OPN5對鴨顆粒細(xì)胞凋亡、增殖及類固醇激素生成的影響

劉付穗，潘建秋，江丹莉，沈 栩，許丹寧，田允波*，黃運茂*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣州 510225)

OPN5是2003年首次在哺乳動物神經(jīng)組織中被發(fā)現(xiàn)的一種新型G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)[1-2]，主要在視網(wǎng)膜、下丘腦室旁器(paraventricular organ,PVO)和性腺中表達(dá)[3-4]。OPN5是鳥類主要的深腦光感受器(deep-brain photoreceptors,DBPs)之一[2]，參與調(diào)控鳥類的繁殖功能[5]。目前發(fā)現(xiàn)的DBPs主要有3種，包括黑視蛋白(melanopsin，OPN4)、神經(jīng)視蛋白(OPN5)、脊椎古視蛋白(vertebra ancient opsin，VAOpn)[6-7]。OPN5是一種對短波長敏感的光色素，吸收波長為360～474 nm，被認(rèn)為可感受紫外光的絲氨酸蛋白酶，能夠介導(dǎo)光信號傳導(dǎo)[3]。研究表明，OPN5可通過下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPGA)作用調(diào)控鳥類繁殖，其中TSH通路發(fā)揮著重要介導(dǎo)作用[8-9]。在長日照繁殖型的揚州鵝中，當(dāng)OPN5表達(dá)升高，鵝產(chǎn)蛋率上升[8]；在非季節(jié)性繁殖動物中，當(dāng)OPN5表達(dá)量上升，原雞的睪丸重量升高[2]。目前對OPN5調(diào)控繁殖的研究主要集中在下丘腦-垂體層面，而關(guān)于OPN5在性腺層面直接調(diào)控禽(鳥)類卵泡發(fā)育的研究鮮有報道。在鳥類卵泡發(fā)育過程中，顆粒細(xì)胞發(fā)揮重要作用[10]，顆粒細(xì)胞的凋亡和增殖直接決定卵泡的發(fā)育及成熟[11-14]。研究表明，Caspase和BC1兩大基因家族對細(xì)胞凋亡有著重要影響，包括凋亡基因Bax、BAK1、Caspase3及凋亡抑制基因BCl2、BCl6等[12-13]，細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、CDC20、CDK1等則對細(xì)胞增殖發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[14]。在卵泡發(fā)育過程中，垂體FSH和LH通過與其顆粒細(xì)胞上的受體FHSR和LHR結(jié)合，激活類固醇激素生成通路，生成雌二醇和孕酮等類固醇激素，進(jìn)而影響卵泡發(fā)育、成熟及排卵[10]。也有研究表明，顆粒細(xì)胞表達(dá)GnRH、GnIH及其受體GnRHR、GnIHR，提示GnRH和GnIH能直接對性腺發(fā)揮調(diào)控作用[15-16]。本課題組前期研究表明，繁殖期顆粒細(xì)胞表達(dá)高水平OPN5，但對顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡和類固醇激素生成有何影響尚不清楚。

本試驗通過在體外培養(yǎng)的鴨顆粒細(xì)胞中過表達(dá)或干擾OPN5，從正反兩面來研究OPN5對顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及類固醇激素生成的影響，以期揭示OPN5通過顆粒細(xì)胞對卵泡發(fā)育的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及材料

本試驗所用顆粒細(xì)胞為180日齡健康山麻鴨等級卵泡顆粒層分離所得。分離鴨顆粒細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%，分別進(jìn)行OPN5過表達(dá)和干擾試驗，均用Lipofectamine 3000試劑(Life Technologies)進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(n=6)。在OPN5過表達(dá)試驗中，過表達(dá)組(pEGFP-OPN5組)轉(zhuǎn)染濃度為1 μg·孔-1pEGFP-OPN5(1.1 kb)重組過表達(dá)質(zhì)粒，空載體組(pcDNA3.1組)轉(zhuǎn)染濃度為1 μg·孔-1pcDNA3.1(6.1 kb)空載體，空白對照組(NC組)僅添加轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000+P3000。在OPN5干擾試驗中，干擾組(siRNA-OPN5組)轉(zhuǎn)染5 μL濃度為20 μmoL·L-1的siRNA -OPN5，干擾對照組(siRNA組)轉(zhuǎn)染5 μL濃度為20 μmoL·L-1siRNA，空白對照組(NC組)僅添加等量的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000。處理72 h后，檢測并比較過表達(dá)和干擾OPN5表達(dá)對顆粒細(xì)胞凋亡、增殖、相關(guān)基因表達(dá)和蛋白表達(dá)以及細(xì)胞生殖激素水平的影響。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒購于TaKaRa；PowerUPTMSYBRTMGreen Master Mix購于Applied Biosystems；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于Beyotime；EdU細(xì)胞增殖檢測(成相檢測)購于RIBOBIO；anti-OPN5 rabbit購于BBI Life Sciences；Anti-GAPDH antibody ab181602、Anti-Aromatase antibody ab18995購于Abcam；3β-HSD antibody、FITC-goat anti-rabbit IgG購于Affinity Biosciences；Lipofectamine 3000購于Life Technologies；Omega-EndoFree Plasmid Mini KitⅡ購于Omega；Duck E2 ELISA KIT購于CUSABIO；Duck P4/Human INHBELISA KIT購于Elabscience；pEGFP-OPN5(根據(jù)XM_021267766.3序列合成質(zhì)粒)由華大基因科技有限公司合成；pcDNA3.1(貨號：VT9013)購于優(yōu)寶生物；siRNA-OPN5(根據(jù)XM_021267766.3序列設(shè)計的siRNA，其中sense：GCAUCAGAUCACAACG-CUUTT；antisense：AAGCGUUGUGAUCUGAU-GCTT)和siRNA -NC(sense：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；antisense：ACGUGACACGUUC-GGAGAATT)由上海生工生物工程股份有限公司合成。

主要儀器：全波長酶標(biāo)儀Multiskan GO購于Thermo；恒溫CO2培養(yǎng)箱購于Thermo；QuantStudio 7 Flex型實時熒光定量儀購于Applied Biosystems；倒置熒光顯微鏡購于Olympus；Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像儀購于上海天能生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鴨顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 選取50只180日齡、體重1.5～2 kg健康山麻鴨蛋鴨，按動物福利原則處死后，采集等級卵泡F1、F2放入裝有2%雙抗的PBS燒杯中，分離顆粒層放入15 mL離心管；顆粒細(xì)胞加入5 mL培養(yǎng)基(無血清)，用巴氏吸管反復(fù)吹打1 min，500～600 r·min-1離心2～3 min，向離心管內(nèi)加入5 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶，重懸沉淀，置于37 ℃恒溫水浴鍋中消化15～20 min，每5 min震蕩1次。消化結(jié)束，加入5 mL M199完全培養(yǎng)基(含10%血清)終止消化，隨后用70 μm細(xì)胞篩過濾，收集濾液，1 000 r·min-1離心5 min。M199洗滌沉淀1次，室溫1 000 r·min-1離心5 min；棄上清后加2～3 mL培養(yǎng)液吹打、重懸，每孔接5×105個細(xì)胞于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于39 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)70%，開始試驗處理。

1.3.2 細(xì)胞凋亡與增殖水平的檢測 試驗采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒與Annexin V-APC/7AAD Apoptosis Detection Kit試劑盒對顆粒細(xì)胞的凋亡進(jìn)行檢測。采用試劑盒Cell-LightTMEdU Apollo 488 In Vitro Kit對顆粒細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。具體操作按照使用說明書進(jìn)行，對每個處理組進(jìn)行6次重復(fù)，使用3張圖片計算凋亡與增殖細(xì)胞比例。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中生殖激素測定 細(xì)胞培養(yǎng)液中雌激素、孕酮與抑制素β的測定方法按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 基因表達(dá)水平檢測 采用TRIzol傳統(tǒng)方法提取組織RNA，并用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA，采用實時定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)定量測定顆粒細(xì)胞中OPN5、TSHβ、FSHR、LHR、GnRHR、GnIHR、GnRH、GnIH、StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1、Bax、BCl2、BCl6、BAK1、Caspase3、CDC20、CDK1、CyclinD1的mRNA表達(dá)水平。根據(jù)NCBI上參考序列，利用 Primer 5.0設(shè)計以上基因的熒光定量引物和內(nèi)參β-actin基因引物(表1)，送由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA為模板，配制10 μL反應(yīng)體系：Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.1 μL，ddH2O 3.8 μL，cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件設(shè)定：50 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 10 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，退火溫度退火 1 min，40個循環(huán)。每個樣品3個 重復(fù)，用β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。結(jié)果采用相對模板量算法(ΔΔCt法)處理，基因相對表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR primers

1.3.5 蛋白表達(dá)水平檢測 提取顆粒細(xì)胞的總蛋白，用BCA測定總蛋白濃度，SDS變性后，將蛋白上樣于10%的SDS-PAGE膠，電泳80 V 15 min，120 V 60 min。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜200 mA 40 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗5次，每次3 min。二抗室溫孵育1 h，TBST洗5次，每次3 min。ECL試劑盒顯色，將膜置于化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行曝光，拍照并保存。采用Image J軟件對Western blot蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05視為具有顯著性差異，P<0.01視為具有極顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 過表達(dá)或干擾OPN5載體在顆粒細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率

對顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)OPN5載體，結(jié)果顯示(圖1A)，轉(zhuǎn)染48和72 h后，OPN5表達(dá)量較對照組升高分別極顯著升高32.0和126.8倍(P<0.01)，其中轉(zhuǎn)染72 h后表達(dá)更高。對顆粒細(xì)胞進(jìn)行OPN5干擾處理，結(jié)果顯示(圖1B)，轉(zhuǎn)染48 h，siRNA-OPN5處理組OPN5表達(dá)量相對于對照組siRNA-NC有所下降，但未達(dá)顯著水平(P>0.05)；轉(zhuǎn)染72 h，siRNA-OPN5處理組的OPN5表達(dá)量則極顯著低于對照組siRNA-NC(P<0.01)；轉(zhuǎn)染48和72 h的干擾效率分別為24%和45%。據(jù)此，后續(xù)過表達(dá)或干擾OPN5的處理均采用轉(zhuǎn)染72 h。

A.基因相對表達(dá)量均按pcDNA3.1=1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理；B.基因相對表達(dá)量均按siRNA-NC=1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理。下同A.Relative gene expressions were homogenized according to the criteria of "pcDNA3.1=1";B.Relative gene expressions were homogenized according to the criteria of "siRNA-NC=1".The same as below圖1 不同處理時間過表達(dá)或干擾OPN5對顆粒細(xì)胞OPN5轉(zhuǎn)染效率的影響Fig.1 Effect of overexpression or interference of OPN5 on the transfection efficiency of OPN5 in granulosa cells at different treatment time

2.2 過表達(dá)或干擾OPN5對顆粒細(xì)胞凋亡的影響

在AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測中(圖2A)，僅綠色熒光染色的為凋亡細(xì)胞，綠色和紅色熒光雙染的為壞死細(xì)胞，未熒光染色的為正常細(xì)胞，結(jié)果顯示，過表達(dá)和干擾OPN5均明顯影響顆粒細(xì)胞的凋亡。流式細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示(圖2B、2C和2D)，與對照組相比，過表達(dá)OPN5顯著降低顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)(P<0.05)，干擾OPN5則顯著升高顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)(P<0.05)。AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果與流式細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果一致，表明OPN5能抑制顆粒細(xì)胞的凋亡。

A.AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果(100×)；B.顆粒細(xì)胞流式細(xì)胞凋亡檢測圖；C、D.流式細(xì)胞凋亡結(jié)果的統(tǒng)計。*.P<0.05，下同A.Results of AnnexinV-FITC apoptosis assay (100×);B.Flow-through apoptosis assay graph of granulocytes;C,D.Statistics of flow-through apoptosis results.*.P<0.05,the same as below圖2 OPN5對顆粒細(xì)胞凋亡水平的影響Fig.2 The effect of OPN5 on granulosa cells apoptosis level

2.3 過表達(dá)或干擾OPN5對顆粒細(xì)胞增殖的影響

對顆粒細(xì)胞增殖情況進(jìn)行EdU檢測。結(jié)果顯示(圖3)，在過表達(dá)試驗中，相比pcDNA3.1和NC組，pEGFP-OPN5組的EdU陽性率極顯著升高(P<0.01)，表明過表達(dá)OPN5極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，pcDNA3.1和NC組兩對照組間則差異不顯著。在干擾試驗中，相比于siRNA-NC和NC組，siRNA-OPN5組的EdU陽性率極顯著下降(P<0.01)，表明干擾OPN5表達(dá)使細(xì)胞增殖明顯受到抑制，siRNA-NC和NC組間則無明顯差異。

A、B.顆粒細(xì)胞EdU檢測結(jié)果(100×)，EdU(紅色)熒光表明細(xì)胞增殖，DAPI(藍(lán)色)熒光表示細(xì)胞核；C、D.EdU染色細(xì)胞比例。**.P<0.01，下同A,B.Granulocyte EdU assay results (100×),EdU (red)fluorescence indicates cell proliferation,DAPI (blue)fluorescence indicates nucleus;C,D.Proportion of EdU-stained cells.**.P<0.01,the same as below圖3 OPN5對顆粒細(xì)胞增殖水平的影響Fig.3 The effect of OPN5 on granulosa cells proliferation level

2.4 過表達(dá)或干擾OPN5對鴨顆粒細(xì)胞凋亡與增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

檢測顆粒細(xì)胞凋亡與增殖相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(圖4)，OPN5過表達(dá)極顯著下調(diào)凋亡基因Bax與Caspase3的表達(dá)(P<0.01)，顯著或極顯著上調(diào)抑制凋亡基因BCl2、BCl6表達(dá)(P<0.05或P<0.01)和極顯著上調(diào)增殖基因CDC20、CDK1與CyclinD1的表達(dá) (P<0.01)；干擾OPN5對以上基因表達(dá)水平的影響均與OPN5過表達(dá)的影響結(jié)果相反。結(jié)果表明，過表達(dá)或干擾OPN5能通過影響顆粒細(xì)胞凋亡與增殖相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)或抑制顆粒細(xì)胞增殖。

圖4 顆粒細(xì)胞凋亡、增殖相關(guān)基因表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of apoptosis and proliferation-related genes in granulosa cells

2.5 過表達(dá)或干擾OPN5對顆粒細(xì)胞生殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

檢測顆粒細(xì)胞生殖相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(圖5)，轉(zhuǎn)染OPN5過表達(dá)載體能極顯著上調(diào)OPN5的表達(dá)水平(P<0.01)；OPN5過表達(dá)極顯著升高GnRHR、FSHR、LHR的表達(dá)量(P<0.01)，也增加TSHβ、GnRH的表達(dá)，但未達(dá)顯著水平；極顯著抑制GnIH、GnIHR的表達(dá)(P<0.01)。干擾OPN5能極顯著抑制OPN5表達(dá)，干擾效率達(dá)60%；干擾OPN5極顯著降低生殖相關(guān)基因GnRH、GnRHR、FSHR、LHR的表達(dá)，極顯著增加GnIH、GnIHR的表達(dá)(P<0.01)，而對TSHβ的表達(dá)則無顯著影響(P>0.05)。

圖5 顆粒細(xì)胞生殖相關(guān)基因表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of reproduction-related genes in granulosa cells

2.6 過表達(dá)或干擾OPN5對顆粒細(xì)胞類固醇激素合成通路的影響

檢測類固醇合成通路相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(圖6A和6B)，OPN5過表達(dá)顯著或極顯著上調(diào)類固醇合成通道基因StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)；干擾OPN5對以上類固醇合成通道基因的表達(dá)產(chǎn)生相反的影響，顯著或極顯著下調(diào)StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。檢測顆粒細(xì)胞OPN5和類固醇合成通路中3β-HSD、CYP19A1因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示(圖6C和6D)，OPN5過表達(dá)顯著上調(diào)OPN5、3β-HSD和CYP19A1的蛋白表達(dá)(P<0.05)；干擾OPN5則顯著下調(diào)OPN5、3β-HSD和CYP19A1的蛋白表達(dá)(P<0.05)。所得結(jié)果與基因的表達(dá)結(jié)果相一致。

2.7 過表達(dá)或干擾OPN5對鴨顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中生殖激素水平的影響

測定細(xì)胞培養(yǎng)液中生殖激素水平。結(jié)果顯示(圖7)，過表達(dá)OPN5極顯著升高細(xì)胞液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的水平(P<0.01)，極顯著降低抑制素β(INHβ)的水平(P<0.01)；干擾OPN5則極顯著降低細(xì)胞液中E2和P4水平和升高INHβ水平(P<0.01)。結(jié)果表明，過表達(dá)OPN5促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌E2和P4，抑制INHβ表達(dá)和分泌，干擾OPN5則呈現(xiàn)相反的結(jié)果。

A、B.過表達(dá)或干擾OPN5對類固醇通路相關(guān)基因表達(dá)水平的影響；C.過表達(dá)和干擾OPN5對OPN5、CYP19A1、3β-HSD蛋白表達(dá)的Western blot結(jié)果；D.過表達(dá)和干擾OPN5對OPN5、CYP19A1、3β-HSD蛋白表達(dá)的影響A,B.Effect of overexpression and interference with OPN5 on the expression levels of steroid pathway-related genes;C.Western blot results of overexpression and interference with OPN5 on the expression of OPN5,CYP19A1,and 3β-HSD proteins;D.Effect of overexpression and interference with OPN5 on the expression of OPN5,CYP19A1,and 3β-HSD proteins圖6 顆粒細(xì)胞類固醇激素合成通路關(guān)鍵因子表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of key factors in the steroid hormone synthesis pathway in granulosa cells

圖7 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中生殖激素水平Fig.7 Reproductive hormone levels in granulocyte cultures

3 討 論

OPN5是深腦光照感受器，能介導(dǎo)光照對禽(鳥)類繁殖活動的調(diào)控。國內(nèi)外對OPN5的研究均圍繞生殖軸上游的下丘腦-垂體層來展開，并且大量研究已表明，OPN5可將光信號傳導(dǎo)至垂體結(jié)節(jié)(PT)，啟動甲狀腺激素應(yīng)答(TH-responsive)信號通路[8-9]，通過調(diào)節(jié)甲狀腺素(T3)的分泌來影響GnRH的生成和分泌[17-18]，從而調(diào)控禽(鳥)類繁殖；但是關(guān)于OPN5在生殖軸下游性腺層面的直接作用尚未見報道。有研究表明，OPN5在性腺層面有高濃度表達(dá)[1-4]，并且主要在顆粒層，這預(yù)示OPN5在性腺層對禽(鳥)類的繁殖活性具有直接調(diào)控作用。本研究進(jìn)一步證實了這個結(jié)論，并從正反兩方面揭示了OPN5在顆粒細(xì)胞中的作用機制。所得結(jié)果表明，OPN5除了在生殖軸上游的下丘腦、垂體層面發(fā)揮調(diào)控作用外，還在性腺層面直接發(fā)揮作用。

在禽(鳥)類，主要由顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞來促進(jìn)卵泡的發(fā)育，其中顆粒細(xì)胞是合成P4的重要場所，E2則是由膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞共同合成[19-20]，E2和P4互相之間存在正反饋調(diào)節(jié)。雌激素在卵泡發(fā)育過程中具有明顯調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)LHR的分化和芳香化酶的合成，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育和抑制顆粒細(xì)胞凋亡[21-22]。在E2負(fù)反饋控制下，INH表達(dá)的降低可以使FSH表達(dá)水平升高[23]。本研究中，通過檢測過表達(dá)或干擾OPN5轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)均是72 h 轉(zhuǎn)染效果最佳，過表達(dá)OPN5能夠促進(jìn)鴨顆粒細(xì)胞的增殖，抑制顆粒細(xì)胞的凋亡。檢測凋亡和增殖相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)OPN5顯著抑制細(xì)胞凋亡基因Bax與Caspase3的表達(dá)，而明顯升高凋亡抑制基因BCl2、BCl6的表達(dá)，同時也顯著升高細(xì)胞增殖因子CDC20、CDK1與CyclinD1的表達(dá)水平。相反，干擾OPN5則明顯抑制顆粒細(xì)胞增殖，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，并顯著促進(jìn)以上凋亡基因的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡抑制基因和細(xì)胞增殖因子的表達(dá)。本研究結(jié)果從正反兩方面均表明，OPN5能促進(jìn)體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞增殖，抑制凋亡，提示其可能在性腺通過調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡來影響卵泡的發(fā)育，這與相關(guān)研究結(jié)果相一致。有研究表明，隨著人顆粒細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞凋亡基因Bax、Caspase3表達(dá)上升，而凋亡抑制基因BCl2的表達(dá)則下降[12]；伴隨著豬顆粒細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞凋亡基因Caspase3表達(dá)明顯上升[13]，而當(dāng)牛顆粒細(xì)胞增殖時，細(xì)胞增殖因子CDC20、CDK1與CyclinD1表達(dá)會明顯上升[14]。還有研究顯示，當(dāng)小鼠顆粒細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞增殖因子Cyclin D1蛋白表達(dá)下調(diào)，但細(xì)胞凋亡因子Bax的蛋白表達(dá)上升[24]；當(dāng)細(xì)胞增殖因子CyclinD1 mRNA水平上升時，雞顆粒細(xì)胞的增殖增加[25]。這些結(jié)果均提示，當(dāng)細(xì)胞凋亡因子表達(dá)增加，凋亡抑制因子和細(xì)胞增殖因子表達(dá)下降時，會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增多，增殖受到抑制；相反，細(xì)胞凋亡受抑制，增殖增多時，細(xì)胞凋亡因子表達(dá)下降，凋亡抑制因子和增殖因子水平均上升。本研究中，當(dāng)OPN5過表達(dá)時，在促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，抑制其凋亡的同時，相關(guān)凋亡因子、凋亡抑制因子及細(xì)胞增殖因子的表達(dá)變化與以上的結(jié)果均一致。

顆粒細(xì)胞作為卵泡發(fā)育的重要支持細(xì)胞，也是類固醇激素生成的主要細(xì)胞。在生殖軸調(diào)控性腺發(fā)育的過程中，尤其是對卵泡發(fā)育的影響，下丘腦和垂體層面調(diào)控激素均通過與顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞上特異性受體結(jié)合來調(diào)控這些細(xì)胞的增殖、凋亡及類固醇激素的生成，對卵泡發(fā)育產(chǎn)生影響，其中下丘腦GnRH、GnIH和垂體FSH、LH對性腺發(fā)育發(fā)揮重要調(diào)控作用，GnIH能在性腺直接表達(dá)并發(fā)揮作用。本研究中，過表達(dá)OPN5能顯著升高生殖相關(guān)基因GnRHR、FSHR、LHR和類固醇生成通道基因StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1的表達(dá)，顯著下調(diào)生殖相關(guān)基因GnIH、GnIHR的表達(dá)，而干擾OPN5則呈現(xiàn)相反的結(jié)果。檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的類固醇激素水平，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)OPN5能顯著升高E2和P4水平，降低INHβ水平，而干擾OPN5則顯著降低E2和P4水平和升高INHβ水平。本研究結(jié)果表明，過表達(dá)OPN5可以增加下丘腦和垂體促進(jìn)繁殖的調(diào)控因子對顆粒細(xì)胞的作用，并促進(jìn)顆粒細(xì)胞中類固醇激素生成，從而對性腺發(fā)育產(chǎn)生影響，而干擾OPN5則進(jìn)一步從反向印證了這一結(jié)論。這些結(jié)果與相關(guān)的研究報道一致。大量的研究表明，StAR是類固醇激素合成的重要限速酶，其在卵泡發(fā)育的各階段均有表達(dá)[26]，黃體能否正常產(chǎn)生P4受StAR表達(dá)的調(diào)控[27]；CYP11A1、CYP19A1與卵泡發(fā)育及顆粒細(xì)胞成熟有關(guān)[28]，CYP19A1敲除小鼠無法合成E2[29]；3β-HSD則可催化產(chǎn)生有活性的P4來調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育進(jìn)程[30]；CYP17A1可以通過控制雄激素的合成刺激顆粒細(xì)胞釋放P4而調(diào)控排卵，還能影響早期卵泡發(fā)育[31-32]。在體外細(xì)胞試驗方面，GnIH的增加能減少顆粒細(xì)胞中類固醇激素的釋放，降低LHR和FSHR以及相應(yīng)類固醇激素合成酶的表達(dá)，如StAR、3β-HSD和CYP19A1，會導(dǎo)致E2和P4的分泌減少，并伴隨有顆粒細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞增殖受抑制[11]。另外，也有研究表明，E2和P4可以降低GnIHR的表達(dá)，GnIHR的表達(dá)量在性成熟的鳥類卵巢中較未性成熟的鳥類更低[33]；在E2的負(fù)反饋下，低水平的INH可以使FSH在繁殖期內(nèi)表達(dá)水平升高[19]。

在季節(jié)性繁殖禽(鳥)類中，繁殖活動的季節(jié)性變化主要受光照控制，不同光照時間或波長在調(diào)控動物繁殖活動的同時會導(dǎo)致OPN5表達(dá)的升高或降低。有研究表明，延長光照在升高OPN5和TSHβ表達(dá)的同時會提高匈牙利白鵝的產(chǎn)蛋率[8]；在白光和紅光照射下，OPN5的表達(dá)量會高于藍(lán)光和綠光的照射，并會升高揚州鵝產(chǎn)蛋性能[9]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，OPN5表達(dá)量的降低能顯著抑制鵪鶉TSHβ的表達(dá)[34]。在非季節(jié)性繁殖禽(鳥)類中，不同的光照處理也會影響繁殖性能，相應(yīng)OPN5的表達(dá)也會升高或降低。研究發(fā)現(xiàn)，延長光照時間會促進(jìn)原雞睪丸發(fā)育，OPN5表達(dá)量升高，且OPN5的表達(dá)對光照反應(yīng)非常迅速[2]；在山麻鴨上，47 d的觀察期內(nèi)，24 h光照時長的產(chǎn)蛋率顯著高于18 h[35]。結(jié)合以上研究結(jié)果，本研究結(jié)果提示，OPN5在光照調(diào)控禽(鳥)類繁殖活動中發(fā)揮了重要的介導(dǎo)作用，也提示其能在生殖軸的3個層面同時發(fā)揮對性腺發(fā)育的調(diào)控作用，但其作用機制及相互關(guān)系，目前仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

OPN5能促進(jìn)體外培養(yǎng)的鴨卵泡顆粒細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，通過影響顆粒細(xì)胞中類固醇生成通路中相關(guān)因子的表達(dá)來促進(jìn)類固醇激素的生成和分泌。