14-3-3β對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因以及泌乳效應(yīng)的影響

黃冠，曹慧，符海鑫，張娜

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

0 引言

14-3-3蛋白作為一類適配蛋白，因其參與許多重要的細(xì)胞過程而在細(xì)胞生物學(xué)中占據(jù)重要地位[1]。越來越多的證據(jù)表明，14-3-3蛋白家族大多處于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐，在細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn)過程中扮演調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信息交換的重要角色[2]。14-3-3蛋白家族在哺乳動(dòng)物中共有7種亞型[3]，在進(jìn)化過程中極為保守[4]，主要分布在神經(jīng)組織中[5]，約占腦內(nèi)總蛋白含量3%，占可溶性總蛋白含量1%[6]。14-3-3蛋白參與許多細(xì)胞內(nèi)重要的生命活動(dòng)和發(fā)生過程，涉及細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)調(diào)控、離子通道功能和定位、細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)育等諸多生理病理過程[7]。eIF2α激酶是一個(gè)由7種特征明確的絲氨酸-蘇氨酸激酶組成的家族，即

PERK（PKR-like ER kinase）、PKR（protein kinase double-stranded RNA-dependent）、GCN 2（general control non-derepressible-2）和HRI（heme-regulated inhibitor）。它們?cè)趹?yīng)對(duì)感染、蛋白毒性和低水平必需營(yíng)養(yǎng)物（如氨基酸和血紅素）時(shí)發(fā)揮重要且通常是必需的功能[8]。eIF2α的磷酸化通過降低蛋白質(zhì)合成的總體速率來保護(hù)細(xì)胞，并使細(xì)胞的翻譯起始機(jī)制偏向于在應(yīng)激反應(yīng)中起作用基因的mRNA的翻譯[9-10]。由于這些原因，eIF2α磷酸化及隨后的信號(hào)傳導(dǎo)途徑被稱為“綜合應(yīng)激反應(yīng)（ISR，integrated stress response）”[10]。在泌乳生物學(xué)中，泌乳期奶牛乳腺會(huì)不間斷地大量合成蛋白質(zhì)以供給細(xì)胞正常運(yùn)行和乳汁的形成，由此產(chǎn)生大量的錯(cuò)誤折疊蛋白反應(yīng)在乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累而激活PERK引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過eIF2α的磷酸化，PERK阻止了新多肽的合成，從而減少了新生多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的過程[11]。14-3-3β參與奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和調(diào)控泌乳的詳細(xì)分子機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證14-3-3β抑制對(duì)乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵因子eIF2α和ATF4以及對(duì)泌乳效應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

DM EM/F12培養(yǎng)基粉末、I型膠原酶，美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine?2000 Reagent，美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清，以色列BI公司；脫脂乳粉，美國(guó)BD公司；14-3-3β抗體，美國(guó)BOSTER公司；p-eIF2α一抗、BCA蛋白濃度試劑盒、MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；β-酪蛋白抗體，美國(guó)SANTA公司；β-actin抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ATF4抗體，美國(guó)BOSTER公司；HRP辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、ECL發(fā)光檢測(cè)試劑，北京蘭杰柯科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，中國(guó)香港力康發(fā)展有限公司；生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；QuantStudio實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，美國(guó)Invitrogen公司；Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和純化

采用膠原酶消化法從泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺中分離并培養(yǎng)原代的乳腺上皮細(xì)胞。用15%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）以及Dulbecco’s modified Eagle’s medium-F12?培養(yǎng)基在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞并進(jìn)行純化。純化后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，觀察上皮細(xì)胞形態(tài)和免疫熒光檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞生物標(biāo)志物CK18的表達(dá)。

1.3.2 Western Blot

提取3個(gè)時(shí)期乳腺組織的蛋白樣品，BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定所提取蛋白樣品的濃度。采用Western Blot檢測(cè)各個(gè)時(shí)期的目標(biāo)蛋白表達(dá)水平，總蛋白裂解液在10%的SDS-PAGE電泳中分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜上。用5%脫脂乳封閉載有蛋白的NC膜，37℃封閉2 h。4℃環(huán)境下使用一抗過夜孵育NC膜?？贵w如下：14-3-3β，p-eIF2α（Ser51），β-casein，β-actin，ATF4。徹底漂洗NC膜，并使用HRP標(biāo)記的二抗在37°C條件下孵育1 h。ECL發(fā)光檢測(cè)試劑檢測(cè)目的蛋白條帶，并采用ImageJ?進(jìn)行灰度分析。

1.3.3 RNA干擾實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染siRNA于奶牛乳腺細(xì)胞中來敲除14-3-3β基因表達(dá)。正常培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合率，20μmol/L siRNA或陰性對(duì)照oligo（NC）用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后收集各組細(xì)胞樣品，用qRT-PCR確定最高干擾效率的siRNA。3個(gè)針對(duì)14-3-3βmRNA不同區(qū)域的siRNA，其中干擾效率最高的14-3-3βsiRNA序列如下：

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行cDNA的合成。反應(yīng)體系為20μL，并用兩步法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.3.5 甘油三酯檢測(cè)

甘油三酯試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

向96孔板每孔中接種大約1 000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)過夜并且恢復(fù)到正常狀態(tài)后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染以及加藥處理。后按照MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)收集的所有數(shù)據(jù)均來自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用R Language（version 4.0.2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性檢驗(yàn)。One Way ANOVA對(duì)組間均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，Tukey’s post-hoc-test分析各組平均值之間的差異。“*”表示P＜0.05，差異顯著；“**”表示P＜0.01，差異極顯著。P＜0.05或P＜0.01均被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育時(shí)期的奶牛乳腺14-3-3β，eIF2α和ATF4的mRNA表達(dá)水平差異檢測(cè)

采用qRT-PCR檢測(cè)青春期、泌乳期和退化期奶牛乳腺14-3-3β，eIF2α和ATF4的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖1所示，14-3-3β在青春期和退化期的mRNA表達(dá)水平基本一致，在泌乳期的表達(dá)水平最低；eIF2α在青春期和退化期的mRNA表達(dá)水平無明顯差異，在泌乳期的表達(dá)水平最低；ATF4在青春期的mRNA表達(dá)水平最高，而在泌乳期和退化期的表達(dá)水平無顯著差異。

圖1 不同發(fā)育時(shí)期14-3-3β，eIF2α和ATF4的mRNA表達(dá)水平

2.2 不同發(fā)育時(shí)期的奶牛乳腺14-3-3β，p-eIF2α和ATF4的蛋白表達(dá)水平差異檢測(cè)

采用Western Blot檢測(cè)青春期、泌乳期和退化期奶牛乳腺14-3-3β，p-eIF2α和ATF4的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示，14-3-3β在退化期的蛋白表達(dá)水平最高，在泌乳期的表達(dá)水平最低；p-eIF2α在青春期和退化期的蛋白表達(dá)水平基本一致，在泌乳期的表達(dá)水平最高。ATF4在青春期的蛋白表達(dá)水平最高，在退化期的表達(dá)水平最低。

圖2 不同發(fā)育時(shí)期14-3-3β，p-eIF2α和ATF4的蛋白表達(dá)水平

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)14-3-3β抑制對(duì)ER應(yīng)激相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平的影響

14-3-3β-siRNA轉(zhuǎn)染到奶牛乳腺上皮細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h，如圖3所示，qRT-PCR分析表明14-3-3β的mRNA表達(dá)水平明顯下降。添加TG（1 umol/L）于正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)果如圖4所示，在TG處理24 h之后，正常培養(yǎng)的細(xì)胞中eIF2α、ATF4、CHOP和Caspase-3的mRNA都有明顯的提高。在14-3-3β敲除后再添加TG處理的細(xì)胞中，eIF2α和ATF4的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步明顯增加，同時(shí)CHOP和Caspase-3的mRNA表達(dá)水平顯示為指數(shù)級(jí)激增。

圖3 RNAi處理24 h的14-3-3β的mRNA表達(dá)水平

圖4 TG處理正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除24 h后細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)14-3-3β抑制對(duì)酪蛋白的m RNA和蛋白表達(dá)水平的影響

14-3-3β-siRNA轉(zhuǎn)染到奶牛乳腺上皮細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h，添加TG（1 umol/L）于正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)果如圖5～6所示，在TG處理24 h之后，正常培養(yǎng)的細(xì)胞中β-casein的mRNA和蛋白表達(dá)水平都有明顯下調(diào)，在14-3-3β敲除后再添加TG處理的細(xì)胞中，β-casein的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低。

圖5 TG處理正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除24 h后細(xì)胞相關(guān)的mRNA表達(dá)水平

圖6 TG處理正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除24 h后β-酪蛋白的蛋白表達(dá)水平

2.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)14-3-3β抑制對(duì)BMECs乳脂的影響

如圖7所示，甘油三酯檢測(cè)結(jié)果表明，在TG處理24 h之后，正常培養(yǎng)的細(xì)胞中甘油三酯的含量有明顯下降，在14-3-3β敲除后再添加TG處理的細(xì)胞中，甘油三酯的含量進(jìn)一步降低。

圖7 TG處理正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除24 h后甘油三酯含量的變化

2.6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)14-3-3β抑制對(duì)BMECs細(xì)胞增殖的影響

如圖8所示，MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，在TG處理24 h之后，正常培養(yǎng)的細(xì)胞增殖率顯著降低，在14-3-3β敲除后再添加TG處理的細(xì)胞中，細(xì)胞增殖率進(jìn)一步降低。

圖8 TG處理正常培養(yǎng)和14-3-3β敲除24 h后的細(xì)胞增殖狀態(tài)

3 討論

14-3-3蛋白通過調(diào)節(jié)各種結(jié)合分子的功能，已成為許多重要細(xì)胞過程如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白合成、蛋白折疊和降解、細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞運(yùn)輸、DNA復(fù)制、凋亡和生存等關(guān)鍵調(diào)控的組分[12]。以往的研究中，14-3-3家族的其他成員如14-3-3γ，與奶牛泌乳調(diào)控和細(xì)胞增殖中正向調(diào)控效應(yīng)相關(guān)聯(lián)[13-15]，14-3-3ζ與神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能有關(guān)，14-3-3ζ的下調(diào)引起ER應(yīng)激并增加對(duì)興奮性毒性損傷的脆弱性[16]。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)泌乳期的奶牛乳腺組織14-3-3β和p-eIF2α呈顯著的負(fù)相關(guān)，提示泌乳期14-3-3β與應(yīng)激有關(guān)的翻譯起始因子2α可能有某種關(guān)聯(lián)。泌乳期的奶牛需要合成大量的蛋白質(zhì)，mRNA的翻譯過程的動(dòng)態(tài)平衡是保證細(xì)胞正常合成蛋白必需的。翻譯起始是整個(gè)蛋白質(zhì)合成過程的限速步驟，而eIF2α是翻譯起始的重要蛋白[17]。細(xì)胞為存活而出現(xiàn)了一種高度保守的應(yīng)激誘導(dǎo)途徑—綜合應(yīng)激反應(yīng)[18]，當(dāng)外部環(huán)境條件對(duì)細(xì)胞適應(yīng)性有害時(shí)，ISR通過停止整體翻譯來維持細(xì)胞穩(wěn)定。ISR能夠感知獨(dú)特的應(yīng)激源并磷酸化eIF2α，從而減弱m RNA 5’端帽狀結(jié)構(gòu)依賴的翻譯[19]。以ER應(yīng)激為實(shí)驗(yàn)背景，奶牛乳腺上皮細(xì)胞在14-3-3β敲除后對(duì)TG誘導(dǎo)的ER應(yīng)激反應(yīng)更為敏感，表現(xiàn)為eIF2α和ATF4的mRNA激增，而CHOP和Caspase-3的mRNA迅速增加與先前的14-3-3β敲除研究結(jié)果一致[20]。在TG的作用下，14-3-3β基因敲除誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的形態(tài)學(xué)改變，并進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+外流[21]。14-3-3β蛋白作為接頭蛋白和伴侶的活性在上述條件下可能起重要作用。當(dāng)敲除14-3-3β基因時(shí)，細(xì)胞中eIF2α磷酸化水平進(jìn)一步升高，ER應(yīng)激持續(xù)存在，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯持續(xù)關(guān)閉，eIF2α下游的ATF4激活不同的轉(zhuǎn)錄程序，以恢復(fù)內(nèi)在平衡重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[22-23]，或者在慢性壓力下，協(xié)同CHOP來激活Caspase家族并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。而eIF2α磷酸化狀態(tài)的持續(xù)時(shí)間和水平以及平行時(shí)間里激活的其他信號(hào)通路將決定eIF2α的磷酸化最終是促進(jìn)死亡還是促進(jìn)生存[25-26]。乳蛋白分泌特性的高低是衡量乳品質(zhì)優(yōu)良的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)顯示出在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，14-3-3β敲除進(jìn)一步下調(diào)了β-酪蛋白的mRNA和蛋白雙重水平的表達(dá)，并減少了乳脂的分泌，同時(shí)減緩了細(xì)胞增殖，提示14-3-3β能夠正向調(diào)控泌乳效應(yīng)，對(duì)于維持細(xì)胞增殖狀態(tài)，乳蛋白和乳脂的表達(dá)是有必要的。

綜上所述，14-3-3β能夠正向調(diào)控泌乳，并參與ER應(yīng)激關(guān)鍵因子eIF2α和ATF4的調(diào)控。找到精準(zhǔn)改良乳品質(zhì)的方法是必要的，不可否認(rèn)14-3-3蛋白作為候選靶標(biāo)具有廣闊的前景，然而這一過程有關(guān)的分子機(jī)制還有待深入研究。