葡萄糖氧化酶介導的智能響應(yīng)胰島素遞送的研究進展

楊靜如，馬俞宏，黃德春，錢紅亮，陳 維

（中國藥科大學工學院制藥工程教研室，南京211198）

糖尿病是一種血糖水平異常升高的代謝紊亂類疾病，是人類目前疾病種類中最具有高發(fā)性且普遍的慢性疾病，其伴隨眾多并發(fā)癥導致死亡率非常高［1］。最新研究表明，糖尿病及其并發(fā)癥造成的病死率占總病死率的12%，僅次于心臟病和腫瘤［2］。其特征是由于機體無法產(chǎn)生或使用胰島素而導致的高血糖水平，被確定為主要的醫(yī)學挑戰(zhàn)之一?！度蛱悄虿「庞[》顯示，全球有4.63億人患有糖尿病，預(yù)計到2045年，這一數(shù)字將超過7億［3］。胰島素給藥是治療1 型和晚期2 型糖尿病的首要策略［4-6］。然而，由于難以控制胰島素的劑量，傳統(tǒng)的直接注射胰島素方式易引發(fā)低血糖，從而導致失明、昏迷、癲癇發(fā)作、腎衰竭、腦損傷甚至死亡［7］。近年來，葡萄糖響應(yīng)性胰島素釋放的治療系統(tǒng)顯示出越來越多的優(yōu)勢，該系統(tǒng)能夠模擬胰島β細胞分泌胰島素的動態(tài)生物過程，維持血糖的穩(wěn)定，實現(xiàn)個體層面的精準醫(yī)療［8］。即將葡萄糖響應(yīng)性組分整合到胰島素分子或胰島素傳遞系統(tǒng)中，在人體循環(huán)系統(tǒng)中建立“人工胰島”，它能感知血糖水平的升高或降低，并對其做出反應(yīng)，使其根據(jù)血糖水平自動、連續(xù)控制胰島素釋放量，稱為閉環(huán)智能胰島素遞送系統(tǒng)。目前，構(gòu)建葡萄糖響應(yīng)型胰島素傳遞系統(tǒng)的主要葡萄糖感應(yīng)部分包括葡萄糖氧化酶（GOx）、苯基硼酸（PBA）和葡萄糖結(jié)合分子（如ConA）［9-10］。其中，GOx已成為生物領(lǐng)域內(nèi)一種十分重要的功能性酶，具有高度的葡萄糖特異性及快速響應(yīng)性，成為閉環(huán)胰島素遞送的研究熱點。

GOx是專一催化β-D-葡萄糖的氧化還原酶，由兩個相對分子質(zhì)量為80 kD 的亞基組成，每個亞基結(jié)合一個黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔酶［8］。該酶以O(shè)2為電子受體，催化葡萄糖的同時迅速消耗O2，生成葡萄糖酸和H2O2。

因此，基于GOx 的胰島素遞送系統(tǒng)存在眾多葡萄糖響應(yīng)性組分，主要原理是通過GOx 氧化血液中的葡萄糖所產(chǎn)生的生理環(huán)境的變化觸發(fā)胰島素的釋放，包括催化氧化產(chǎn)生的局部pH、H2O2濃度和O2水平的變化。當GOx 與pH 響應(yīng)性聚合物材料相結(jié)合時，高血糖環(huán)境下GOx 催化葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸，導致微環(huán)境pH 發(fā)生變化，觸發(fā)載體構(gòu)象或結(jié)構(gòu)變化，從而導致預(yù)載藥物的釋放。同時，氧氣的消耗使得GOx 系統(tǒng)形成原位缺氧微環(huán)境，使載體部分組分發(fā)生還原反應(yīng)，破壞載藥體系以釋放胰島素。除了清除GOx 產(chǎn)生的H2O2以維持酶活性外，H2O2本身也可以作為胰島素釋放的觸發(fā)器，常分解載體系統(tǒng)中的苯硼酸酯以釋放裝載藥物。

基于GOx 的系統(tǒng)常存在酶變性、催化的氧氣不足、GOx 或其他酶系統(tǒng)的免疫原性、胰島素負載能力低等問題［11-12］。隨著研究人員對藥物遞送載體的研究及胰島素的修飾，涌現(xiàn)了一大批基于GOx的智能響應(yīng)的材料或制劑，如膜、水凝膠、納米囊泡、微針陣列貼片、脂質(zhì)體、細胞等。胰島素的釋放通常是基于凝膠和膜的膨脹或收縮、水凝膠或粒子及膜的降解、氧化還原反應(yīng)、競爭性結(jié)合等。

GOx 系統(tǒng)的O2水平、H2O2含量及pH 高低與系統(tǒng)中的葡萄糖水平高度相關(guān)，故按葡萄糖響應(yīng)機制可以分為pH 響應(yīng)、缺氧響應(yīng)、H2O2響應(yīng)，許多功能性的嵌段物還具有多重響應(yīng)。因此，本文對近年來GOx 介導的單一智能響應(yīng)、多重智能響應(yīng)的胰島素遞送進行總結(jié)（圖1），以期提供更加高效、智能、可行的糖尿病治療策略。

1 單一響應(yīng)

1.1 pH響應(yīng)

Figure 1 Types of intelligent response in GOx mediated insulin delivery

水凝膠是由物理或化學交聯(lián)形成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物［13］，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域，包括藥物遞送和組織工程，在葡萄糖誘導的藥物遞送過程中具有可逆的機械膨脹和收縮特性［14］。因此，酸敏感的交聯(lián)水凝膠和微凝膠為固定GOx 提供了良好的半濕和三維環(huán)境，廣泛應(yīng)用于自調(diào)節(jié)給藥系統(tǒng)。Gordijo 等［15］開發(fā)了一種由二氧化錳、聚異丙基丙烯酰胺-異甲基丙烯酸（NIPAM-MAA）、GOx、胰島素等組成的復(fù)合材料，合成的PNIPAM-MAA 膜能在高血糖誘導的酸性條件下收縮（圖2），通過增加水凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔隙率使胰島素跨膜釋放。該材料采用聚乙二醇化和硅烷化醫(yī)用硅酮管，有良好的生物相容性及化學穩(wěn)定性，且胰島素裝載量高，生物-無機開關(guān)的引入能夠防止胰島素的不受控泄漏。在pH 5.0 的PBS 體外模擬環(huán)境中，該載藥系統(tǒng)具有良好的胰島素釋放特性。血漿胰島素檢測表明，該系統(tǒng)能夠?qū)⒁葝u素釋放時間延長至8 d，并將血糖濃度控制在正常范圍內(nèi)。

Figure 2 A: Insulin delivery prototype device and its components: (i) A glucose-responsive plug was integrated into an insulin reservoir; (ii) Insulin reservoir made with surface modified silicone; (iii) A surfactant-stabilized insulin solution was encased in the reservoir.B: Photograph showing the insulin delivery device prototype

基于水凝膠的膨脹機制，以殼聚糖為基質(zhì)的水凝膠和微凝膠在藥物釋放領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［16］。Gu等［17］制備了由pH響應(yīng)型殼聚糖基質(zhì)、GOx、過氧化氫酶（CAT）、胰島素組成的微凝膠，其中的酶系穩(wěn)定性好、對外界刺激可控性能高。GOx 被共價封裝到納米膠囊中，通過避免變性和免疫原性提高酶的穩(wěn)定性。在高血糖條件下，含胺基的聚合物鏈的質(zhì)子化，增加了凝膠基質(zhì)中的電荷，導致微凝膠膨脹并釋放胰島素，其相應(yīng)溶液的pH 從7.4 下降至6.6。此外，酸性環(huán)境增強了胰島素的溶解，進一步加快了胰島素的響應(yīng)速率。 Anirudhan等［18］合成了油酸接枝胺化β-環(huán)糊精（OA-g-ACD）共聚物，包載胰島素后將其涂上GOx 和CAT 的分散體。當系統(tǒng)的pH 降低時，胺基發(fā)生質(zhì)子化，導致聚合物基體膨脹，使胰島素從母體中釋放。在pH 7.4 的PBS 溶液中，微凝膠樣品在100 和400 mg/dL 的葡萄糖溶液的pH 分別下降至5.4 和4.0。Kim 等［19］制備了基于殼聚糖凝膠和介孔二氧化硅的葡萄糖響應(yīng)性蛋白傳遞系統(tǒng)，GOx 及氧化鈰納米顆粒（CeNPs）被裝載入微凝膠中，CeNPs 能成功分解H2O2，并再生O2，保護GOx 不變性。在GOx 的催化下系統(tǒng)的pH降低，400 mg/dL的葡萄糖溶液中載藥系統(tǒng)的pH 由7.4 下降至4.8。殼聚糖凝膠膨脹，隨后被包裹的蛋白藥物釋放。

具有相反電荷的聚合物通過層層組裝形成薄膜和微膠囊［11］，在酸性條件下改變聚合物的電荷分布，使其結(jié)構(gòu)裂解釋放藥物。Mohammadpour等［22］開發(fā)了一種可注射的納米復(fù)合制劑，由帶相反電荷的殼聚糖和聚乳酸- 羥基乙酸共聚物（PLGA）納米粒通過靜電相互作用混合而成，每個納米粒都裝載GOx 和CAT。在高血糖誘導的酸性微環(huán)境下，納米顆粒解離釋放胰島素，在6 h 內(nèi)納米粒溶液的pH由7.4降至3.9。體內(nèi)研究表明，單次注射納米網(wǎng)絡(luò)（nano-network）能夠穩(wěn)定血糖在正常狀態(tài)（＜200 mg/dL）長達10 d。Gu等［23］分別用帶正電荷的殼聚糖和帶負電荷的海藻酸鹽包裹葡萄糖響應(yīng)性納米粒，兩種帶相反電荷的粒子的混合形成了可注射的凝膠網(wǎng)絡(luò)，使用化學修飾的葡聚糖（指定為間葡聚糖）作為酸可降解和生物相容性的基質(zhì)材料，交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)能夠避免胰島素的過早泄漏。當葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸時，兩種粒子間的靜電相互作用被打破，凝膠網(wǎng)絡(luò)解離并釋放胰島素。在高血糖下用PBS 溶液孵育8 h，交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)降解導致溶液的pH從7.4降低至4.2。

與微凝膠相比，聚合物囊泡的尺寸更小，易通過兩親性共聚物自組裝形成［4］。在葡萄糖敏感藥物傳遞的GOx 系統(tǒng)中，囊泡與響應(yīng)材料結(jié)合，外界刺激引起材料的結(jié)構(gòu)或性能變化［24-25］（如親水性增大），并在酶促反應(yīng)的作用下進一步改變聚合物的形態(tài)及特征，達到藥物釋放的目的。其中，縮酮或縮醛作為常見的pH 響應(yīng)的基團，在合成自組裝納米囊泡中應(yīng)用廣泛。Tai 等［26］合成了一種葡萄糖響應(yīng)性聚合體納米囊泡，該囊泡是由兩親性二嵌段聚合物聚乙二醇-聚絲氨酸-縮酮［PEG-poly（Ser-Ketal）］自組裝形成，囊泡中心包裹GOx、CAT 和胰島素。該納米囊泡具有良好的生物相容性，相較于膠束，囊泡的載藥量更高，能夠長期有效地調(diào)節(jié)血糖。當高血糖誘導的葡萄糖酸增多時，縮酮鍵降解，水溶性增大，囊泡降解最終導致胰島素的釋放。酸敏感性實驗表明，高血糖水平下的囊泡呈現(xiàn)出顯著的pH 刺激，納米囊泡溶液的pH 在8 h內(nèi)由7.4 持續(xù)下降到4.5，顯示了高度的pH 響應(yīng)性。

已有研究證實，聚（2-（六亞甲基亞胺）甲基丙烯酸乙酯）（PHMEMA）具有快速pH 響應(yīng)（＜5 ms）的特點［27］。因此，利用PHMEMA構(gòu)建pH響應(yīng)型胰島素傳遞系統(tǒng)具有良好的應(yīng)用前景。Luo 等［28］設(shè)計了一種pH 響應(yīng)性微針陣列貼片，用于葡萄糖響應(yīng)性胰島素遞送。胰島素被封裝在pH 敏感納米顆粒（SNPs）中，SNPs 由mPEG-b-PHMEMA 制成。GOx 及CAT 共封裝入pH 不敏感的納米顆粒（iSNPs）中，以減少酶的滲漏。微針貼片能夠?qū)崿F(xiàn)無痛、方便給藥，提高病人的依從性，CAT 的包載能夠降低正常皮膚的炎癥風險。在高血糖條件下，GOx催化葡萄糖氧化為葡萄糖酸，造成局部酸性環(huán)境，溶液的pH在2 h內(nèi)迅速從7.4下降到4.0，觸發(fā)PHMEMA 片段中叔胺基的快速質(zhì)子化，從疏水到親水的轉(zhuǎn)變引發(fā)了SNPs 的解體，使胰島素的快速釋放。

近年來，宿主-客體相互作用的結(jié)合可用于藥物載體的合成［29-30］，由于主客體相互作用的動態(tài)特性，刺激響應(yīng)系統(tǒng)可以在外界刺激的情況下可逆地改變結(jié)構(gòu)。環(huán)糊精及其疏水客體形成的主-客體配合物可作為超分子結(jié)構(gòu)和功能材料的構(gòu)件，在聚合物取代基和聚合物鏈段中被廣泛研究和利用。Lin 等［31］設(shè)計了一種基于經(jīng)皮微針的高血糖敏感型胰島素智能給藥載體。智能超分子囊泡（PVs）由水溶性柱芳烴（WP5）和百草枯修飾的聚苯硼酸（PPBA-G）通過宿主-客體相互作用構(gòu)建。胰島素和GOx 被封裝到囊泡中，GOx 對高濃度的葡萄糖快速響應(yīng)，pH 的降低可調(diào)節(jié)WP5 和PPBAG 之間的宿主-客體相互作用，載藥囊泡被破壞，達到遞送胰島素的目的。體外胰島素釋放實驗顯示，載藥囊泡溶液的pH 由7.4 下降到5.0 時，胰島素的釋放量達到60%。

膠束是以疏水基團為內(nèi)核、親水基團為外殼的分子有序聚集體，常作為藥物輸送載體［32-33］。葡萄糖響應(yīng)性聚合物膠束能夠根據(jù)葡萄糖濃度控制胰島素釋放，是一種高效的胰島素遞送體。Li等［34］通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）反應(yīng)合成了二嵌段共聚物，即聚（乙二醇）-b-聚（2-二異丙基氨基乙基甲基丙烯酸酯）（PEG-b-PDPA），用于研究胰島素釋放行為對葡萄糖變化的響應(yīng)。異硫氰酸熒光素標記的胰島素和GOx 被共同裝載到聚合物納米載體中，具有pH 敏感性的疏水PDPA 嵌段隨著pH 的降低而迅速質(zhì)子化，使其由疏水性向親水性變化，釋放出納米微粒中的胰島素。該共聚物具有良好的生物相容性，葡萄糖響應(yīng)膠束可以有效地將胰島素捕獲在親水核心中，并按血糖水平高低釋放胰島素。葡萄糖響應(yīng)性“開-關(guān)”釋放實驗及細胞毒性實驗證實，這種葡萄糖響應(yīng)的納米載體顯示出自調(diào)節(jié)胰島素傳遞系統(tǒng)的潛力。

金屬有機框架（MOF）和共價有機框架（COF）是近年來引起大量研究興趣的一類多孔材料［35］。應(yīng)用較多的MOF由有機連接物和金屬離子自組裝形成，功能化的MOF 可用于不同的領(lǐng)域，如催化、氣體儲存、燃料電池的應(yīng)用等［36］，尤其是作為藥物傳遞載體和控釋系統(tǒng)。MOFs 可以通過一鍋法將蛋白質(zhì)裝載到內(nèi)部空腔中，即使在惡劣的條件下也能保持其生物活性［37］。此外，許多MOFs可以在酸、三磷酸腺苷、谷胱甘肽等的刺激下降解［15］，以釋放藥物。Jamwal 等［38］報道了一種由丙烯酰交聯(lián)葡聚糖雙醛（ACDD）及固定化的GOx 組成的藥物輸送系統(tǒng)。通過形成席夫堿合成納米丙烯酰交聯(lián)葡聚糖二醛（NACDD）-GOx-胰島素復(fù)合物，胰島素在不同pH 條件下從復(fù)合物中釋放出來。該載體細胞毒性及免疫原性低，形成的納米粒能夠保護胰島素免受胃腸道水解酶的影響，且共價固定化GOx有利于減少酶的損失。

例如，在學習人教版小學數(shù)學四年級《平均數(shù)與條形統(tǒng)計圖》時，教師可以改變過去單純的解說式教學法，通過多媒體技術(shù)進行課堂實際操作，在課堂上教師可以通過屏幕在對條形統(tǒng)計圖進行現(xiàn)場制作，結(jié)合各種資料，讓學生親身認識和理解課文知識，實現(xiàn)數(shù)學知識形象化，提高學生的學習效率，還可以有效引導學生進行自主學習，培養(yǎng)學生的自主學習能力，促進學生綜合素質(zhì)的培養(yǎng)。

利用Co2+離子和Zn2+離子合成MOF 框架是最為常用的方法之一，Yang 等［37］設(shè)計了一種鈷離子摻雜的沸石咪唑交聯(lián)骨架材料（Ins/GOx@Co-ZIF-8）的刺激響應(yīng)微針貼片。高血糖下形成的葡萄糖酸降低了MOFs 的局部pH，導致MOFs 降解，從而釋放預(yù)載胰島素。同時，產(chǎn)生的有害物H2O2被Co2+離子分解。COFs 也常應(yīng)用于胰島素的遞送體系，Zhang 等［39］通過Bronsted-Lewis（N：→B）型絡(luò)合將胰島素和GOx 封裝到COFs 中，與硼氧嘧啶相連的COFs 在酸性條件下中迅速分解，并有效釋放包埋的胰島素和GOx。

納米MOFs（NMOFs）能夠形成穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu)，具有高裝載量及納米尺寸獨特的優(yōu)良特性。Zhang 等［36］構(gòu)建了一種新的葡萄糖響應(yīng)性傳遞物（ZIF@Ins & GOx），用于自調(diào)節(jié)胰島素的釋放。ZIF-8 的剛性結(jié)構(gòu)可以保護胰島素的生物活性，并可調(diào)節(jié)胰島素的釋放以響應(yīng)葡萄糖濃度，單次皮下注射ZIF@Ins & GOx 可使血糖水平穩(wěn)定在正常血糖狀態(tài)達72 h。葡萄糖進入ZIF-8 的空腔后，被GOx氧化成葡萄糖酸，導致局部pH下降，在高血糖水平下，混合物的pH 在12 h 內(nèi)從7.4 下降到4.5，隨后ZIF-8 納米晶體在酸性微環(huán)境下降解。Chen等［40］將Zn2+-ZIF-8 作為智能葡萄糖響應(yīng)的藥物運送載體。NMOFs 分別裝載藥物和GOx，在pH 5.0及pH 6.0 的酸性微環(huán)境導致ZIF-8 納米粒的降解和負載藥物的釋放。

1.2 缺氧響應(yīng)

GOx 在催化葡萄糖過程中消耗氧氣，產(chǎn)生局部缺氧環(huán)境。2-硝基咪唑（NI）是一種疏水成分，由于其對腫瘤部位的低氧狀態(tài)高度敏感［41-42］，經(jīng)常被用于腫瘤成像。在低氧環(huán)境下，NI 與體內(nèi)的生物還原劑（如NADPH）耦合，經(jīng)一系列硝基還原酶催化轉(zhuǎn)化為親水的2-氨基咪唑［43］。這種親水性和疏水性的轉(zhuǎn)變導致藥物的釋放。Yu等［44］首次報道了以缺氧為生物刺激調(diào)節(jié)胰島素釋放的“智能胰島素貼片”，胰島素和GOx 被封裝到葡萄糖響應(yīng)納米囊泡（GRVs）中，GRVs 由低氧敏感透明質(zhì)酸（HS-HA）與疏水組分NI 自組裝而成，NI 在缺氧條件下通過生物還原轉(zhuǎn)化為親水的2-氨基咪唑，HSHA 水溶性增加，迅速觸發(fā)囊泡解離。該缺氧敏感性囊泡比pH 響應(yīng)迅速，易于給藥，并具有良好的生物相容性和生物降解性。

基于2-硝基咪唑與2-氨基咪唑的互變原理，Ye 等［45］開發(fā)了一種內(nèi)含胰島β 細胞和葡萄糖信號放大器（GSAs）的微針陣列貼片，GSAs 具有上述自組裝形成的缺氧響應(yīng)性納米囊泡，該納米囊泡包括3 種酶：GOx、α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。氧氣的快速消耗導致囊泡的分解，在3種酶的逐級催化下葡萄糖濃度升高，被胰島β細胞感知并促進胰島素的分泌。具有親水性或疏水性的氨基酸常用于兩親性囊泡的制備［46］。Zhou 等［25］以NI 為缺氧目標基團，采用兩親性2-硝基咪唑-L-半胱氨酸-海藻酸鹽（NI-Cys-Alg）偶聯(lián)物（圖3），制備了一種無創(chuàng)性、口服生物黏附納米顆粒體系，葡萄糖響應(yīng)性囊泡在缺氧條件下分解并釋放胰島素。該刺激響應(yīng)策略易于給藥、生物相容性和“智能”反應(yīng)性良好，能夠有效避免低血糖，為蛋白質(zhì)、低分子藥物及核酸通過口服途徑智能釋放提供了合理的設(shè)計。

Figure 3 Schematic diagram of oral insulin delivery of hypoxia-responsive vesicles

1.3 H2O2響應(yīng)

近年來，H2O2響應(yīng)在葡萄糖應(yīng)答系統(tǒng)中的比重逐漸增加，其中最常見的材料為水凝膠和微凝膠。宏觀水凝膠具有良好的細胞相容性、中等機械強度和對低濃度H2O2的快速響應(yīng)性［47］。共價交聯(lián)PEG 網(wǎng)絡(luò)能高效包埋胰島素和GOx 等生物大分子，在葡萄糖轉(zhuǎn)化為H2O2的基礎(chǔ)上，提供了一種新穎的葡萄糖響應(yīng)型胰島素遞送平臺［48-49］。Zhang等［12］利用氧化還原自由基聚合合成了一種水凝膠，具有高靈敏度、高響應(yīng)率、生物降解性和良好的生物相容性。該水凝膠由四臂的聚乙二醇組成，臂端連接H2O2敏感的苯硼酸衍生物，GOx 在高血糖條件下的催化反應(yīng)使H2O2濃度升高，導致水凝膠網(wǎng)絡(luò)的降解，達到遞送胰島素的目的。利用H2O2觸發(fā)水凝膠的降解，胰島素在5 h（5.6 mmol/L H2O2下）和8 h（2.8 mmol/L H2O2下）后完全釋放，釋放曲線遵循線性釋放動力學規(guī)律。Wang 等［50］設(shè)計了一種可生物降解的殼核胰島素貼片，胰島素經(jīng)PBA 上的H2O2敏感鍵修飾后被固定到PVA 基質(zhì)上，GOx 被封裝到丙烯酸化納米凝膠中，在H2O2存在的條件下，凝膠水解并釋放其中的胰島素。體外葡萄糖響應(yīng)性胰島素釋放實驗表明，在400 mg/dL 的高血糖水平下，納米凝膠在8 h 內(nèi)釋放H2O2達到9 mmol/L。同時微針的外殼裝載CAT，以消除H2O2對組織的損傷，化學誘導的1型糖尿病小鼠模型證明，這種具有生物反應(yīng)性核心和保護性外殼的智能胰島素貼劑可以有效地調(diào)節(jié)血糖水平，并改善生物相容性。

納米囊泡的結(jié)構(gòu)有利于藥物的包載和運送，為胰島素遞送的常見載體類型［51］。Hu 等［52］合成了一種H2O2響應(yīng)的兩親性嵌段共聚物，即聚乙二醇-苯硼酸酯共軛聚絲氨酸（mPEG-b-P（Ser-PBE））（圖4）。該共聚物自組裝成聚合物囊泡，GOx 和胰島素被包裹在聚合物囊泡的內(nèi)部，高葡萄糖水平下催化產(chǎn)生的H2O2能夠進一步打破苯基硼酸頻哪醇酯基的化學連接，使聚合物轉(zhuǎn)化為親水性的mPEG-b-PolySer，導致囊泡裂解并釋放藥物。用不同H2O2濃度（0、50、200 μmol/L）的PBS 緩沖液孵育載胰島素囊泡，檢測囊泡對H2O2的響應(yīng)能力，胰島素釋放隨H2O2濃度的增加而增加。該囊泡被整合到經(jīng)皮微針貼片中，實現(xiàn)了快速響應(yīng)、高載藥量（12.5%）、良好的生物相容性和無痛給藥。Chai等［6］開發(fā)了一種改良的胰島素傳遞系統(tǒng)，由聚丙烯酰胺苯硼酸及海藻酸鈉組成。葡萄糖易與材料中的環(huán)硼酸鹽反應(yīng)，導致其解體并形成親水的苯基硼酸鹽-葡萄糖復(fù)合物。此外，GOx 催化生成的H2O2將硼酸鹽氧化成苯酚，破壞碳硼鍵，最終導致載藥系統(tǒng)的破壞而釋放出藥物。在1.0 mmol/L H2O2溶液的孵育下，4 h 后載藥囊泡的胰島素釋放量達到80% 以上。該納米囊泡易于制備，具有優(yōu)良的葡萄糖反應(yīng)性及生物相容性。

Figure 4 Schematic of the H2O2-responsive vesicles for glucose-mediated insulin deliveryA: Chemical structure of mPEG-b-P(Ser-PBE) and its degradation products; B: Self-assembly of block copolymer into vesicles; C: PVs were further integrated into microneedle-array patches for smart insulin delivery

介孔二氧化硅納米顆粒（MSNs）具有較高的表面積、可調(diào)節(jié)的尺寸和孔隙參數(shù)［53］，被廣泛研究及應(yīng)用于藥物遞送。環(huán)糊精與疏水客體能形成主客體配合物，常用于構(gòu)建超分子結(jié)構(gòu)和功能材料。因此，將環(huán)糊精的主客體基團精確地結(jié)合到單分散二氧化硅上，可以形成具有預(yù)定義功能的雜化結(jié)構(gòu)，以滿足特定的功能。Xu等［54］采用4-（咪唑基氨基甲酸酯）苯基硼酸頻哪醇酯（ICBE）與環(huán)糊精（α-CD）進行主客體絡(luò)合改性，制得單分散二氧化硅微球，并將GOx 和胰島素封裝到微球中。約72.4% 的胰島素在H2O2濃度為5 mmol/L 時被釋放，在H2O2的存在下，單分散二氧化硅表面的苯硼酸酯被氧化，破壞了主客體絡(luò)合，導致載藥二氧化硅的分解，從而釋放預(yù)載胰島素。該二氧化硅微球具有高載藥量（13.2%），微針載體實現(xiàn)快速無痛給藥。

近年來，基于GOx 的葡萄糖敏感藥物遞送膜受到越來越多的關(guān)注。分層自組裝（LBL）薄膜制備簡便，薄膜厚度和滲透性便于控制。Yoshida 等［55］以PBA 修飾的聚烯丙胺（PAH）為原料，將PBA 修飾的PAH 與草酸（SA）修飾PAH 通過硼酸酯鍵結(jié)合，制備了H2O2響應(yīng)薄膜，并將PAH/GOx/（SAPAH/PBA-PAH）5膜涂附于碳酸鈣微粒表面。在H2O2存在下硼酸酯鍵斷裂，導致薄膜分解釋放藥物。以0.1 mmol/L H2O2、1 mmol/L H2O2和10 mmol/L H2O2分別作用60、60和20 min后，薄膜的分解百分率分別為13%、81% 和94%。在10 mmol/L 葡萄糖存在的情況下，1 mg的顆粒釋放出多達10 μg 的胰島素，顯示出良好的胰島素遞送性能。

2 多重響應(yīng)

在基于GOx 的葡萄糖響應(yīng)性給藥過程中，葡萄糖催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2會阻止反應(yīng)繼續(xù)發(fā)生，并且長期使用可能導致自由基誘導的皮膚組織損傷。隨著H2O2濃度的升高，GOx 類藥物載體的葡萄糖敏感性受到限制。因此，及時分解產(chǎn)生的H2O2對于葡萄糖的快速響應(yīng)、保持GOx 的酶活性、維持長效給藥時間十分關(guān)鍵。對于單一響應(yīng)系統(tǒng)，常使用過氧化氫酶清除H2O2并增加O2的含量，但相應(yīng)的多酶系統(tǒng)不夠穩(wěn)定，葡萄糖敏感性較低。而葡萄糖多重響應(yīng)系統(tǒng)能夠克服上述缺點，在材料中引入H2O2響應(yīng)或缺氧敏感基團，使載藥系統(tǒng)因H2O2或缺氧敏感基團的破壞而改變，最終在葡萄糖的觸發(fā)下，胰島素的有效荷載得以釋放［11］。

2.1 葡萄糖和H2O2雙響應(yīng)

苯硼酸能夠與含高親和力的二醇類化合物結(jié)合，形成可逆的硼酸酯鍵，表現(xiàn)出對電荷密度、離子強度、二醇類化合物、pH 等外部刺激的響應(yīng)性［53］，是近年來使用最為頻繁的葡萄糖響應(yīng)和H2O2雙響應(yīng)的材料。Tong 等［56］用聚乙二醇、聚苯基硼酸和聚苯基硼酸頻哪醇酯合成了葡萄糖和H2O2雙響應(yīng)性的三嵌段聚合物囊泡，并通過微針貼片經(jīng)皮給藥。該囊泡內(nèi)載有胰島素和GOx，酶催化產(chǎn)生的H2O2使苯硼酸從嵌段物上釋放，體外刺激響應(yīng)胰島素釋放實驗表明，載藥囊泡在0.5 mmol/L H2O2的PBS 緩沖液中，5 h 內(nèi)釋放的胰島素累積達80%。該給藥系統(tǒng)實現(xiàn)了無痛給藥、快速響應(yīng)、生物相容性高的目標。

Wang 等［57］合成了裝載胰島素和GOx 的葡萄糖雙響應(yīng)納米粒，3-丙烯酰胺苯硼酸（PAAPBA）和聚乙二醇嵌段聚（天冬氨酸-co-葡萄糖胺）（PEG-b-P（Asp-co-AGA））通過環(huán)硼酸鹽形成動態(tài)共價鍵，在高血糖時環(huán)硼酸鹽被葡萄糖的糖基破壞，并被H2O2氧化，導致胰島素的快速釋放。在pH 7.4 的不同H2O2濃度下，載胰島素納米粒的胰島素釋放隨著H2O2濃度遞增，且10 h 內(nèi)在1.0 mmol/L H2O2的胰島素釋放約為90%。細胞毒性、溶血實驗和組織學分析表明，該納米顆粒具有良好的生物相容性和安全性，并具有15 h的長效降低血糖效果。

除納米粒外，聚合物膠束也是常用的載體形式。Liu 等［14］制備了葡萄糖及H2O2雙響應(yīng)聚合物膠束，由聚乙二醇嵌段聚氨基苯硼酯（PEG-b-PAPBE）自組裝而成，其中親水的PEG 提供外殼結(jié)構(gòu)，疏水的PAPBE 賦予聚合物膠束對葡萄糖和H2O2的雙重敏感性。內(nèi)部的苯基硼酸酯（PBE）被葡萄糖降解，同時也被H2O2水解，從而導致聚合膠束的解體，釋放出包裹的胰島素。通過對游離GOx、負載GOx 的聚合物膠束（PMs-GOx）產(chǎn)生的H2O2進行測定，發(fā)現(xiàn)游離GOx 的H2O2濃度在1 h 內(nèi)迅速上升至90 μmol/L，而對于PMs-GOx，H2O2在1 h內(nèi)的積累量僅為15 μmol/L，因此對GOx 的包載能夠明顯減輕H2O2對動物組織的危害。

2.2 缺氧和H2O2雙響應(yīng)

另一種葡萄糖響應(yīng)給藥的策略是合成缺氧和H2O2雙響應(yīng)聚合物。Yu等［43］創(chuàng)新性地設(shè)計了一種裝載胰島素和GOx 的自組裝聚合物（圖5），該雙嵌段共聚物由2-硝基咪唑修飾的聚乙二醇和聚絲氨酸經(jīng)硫醚基團修飾而成。在GOx 介導的葡萄糖氧化過程中，所產(chǎn)生的局部缺氧環(huán)境促進2-硝基咪唑還原為親水的2-氨基咪唑，而作為H2O2敏感基團的硫醚被H2O2轉(zhuǎn)化為砜，增加聚合物的親水性。在高血糖下，聚合物化學結(jié)構(gòu)的變化促進了聚合體的解離和胰島素的釋放。該納米囊泡能夠清除過量的H2O2，該系統(tǒng)方便無痛給藥，實現(xiàn)快速的葡萄糖響應(yīng)，在改善小鼠血糖水平的同時，將副作用降到最小。采用熒光H2O2檢測試劑盒評估雙重響應(yīng)性囊泡（d-GRP）和葡萄糖響應(yīng)性囊泡（GRP）產(chǎn)生的H2O2的能力，發(fā)現(xiàn)在相同時間內(nèi)，1 mg/mL 的GRP 溶液釋放H2O25 μmol/L，而1 mg/mL 的d-GRP溶液釋放H2O23 μmol/L，能顯著減輕H2O2的傷害。

2.3 pH和H2O2雙響應(yīng)

葡萄糖在GOx 的催化下，產(chǎn)生局部pH 和H2O2升高的現(xiàn)象，故pH 和H2O2的聯(lián)合響應(yīng)具有十分重要的意義［58］。Zhang等［59］報道了一種H2O2和pH 級聯(lián)反應(yīng)的微針陣列貼片，其基質(zhì)核心填充了封裝GOx 的不可降解的納米膠束（GOx-NCs），以及封裝胰島素的可降解膠束（Ins-NCs），該膠束是由H2O2敏感的PBA 和帶正電荷的兩親性嵌段共聚物自組裝而成。不可降解的膠束團能夠有效延長GOx 的酶活性。在含400 mg/dL葡萄糖的PBS中，5 h內(nèi)由GOx-NCs 催化生成的H2O2為8 μmol/L。高血糖下GOx 催化產(chǎn)生的H2O2破壞了膠束的穩(wěn)定，減少陽離子聚合物與胰島素之間的靜電相互作用，從而快速釋放胰島素。

利用兩親性宿主-客體自組裝形成囊泡的原理，Zou 等［30］設(shè)計了一種基于超分子的多重刺激響應(yīng)式胰島素給藥平臺，由柱［5］芳烴和二苯基硼酸衍生物自組裝形成，并裝載胰島素和GOx，該超分子囊泡對原位生成的H2O2和低pH 環(huán)境具有響應(yīng)性。二苯基硼酸與親水葡萄糖結(jié)合導致囊泡曲率半徑的改變，使其部分解體并釋放胰島素。同時，高血糖形成的局部高濃度的葡萄糖酸進一步導致柱［5］芳烴質(zhì)子化，水溶性降低，加速了胰島素的釋放。在H2O2濃度為3 mmol/L 和12 mmol/L 的熒光標記囊泡組中，囊泡的熒光強度逐漸減少，表明囊泡的解離程度隨H2O2濃度的增加而加大。此系統(tǒng)的超分子囊泡具有快速響應(yīng)、可控給藥、生物相容性良好等優(yōu)點，有助于連續(xù)血糖監(jiān)測的納米治療平臺的開發(fā)。

Figure 5 A: Schematic of the hypoxia and H2O2 dual-sensitive insulin delivery system; B: Schematic of local inflammation induced by non-H2O2-senstive GRP and the long-term side effect associated with inflammation

3 總結(jié)與展望

基于GOx 的葡萄糖響應(yīng)型胰島素給藥系統(tǒng)能夠根據(jù)血糖水平的升高自發(fā)而可控地釋放胰島素，已成為糖尿病治療的熱點之一，并取得了一系列進展。單一的葡萄糖響應(yīng)系統(tǒng)適應(yīng)不同個體特定的葡萄糖水平，而多重響應(yīng)系統(tǒng)則具有更加長效、穩(wěn)定的血糖控制。迄今為止，基于GOx 的葡萄糖響應(yīng)系統(tǒng)已在相關(guān)生理條件和動物實驗研究中得到驗證。此外，其他響應(yīng)系統(tǒng)如PBA、葡萄糖結(jié)合分子的優(yōu)良性能也得到了很好的探究，這些系統(tǒng)有望為糖尿病的治療提供個性化的方案。然而，目前仍缺乏臨床試驗數(shù)據(jù)來評估葡萄糖響應(yīng)性胰島素給藥系統(tǒng)的毒性和療效［60］。

葡萄糖響應(yīng)性胰島素輸送系統(tǒng)面臨的挑戰(zhàn)如下。

（1）生物相容性問題。理想的響應(yīng)材料應(yīng)無嚴重的體內(nèi)毒性及長期不良反應(yīng)。GOx 催化葡萄糖氧化為葡萄糖酸和H2O2，后者可引起炎癥反應(yīng)甚至嚴重的組織損傷?，F(xiàn)有的許多生物可降解和生物相容的材料，如聚丙烯酸和多糖，常被用于制備基于GOx 的基質(zhì)。一些策略有望減輕H2O2的傷害，如在PBA 和GOx 的雙重響應(yīng)系統(tǒng)中，GOx 催化產(chǎn)生的H2O2與PBA 反應(yīng)，從而消耗H2O2。此外，基于GOx 和PBA 的反應(yīng)系統(tǒng)能夠維持長達十幾個小時的降糖效果，具有更加迅速的葡萄糖響應(yīng)性［61］。

（2）可靠性問題。在GOx 系統(tǒng)的療效驗證過程中，實驗水平的體外緩沖液與糖尿病小鼠體內(nèi)真實的生理環(huán)境存在一定的差異，突發(fā)釋放、葡萄糖響應(yīng)率、低血糖等問題成為阻礙臨床研究的重要因素。

（3）酶活性問題。在長期葡萄糖觸發(fā)的胰島素輸送過程中，GOx 的生物活性應(yīng)得以保持。而GOx藥物在制備和儲存過程中，常出現(xiàn)生物活性下降的現(xiàn)象。酶的處理過程中采用簡化的制備方法，有利于維持GOx的活性。

（4）敏感性問題。在GOx 氧化葡萄糖的過程中，由于生成H2O2和消耗O2，響應(yīng)載體對葡萄糖的敏感性降低。已有一些策略用于提高葡萄糖的敏感性，如將GOx 與CAT 或血紅蛋白結(jié)合［62］以消耗H2O2，使用H2O2敏感、缺氧敏感或缺氧和H2O2雙敏感聚合物等。

在醫(yī)學及臨床領(lǐng)域，GOx在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面也發(fā)揮著重要作用。如采用葡萄糖氧化酶法診斷妊期糖尿病，檢測糖化血紅蛋白含量以預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥，聯(lián)合NO 療法治療糖尿病腎病［63］等。在未來，GOx 介導的胰島素及其類似物遞送策略和診斷方法將在治療糖尿病方面發(fā)揮更大的作用。