基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析甲狀腺癌基因表達(dá)譜

趙國(guó)連，王冀邯，崔曉利

(1． 西安市胸科醫(yī)院 檢驗(yàn)科，西安 710100 ；2.西北工業(yè)大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究院，西安 710072)

甲狀腺癌(Thyroid cancer,THCA)是內(nèi)分泌系中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，易受飲食、遺傳、環(huán)境等多種因素的影響[1]。近年來(lái)，中國(guó)的甲狀腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)且女性高于男性[2]?；诩谞钕侔┬g(shù)前診斷率低且晚期患者預(yù)后差的特點(diǎn)，探索其發(fā)病機(jī)制并尋找新型分子標(biāo)志物，對(duì)于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療具有重要意義[3]。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)及基因芯片技術(shù)的進(jìn)步，其在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用愈加廣泛。利用生物信息學(xué)方法在龐大的基因數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選癌癥診斷的生物標(biāo)志物方法的有效性已經(jīng)被大量的臨床數(shù)據(jù)證實(shí)[4]。

目前已有學(xué)者[3]應(yīng)用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(The gene expression omnibus,GEO)對(duì)甲狀腺癌潛在的miRNAs 生物學(xué)標(biāo)志物及靶基因功能和信號(hào)通路進(jìn)行分析。Choi等通過(guò)腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)建立了一個(gè)12個(gè)基因預(yù)測(cè)模型(包括BCC8，CHI3L1，CLCNKA，F(xiàn)AM155B，GABRG1，LUM，MRO，MT1G，MT1H，SELV，SLC4A4和TMEM92)，用于預(yù)測(cè)甲狀腺乳頭狀瘤(Papillary thyroid carcinoma,PTC)中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[5]。此外，Lin等人使用腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中與免疫相關(guān)的7個(gè)基因建立預(yù)后預(yù)測(cè)模型(包括AGTR1，CTGF，F(xiàn)AM3B，IL11，IL17C，PTH2R和SPAG11A)用于預(yù)測(cè)PTC預(yù)后情況[6]。因此，進(jìn)一步探索公共數(shù)據(jù)庫(kù)，將為尋找THCA發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及挖掘疾病新型生物標(biāo)志物提供依據(jù)。本研究整合了TCGA中的THCA基因表達(dá)數(shù)據(jù)，應(yīng)用edgeR和limma兩種算法對(duì)診斷甲狀腺癌具有潛在應(yīng)用價(jià)值的基因標(biāo)志物做出預(yù)測(cè)，后續(xù)通過(guò)雙聚類分析及ROC分析進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)基因的可靠性。通過(guò)生物信息學(xué)分析鑒定出了11個(gè)THCA的差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs)及與疾病診斷相關(guān)的基因，以期為探索THCA發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及挖掘疾病新型生物標(biāo)志物提供依據(jù)[2,7]。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源及數(shù)據(jù)處理

通過(guò)UCSC xean網(wǎng)站下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的甲狀腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)(https://gdc.xenahubs.net/download/TCGA-THCA.htseq_counts.tsv.gz)，該數(shù)據(jù)為L(zhǎng)og2標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)集包含了510例腫瘤樣本和58例正常對(duì)照樣本。

在UCSC xean網(wǎng)站下載THCA對(duì)應(yīng)的ID/Gene Mapping (https://gdc.xenahubs.net/download/gencode.v22.annotation.gene.probeMap)，將基因ID 與基因名稱進(jìn)行匹配，當(dāng)有多個(gè)ID對(duì)應(yīng)同一個(gè)基因名稱時(shí)，求多個(gè)ID 的平均表達(dá)值。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分別運(yùn)用R/Bioconductor中的edgeR包[8]和limma包[9]對(duì)預(yù)處理過(guò)后的THCA數(shù)據(jù)提取差異表達(dá)基因。選取腫瘤與正常對(duì)照組間表達(dá)差異倍數(shù)(Fold change，F(xiàn)C)大于2，P<0.05的基因作為差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs)，將兩種算下的DEGs取交集。運(yùn)用R 中的pheatmap包對(duì)DEGs進(jìn)行雙聚類。運(yùn)用Medcalc19.0.4統(tǒng)計(jì)軟件分析，檢驗(yàn)所篩選的DEGs在鑒別腫瘤樣本和正常對(duì)照樣本的應(yīng)用效果，獲取敏感性、特異性、曲線下面積等指標(biāo)。

2 結(jié)果分析

2.1 THCA中差異表達(dá)基因的篩選

首先選取腫瘤與正常對(duì)照組間倍數(shù)改變大于2，P<0.05的基因。其中，利用edgeR包得到差異基因共2 768個(gè)(上調(diào)1 765個(gè)，下調(diào)1 003個(gè))；利用limma包得到差異基因共2 699個(gè)(上調(diào)1 080個(gè)，下調(diào)1 619個(gè))(見(jiàn)圖1)。將上述兩種算法的結(jié)果求交集并去除表達(dá)趨勢(shì)不一致的基因，最終得到差異基因共1 945個(gè)(上調(diào)1 033個(gè)，下調(diào)912個(gè))。進(jìn)一步分析顯示，隨著組間差異倍數(shù)增大，差異基因主要表現(xiàn)為在腫瘤組織中上調(diào)(見(jiàn)圖2)。

圖1 腫瘤組與正常對(duì)照組間DEGs火山圖Fig.1 Volcanic diagram of DEGs between tumor group and normal control group

圖2 不同倍數(shù)改變的DEGs統(tǒng)計(jì)Fig.2 DEGs statistics with different multiples

2.2 候選基因?qū)HCA的診斷效能分析

分析顯示，隨著組間差異倍數(shù)的增大，腫瘤組織中DEGs絕大部分表現(xiàn)為上調(diào)的模式，我們進(jìn)一步篩選出組間差異倍數(shù)在32倍(log2(FC)=5)以上的DEGs進(jìn)行后續(xù)分析。該11個(gè)差異基因在兩種算法中的計(jì)算結(jié)果(見(jiàn)表1)。對(duì)11個(gè)DEGs和樣本進(jìn)行雙聚類分析，可以看出，基于組間的DEGs表達(dá)能夠較好的將腫瘤樣本和正常對(duì)照樣本進(jìn)行區(qū)分(見(jiàn)圖3)。

圖3 DEGs和樣本的雙聚類分析Fig.3 Biclustering analysis of DEGs and samples注：橫坐標(biāo)為樣本(紅色代表癌癥組，藍(lán)色代表正常組)，縱坐標(biāo)為差異表達(dá)基因.

表1 篩選出的DEGs匯總Table 1 Summary of screened DEGs

進(jìn)一步對(duì)篩選出的11個(gè)候選差異基因進(jìn)行顯示，基于基因表達(dá)值鑒別腫瘤組與對(duì)照組的敏感性和特異性均在70%以上，曲線下面積均大于0.8(見(jiàn)圖4及表2)。提示上述基因可以較好地鑒別THCA腫瘤組和正常組。

圖4 基于候選基因鑒別腫瘤樣本與正常對(duì)照組的ROC曲線Fig.4 ROC curves of tumor samples and normal control group based on candidate genes

表2 基于候選基因鑒別腫瘤樣本與正常對(duì)照組的應(yīng)用效果Table 2 Application effects of differentiating tumor samples from normal control group based on candidate genes

3 討 論

THCA是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，尋找潛在的分子標(biāo)志物對(duì)于臨床與科研工作至關(guān)重要。TCGA作為全球最大的癌癥基因數(shù)據(jù)庫(kù)，其大量且規(guī)范的樣本及基因表達(dá)數(shù)據(jù)為研究探索THCA的發(fā)病機(jī)制及基因標(biāo)志物提供了平臺(tái)[10]。本文基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的THCA基因表達(dá)數(shù)據(jù)，對(duì)edgeR算法和limma算法的處理結(jié)果取交集并選擇fold change>2、P<0.05且差異表達(dá)變化趨勢(shì)一致的基因?yàn)镈EGs，最終得到了1 945個(gè)DEGs。且隨著差異倍數(shù)的不斷增大，腫瘤組織中DEGs主要表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)的改變模式。ROC結(jié)果顯示，11個(gè)差異顯著的DEGs在鑒別腫瘤與正常組具有較好的結(jié)果。預(yù)期由這11個(gè)表達(dá)差異的DEGs組合將為TCGA的診斷、預(yù)后及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有一定的應(yīng)用價(jià)值。

Jin Y等人發(fā)現(xiàn)GABRB2基因在甲狀腺腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)，通過(guò)與正常組織為對(duì)照組的隊(duì)列研究中顯示GABRB2在PCT中過(guò)表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)表明GABRB2下調(diào)會(huì)顯著抑制三種PCT細(xì)胞系的集落形成，遷徙和侵襲[11]。說(shuō)明其有作為分子診斷標(biāo)志物的潛力。HMGA2是一種非組蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，可影響包括細(xì)胞周期過(guò)程、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、衰老等生物學(xué)過(guò)程。Chiappetta G 等人通過(guò)免疫組織化學(xué)和定量RT-PCR分析，認(rèn)為HMGA2表達(dá)與人類甲狀腺腫瘤中的惡性表型相關(guān)[12]。Ivanamija通過(guò)對(duì)細(xì)針穿刺甲狀腺結(jié)節(jié)中HMGA2分析認(rèn)為其可以作為區(qū)分惡性和良性甲狀腺結(jié)節(jié)的輔助生物標(biāo)志物[13]。MUC21是一種從TA3-Ha細(xì)胞中鑒定出一種新型粘蛋白。它在甲狀腺癌中通過(guò)mRNA水平和抗體結(jié)合被發(fā)現(xiàn)，但在相鄰的正常上皮中卻沒(méi)有，這就進(jìn)一步說(shuō)明這種粘蛋白有用作甲狀腺癌的組織或血清標(biāo)志物[14]。SYT12有相關(guān)研究證明，SYT12在甲狀腺癌中具有一定的預(yù)后意義，SYT12可用于PCT患者的病情進(jìn)展預(yù)測(cè)的過(guò)表達(dá)與癌癥的轉(zhuǎn)移有關(guān)。但SYT12子癌癥中的分子生物學(xué)作用仍不清楚[15]。一些研究表明ZCCHC12基因與某些疾病有關(guān)，但ZCCHC12在甲狀腺癌中的功能尚未確定。Wang O 的結(jié)論證明：ZCCHC12的表達(dá)在甲狀腺癌中顯著上調(diào)，該基因過(guò)表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，說(shuō)明該基因具有重要的生物學(xué)功能，并有作為甲狀腺癌癥中與轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌基因的潛在價(jià)值[16]。

Li YDENG 等研究發(fā)現(xiàn)，LIPH在甲狀腺癌組織中的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明，LIPH與甲狀腺癌細(xì)胞系的惡性行為呈正相關(guān)，這可以作為甲狀腺癌診斷標(biāo)志物的有力證據(jù)[17]。Jarzab B在應(yīng)用基因芯片方法對(duì)23例甲狀腺癌患者基因表達(dá)譜分析中也明確RXRG的表達(dá)有顯著升高，但是該基因在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮具體作用的機(jī)制還未明確[18]。

除了以上7種預(yù)測(cè)基因在甲狀腺癌中的相關(guān)報(bào)道，目前尚未有對(duì)于PRR15、SLC22A31、SLIT1和SYTL54種基因在甲狀腺癌作用機(jī)制的報(bào)道，但是SYTL5和PRR15基因表達(dá)上調(diào)在其他癌癥中的有多次報(bào)道。Wright PK等人通過(guò)免疫組化顯示SYTL5在正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、原位導(dǎo)管癌和浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)[19]。Meunier D等人研究表明 PRR15在小鼠和人類胃腸道腫瘤中高表達(dá)，可能APC蛋白的缺失有關(guān)[20]。預(yù)測(cè)的11個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)以往沒(méi)有報(bào)道與甲狀腺癌相關(guān)的基因值得進(jìn)一步研究，但是這些基因用于甲狀腺癌診斷的可靠性還有待更加深入的機(jī)制研究。

綜上，本研究通過(guò)分析TCGA甲狀腺癌表達(dá)數(shù)據(jù)，鑒定出了與THCA發(fā)生發(fā)展相關(guān)的11種生物標(biāo)志物，鑒于此，在今后的臨床研究中可以以這些顯著表達(dá)差異的基因作為藥物治療的靶向治療點(diǎn)。本研究不足在于缺乏更深入的機(jī)制研究，首先轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析并不能完全代表機(jī)體總體變化，其次，由于缺乏體內(nèi)或體外試驗(yàn)，該分子預(yù)測(cè)結(jié)果還需要進(jìn)一步的臨床樣本驗(yàn)證。

4 結(jié)論

分析了TCGA中的甲狀腺癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)，鑒定出了與疾病診斷顯著相關(guān)的11個(gè)差異表達(dá)基因，并通過(guò)雙聚類分析及ROC分析進(jìn)一步驗(yàn)證顯示預(yù)測(cè)基因的可靠性，這將為探索甲狀腺腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制及尋找新型分子標(biāo)志物提供依據(jù)。