基于糞便樣本的野生犬科動物物種鑒別與棘球絳蟲感染調(diào)查

尚婧曄，張光葭，丹巴澤里，王 奇，喻文杰，何 偉，廖 沙，沈蕓舟，黃 燕*，王 謙，鐘 波，劉 陽*

(1.四川省疾病預(yù)防控制中心，成都 610041；2.甘孜藏族自治州州疾病預(yù)防控制中心，康定 626099；3.涼山彝族自治州疾病預(yù)防控制中心，西昌 615000)

犬科動物是棘球絳蟲的主要終末宿主和傳染源。了解犬科動物感染蟲種及其感染水平，可以明確不同終末宿主在棘球蚴病傳播中所起作用和風(fēng)險程度，為棘球絳蟲終末宿主的防控提供重要的策略依據(jù)。由于樣本獲取困難、檢測方法有限，長期以來，包括流浪犬在內(nèi)的棘球絳蟲野外終宿主感染水平的調(diào)查始終是一個棘手的問題。出于對野生動物保護(hù)和食肉動物危險性的考慮，早期采用的捕殺剖檢或藥物導(dǎo)泄收集蟲體的方法已經(jīng)不再適用。非損傷性采樣的糞樣檢測是目前最具有操作性的方法。與家犬不同，野外動物糞樣為野外撿拾，來源并不明確。不同動物糞便雖然具有一定的外觀形態(tài)特征，但單憑眼觀鑒別其來源，仍可能出現(xiàn)偏差。簡單進(jìn)行病原檢測而不對樣本來源進(jìn)行準(zhǔn)確辨識，很可能會因?yàn)榧{入其他非目標(biāo)宿主樣本而造成檢測陽性率遠(yuǎn)低于實(shí)際感染率，或掩蓋單一宿主的高感染率，難以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行樣本的溯源極為重要。

目前，國內(nèi)棘球絳蟲終末宿主種類分子鑒別的研究不多，且主要集中于單一屬內(nèi)物種的鑒別[1-2]。線粒體DNA(mtDNA)因具有多拷貝、變異快、缺乏重組、分子量小等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種動、植物的分子鑒定和分類，已證實(shí)對多種哺乳動物具有良好的區(qū)分效果[3-6]。本研究以采集自棘球絳蟲高流行區(qū)野外環(huán)境中的犬科動物糞便為樣本，以mtDNA控制區(qū)(D-loop)基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，對不同犬科動物同源序列進(jìn)行比對分析，探索mtDNA D-loop高變區(qū)序列用于棘球絳蟲主要終末宿主鑒別的可能性，同時，通過糞-抗原檢測，對樣本棘球絳蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本研究檢測糞樣101份，于2016年采集自甘孜州石渠縣真達(dá)、呷依、格孟3鄉(xiāng)的野外環(huán)境，包括居民定居點(diǎn)周圍和狐貍、狼等棘球絳蟲野外終末宿主洞穴口及經(jīng)常出沒的區(qū)域。根據(jù)糞樣外觀形態(tài)和采集地點(diǎn)，對糞樣來源宿主種類進(jìn)行初步鑒定，將采集的樣本分為3組：1)疑似狼糞樣32份，主要采自狼洞口和高山、半高山牛、羊、藏原羚等大型哺乳動物活動較多的地方，糞便較粗長，顏色泛白，帶有少量動物長毛發(fā)和較多、較大的動物骨頭；2)疑似狐糞樣30份，主要采自狐洞口和半高山、沿河高原草甸高原鼠兔、青海田鼠等小型哺乳動物活動頻繁的地區(qū)，糞便較細(xì)長，呈灰黑色，帶有較多動物短毛發(fā)；3)疑似犬糞樣本39份，主要采自定居點(diǎn)周邊高原鼠兔、青海田鼠等小型哺乳動物活動較多的地區(qū)，糞便粗細(xì)、長短多介于狼和狐之間，呈棕黑或灰黑色，帶有動物短毛發(fā)。

所有樣本于-80 ℃冷凍保存1個月以上，以滅活蟲卵。

1.2 主要試劑和儀器

主要使用試劑包括QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen,Germany)，GoTaq G2 Hot Start Master Mixes(Promega,USA)，犬糞包蟲抗原檢測試劑盒(深圳市康百得生物科技有限公司，中國)。主要使用儀器包括AB2720 PCR儀(Applied Biosystems，USA)，電泳儀(BioRad，USA)，凝膠成像儀(BioRad，USA)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，中國)。

1.3 基因組DNA提取

參考文獻(xiàn)[1]方法對糞樣中可能存在的宿主腸道脫落組織、細(xì)胞碎片等進(jìn)行富集處理后，按照糞便DNA提取試劑盒操作說明提取糞樣基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 宿主物種鑒別

1.4.1 PCR擴(kuò)增和測序 參考文獻(xiàn)[7]合成用以擴(kuò)增哺乳動物mtDNA D-loop區(qū)的通用引物L(fēng)15995：5′ -CTCCACTATCAGCACCCAAAG-3′，H16498：5′-CCTGAAGTAAGAACCAGATG-3′。PCR反應(yīng)體積為25 μL，包含1×GoTaq G2 Hot Start Master Mixes，上下游引物0.4 μmol·L-1，DNA模板20～50 ng。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行雙向測序。

1.4.2 序列分析 所獲序列經(jīng)DNAStar軟件進(jìn)行自動雙向拼接并加以適當(dāng)手動調(diào)整后，采用ClustalX2軟件[8]進(jìn)行多重比對。使用DnaSP5軟件[9]分析序列單倍型與變異位點(diǎn)。將單倍型序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表物種序列進(jìn)行BLAST比對。利用MEGA7軟件[10]計(jì)算基于Kimura-2-parameter模型(K2P)的遺傳距離，同時以小家鼠(Musmusculus)為外群，采用最大似然法(Maximum Likehood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 棘球絳蟲抗原檢測

1.5.1 糞-抗原檢測 糞樣經(jīng)適當(dāng)搗碎處理后，按照犬糞包蟲抗原檢測試劑盒操作說明，采用ELISA夾心法對糞樣中棘球絳蟲抗原進(jìn)行檢測。

1.5.2 數(shù)據(jù)處理 采用EXCEL軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用χ2檢驗(yàn)對不同來源樣本棘球絳蟲抗原陽性率差異進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 宿主物種鑒別

2.1.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 提取的101份糞樣DNA中有74份擴(kuò)增出目的條帶，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示在350～400 bp出現(xiàn)清晰的單一條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物可用于后續(xù)測序分析，樣本檢測成功率為73.27%(圖1)。

2.1.2 序列變異與單倍型分析 所獲74條序列經(jīng)比對、剪切后，最終整理為297 bp的同源序列(GenBank登錄號：MZ189011～MZ189084)，定義單倍型20個，根據(jù)序列堿基差異大小，分為4個單倍型集合，其中單倍型H1～H6核苷酸變異位點(diǎn)13個，6個單倍型間堿基差異為1～10個；單倍型H7～H10核苷酸變異位點(diǎn)5個，4個單倍型間堿基差異為1～5個；單倍型H11～H15核苷酸變異位點(diǎn)11個，5個單倍型間堿基差異為1～8個；單倍型H16～H20核苷酸變異位點(diǎn)5個，5個單倍型間堿基差異為2～5個(表1、2)。單倍型集間，以單倍型H1～H6與H7～H10堿基差異最小，平均為17.83，其次為單倍型H11～H15與H16～H20，平均堿基差異為38.64，單倍型H1～H6、H7～H10與單倍型H11～H15、H16～H20間堿基差異較大，平均為64.85～70.10。

表1 單倍型H1～H10線粒體控制區(qū)基因變異位點(diǎn)Table 1 Mutation sites in the mtDNA control region of H1-H10

2.1.3 序列相似度比對 經(jīng)Blast比對，所有單倍型序列均與GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的單一物種同源序列高度相似，對比結(jié)果分別為犬(Canislupusfamiliaris)、灰狼(Canislupus)、紅狐(Vulpesvulpes)和藏狐(Vulpesferrilata)4種犬科動物(表3)。

表3 單倍型序列BLAST比對結(jié)果Table 3 BLAST results of the haplotype sequences

1～9.檢測的糞便樣本；M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；N.無模板對照1-9.Fecal samples detected in the study;M.DL5000 DNA molecular weight markers;N.No template control圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of the PCR amplification

表2 H11～H20線粒體控制區(qū)基因變異位點(diǎn)Table 2 Mutation sites in the mtDNA control region of H11-H20

2.1.4 遺傳距離分析 基于K2P模型的遺傳距離分析結(jié)果顯示，20個單倍型之間遺傳距離為0.004～0.354。4個單倍型集間遺傳距離遠(yuǎn)大于各集合內(nèi)單倍型間遺傳距離；單倍型H1～H6與H7～H10、單倍型H11～H15與H16～H20間遺傳距離較與其他單倍型集間遺傳距離??；單倍型H1～H6、H7～H10、H11～H15、H16～H20分別與犬、灰狼、赤狐和藏狐遺傳關(guān)系最近(表4)。

表4 基于K2P模型的平均遺傳距離Table 4 Average genetic distance based on the K2P model

2.1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹表現(xiàn)出明顯的聚類現(xiàn)象，所有單倍型分為兩大支，其中單倍型H7～H10與灰狼參考序列(KT901460)聚集在一起，并與單倍型H1～H6及犬參考序列(JN695048)共處同一大分支；另一大分支是由單倍型H11～H15與赤狐參考序列(KJ846513)，以及單倍型H16～H20與藏狐參考序列(JF520840)各自聚集成簇后再形成的一個大支(圖2)。

2.2 棘球絳蟲感染檢測

經(jīng)棘球絳蟲糞-抗原ELISA檢測共發(fā)現(xiàn)陽性樣本11份，陽性率為10.89%(11/101)(表5)。

小于75%的自展值未予顯示Bootstrap values below 75% were not shown圖2 基于線粒體控制區(qū)基因序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 ML tree based on mtDNA control region sequences

表5 棘球絳蟲糞-抗原ELISA檢測結(jié)果Table 5 The results of copro-antigen ELISA tests for detection of Echinococcus

3 討 論

棘球絳蟲終末宿主感染調(diào)查是棘球蚴病監(jiān)測的重點(diǎn)，也是防控的難點(diǎn)和薄弱點(diǎn)。糞便作為非損傷性采集樣本，可同時用于來源宿主的物種鑒定和棘球絳蟲的感染檢測，對棘球絳蟲終末宿主，尤其是野生終末宿主的調(diào)查研究具有重要意義。近年來的研究報道中所涉及的野外犬科動物感染調(diào)查均選擇以糞便為樣本，在檢測其內(nèi)棘球絳蟲特異性抗原或核酸的同時，根據(jù)糞樣外形特征來推測其宿主來源[11-12]。本次研究結(jié)果證實(shí)，以糞樣形態(tài)特點(diǎn)和采樣環(huán)境來判斷樣本來源動物種類具有一定可行性，但也存在一定的誤差，尤其是犬糞，誤辨率較高。另外，由于眼觀鑒別嚴(yán)重依賴現(xiàn)場人員個人經(jīng)驗(yàn)，也極大地限制了該方法的推廣應(yīng)用。本次檢測的101份糞樣中，74份通過糞樣DNA擴(kuò)增、測序和分析，成功實(shí)現(xiàn)對其來源的4種犬科動物的鑒別，結(jié)果表明，分子檢測可有效鑒定糞便樣本來源動物種類，作為形態(tài)判別的修正依據(jù)，有效提升鑒定準(zhǔn)確率。另一方面，研究結(jié)果也反映出糞樣檢測的不足，與血液、組織等樣本相比，糞便樣本檢測成功率一般相對較低。本次用于檢測的糞樣為野外撿拾，部分樣本可能因?yàn)槠芈稌r間過長，受到高原陽光爆嗮或雨水沖刷，造成糞樣被某些有抑制作用的成分污染，或其內(nèi)含有的宿主核酸降解，而未能成功擴(kuò)增。研究結(jié)果提示，要進(jìn)一步提升樣本檢出率，應(yīng)盡量采集新鮮糞便用于分子檢測，同時，探索更為有效的目的成分富集前處理方法。

mtDNA目前被廣泛應(yīng)用于物種鑒定、遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生等研究，以cox1、細(xì)胞色素b(cytb)等編碼基因?yàn)榇淼腄NA條形碼技術(shù)在嚙齒類、魚類、鳥類等動物識別與分類研究中均取得了較為理想的結(jié)果[13-15]。然而，由于受到選擇壓力的影響，這些編碼基因通常無法有效區(qū)分親緣關(guān)系較近的物種，相較之下，作為mtDNA中唯一的非編碼區(qū)域，D-loop區(qū)因?yàn)槿狈x擇壓力，變異速度較編碼區(qū)基因更快，被認(rèn)為對近緣和近期分化的物種具有更好的分辨能力[7]。本研究對成功擴(kuò)增獲得的74份mtDNA D-loop區(qū)基因片段進(jìn)行了分析，同源序列比對結(jié)果顯示，檢測序列可與GenBank中單一物種序列相匹配，多態(tài)性位點(diǎn)差異與遺傳距離分析結(jié)果與BLAST比對結(jié)果一致，所鑒定的物種間距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)距離，滿足物種鑒定的判別條件，系統(tǒng)發(fā)育發(fā)育樹中，鑒別為同一物種的不同單倍型以高自展值進(jìn)行聚類，支持其鑒別結(jié)果，綜合各項(xiàng)分析結(jié)果，可判斷糞樣來源分別為犬、灰狼、赤狐和藏狐4種犬科動物。研究表明，以mtDNA D-loop區(qū)序列分析作為犬科動物糞樣不同物種來源的鑒定依據(jù)具有可行性，該方法對包括狼及其近緣馴化種犬在內(nèi)的棘球絳蟲主要終末宿主均具有較好的辨識能力。

盡管基于mtDNAD-loop區(qū)對犬科動物的鑒別具有快捷、高效、簡易等優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在一定的局限性。由于線粒體基因母系遺傳的特點(diǎn)，基于mtDNA的分析無法識別自然界中可能偶爾發(fā)生的雜交事件，對沒有生殖隔離的物種間自然交配產(chǎn)生的雜交及其回交子代個體的鑒別存在一定缺陷[16-17]。因此，為進(jìn)一步提高鑒別的準(zhǔn)確度，在對mtDNA D-loop區(qū)堿基序列進(jìn)行分析比較的同時，可結(jié)合常染色體基因的雙親遺傳或Y染色體基因的父系遺傳分子標(biāo)記對物種進(jìn)行鑒別[18-20]。此外，采用微衛(wèi)星標(biāo)記對物種個體進(jìn)行識別分析，可進(jìn)一步排除可能存在的來源于同一宿主的重復(fù)樣本，實(shí)現(xiàn)對棘球絳蟲終末宿主的精準(zhǔn)識別，為棘球絳蟲終末宿主防控提供更為系統(tǒng)、全面的數(shù)據(jù)支撐。

家犬作為牧區(qū)重要的生產(chǎn)工具和人類的親密伙伴，與其相關(guān)的因素，如家庭是否養(yǎng)犬、犬只數(shù)量、是否與犬親密接觸等，被認(rèn)為是我國棘球蚴病流行區(qū)、尤其是青藏高原地區(qū)棘球絳蟲傳播最重要的風(fēng)險因素[21-23]，但自2006年我國棘球蚴病防治項(xiàng)目實(shí)施以來，經(jīng)過近15年以家犬驅(qū)蟲為主的綜合防控，目前各流行區(qū)家犬棘球絳蟲感染率均已出現(xiàn)明顯下降，并維持于較低水平[24-26]。與此同時，流浪犬(無主犬)因其數(shù)量多、流動性大等特點(diǎn)，干預(yù)十分困難，其感染控制成效極為有限[27-28]，類似地，作為棘球絳蟲的保蟲宿主，狼、狐貍等野生犬科動物感染率也遠(yuǎn)高于家犬[1,11]。本次對糞樣棘球絳蟲抗原檢測結(jié)果顯示，調(diào)查地區(qū)野外犬科動物具有較高的棘球絳蟲抗原陽性率，但相較于此前采用不同檢測方法對該地區(qū)野生犬科動物棘球絳蟲感染情況的調(diào)查結(jié)果，感染率有所下降，這可能是由于各研究項(xiàng)目調(diào)查時間、調(diào)查方法、樣本代表性，以及所涉及宿主種類等的不同而導(dǎo)致[29-31]。由于現(xiàn)有針對野外犬科動物棘球絳蟲感染情況的研究嚴(yán)重不足，依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)難以對當(dāng)?shù)匾巴馊苿游锛蚪{蟲感染水平作出全面的有效推斷，但可以明確的是，在家犬棘球絳蟲感染率得到有效控制的情況下，包括流浪犬在內(nèi)的野外犬科動物所具有的高感染率可能對流行區(qū)棘球絳蟲的傳播起到更大的作用，由其引起人群感染的危害不應(yīng)被忽視。強(qiáng)化宿主物種鑒別與個體鑒定、病原分子檢測等關(guān)鍵技術(shù)，開展野外犬科動物棘球絳蟲感染水平監(jiān)測，有針對性地提出對野外犬科動物的防控措施，將有助棘球蚴病下一步防控目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。

4 結(jié) 論

通過mtDNA D-loop區(qū)序列分析對野外犬科動物糞便的物種鑒別結(jié)果顯示，成功確定檢測的糞樣分別來自犬、灰狼、赤狐和藏狐4種犬科動物，同時，基于棘球絳蟲糞抗原的檢測發(fā)現(xiàn)，樣本來源個體具有較高的棘球絳蟲感染率。研究結(jié)果可為進(jìn)一步提升棘球絳蟲野外終末宿主精準(zhǔn)監(jiān)測質(zhì)量提供技術(shù)依據(jù)，作為調(diào)查地區(qū)野生犬科動物棘球絳蟲感染數(shù)據(jù)的更新和補(bǔ)充，為當(dāng)?shù)亻_展棘球絳蟲防控提供數(shù)據(jù)參考。