部拉曼光譜圖。從中可以看出，馬鈴薯淀粉、B型微晶淀粉和直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物的拉曼光譜圖很相似，因?yàn)?個(gè)樣品都含有相同的化學(xué)鍵，即淀粉中特有的化學(xué)鍵。直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物的拉曼峰較弱，這是因?yàn)橹辨湹矸壑泻猩彼?，形成的?fù)合物更加無序，所以衍射峰的基線很高。與馬鈴薯淀粉和B型微晶淀粉相比，直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物在752.58 cm-1處有一個(gè)峰，此峰為色氨酸殘基的特征吸收峰[14]。說明色氨酸與淀粉發(fā)生了復(fù)合。

圖7 Raman圖譜

3 結(jié)論

在色氨酸的存在下，以B型微晶淀粉為原料，采用冷凝回流方式制備復(fù)合物，并對(duì)影響復(fù)合物相對(duì)結(jié)晶度的因素進(jìn)行研究。色氨酸存在下，制備復(fù)合物最佳結(jié)晶結(jié)構(gòu)制備條件：B型微晶淀粉/色氨酸比例8∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)39.39%、結(jié)晶溫度60 ℃。并對(duì)結(jié)晶結(jié)構(gòu)較好的樣品通過XRD、IR和SEM進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。SEM分析表明，B型微晶淀粉為球狀結(jié)構(gòu)，而復(fù)合物為無規(guī)則顆粒結(jié)構(gòu)。XRD測(cè)試結(jié)果顯示，冷凝回流法制成的樣品在15.19°，17.23°和23.00°左右處出現(xiàn)特征衍射峰，表明色氨酸存在下，B型微晶淀粉形成了明顯的A型結(jié)構(gòu)。IR分析表明，復(fù)合物中并沒有新的化學(xué)鍵形成。熱重分析顯示，復(fù)合物的熱穩(wěn)定性高于B型微晶淀粉。拉曼光譜顯示，直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物中有色氨酸的特征衍射峰，說明B型微晶淀粉與色氨酸形成了直鏈淀粉-色氨酸復(fù)合物。