喜馬拉雅旱獺線粒體基因組與低氧適應(yīng)研究進(jìn)展

南新營,李 優(yōu),李耀東

青海大學(xué),西寧 810016

高原低氧適應(yīng)是指世居高原的人或者動物為能在高原環(huán)境中生存,經(jīng)長期自然選擇所產(chǎn)生的一種非可逆但能穩(wěn)定遺傳的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化等方面的改變,是機(jī)體為適應(yīng)高原低氧環(huán)境而形成的一種保護(hù)機(jī)制。青藏高原是世界上最高的高原,有“世界屋脊”之稱,平均海拔在4 000米以上,總面積約240萬平方公里,生活著大約210種野生哺乳動物,占全國總種數(shù)的50%左右,為人類提供了高原自然界的原始“本底”,為開展有關(guān)青藏高原生物學(xué)、高原醫(yī)學(xué)、動植物遺傳多樣性及保護(hù)等學(xué)科的研究,提供了理想的基地和天然實(shí)驗(yàn)室。目前學(xué)者對于高原低氧適應(yīng)的研究多集中于藏羊[1]、藏豬[2]、藏雞[3]、牦牛[4]、高原鼠兔[5]、蜥蜴[6]等物種。

1 旱獺的分類與分布

旱獺,又名土撥鼠、草地獺、哈拉、雪豬、曲娃(藏語)等,屬哺乳綱(Mammalia),嚙齒目(Rodentia),松鼠科(Sciuridae),旱獺屬(Marmota),其體形肥大,是松鼠科中體型最大的一種,成年旱獺體重可達(dá)3.9～9 kg,頸部粗短,耳殼短小,四肢短粗,尾短而扁平,體背棕黃色,是陸生和穴居的草食性、冬眠性野生動物,主要棲息于山地的陽坡、階地、谷地、山麓平原等環(huán)境,過家族生活,個體接觸密切[7]。

目前世界上已知的旱獺屬動物有14種,我國有4種,分別是蒙古旱獺、長尾旱獺、喜馬拉雅旱獺、阿爾泰旱獺[8]。其中喜馬拉雅旱獺是分布范圍最廣、數(shù)量最多的一種,主要棲息于海拔2 500～5 000 m范圍的高山草地和草原,廣泛分布于我國的青藏高原及毗鄰的印度、尼泊爾及巴基斯坦等地的各類高寒草甸草原[9],寄居洞穴可深達(dá)十?dāng)?shù)米,在這樣極低的氧分壓下,依然有很強(qiáng)的生理代謝能力和生殖能力。

2 線粒體基因組與低氧適應(yīng)研究

線粒體基因組具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),存在于幾乎所有動物的各組織細(xì)胞內(nèi),由于其基因組較小、基因結(jié)構(gòu)及排列簡單、多拷貝、易于分離、嚴(yán)格的母系遺傳、mtDNA序列在同一個體內(nèi)為單倍型、沒有種內(nèi)重組、無內(nèi)含子及非編碼序列少(D-loop環(huán)除外),已成為生物進(jìn)化研究的非常有用的分子標(biāo)識和最適遺傳標(biāo)志[10]。在1981年Anderson等測定出人類的線粒體基因組全序列以來[11],已有十余種哺乳動物的線粒體基因組全序列被測定出來,用以研究這些動物的遺傳結(jié)構(gòu)和起源分化[12]。Chao等[13]通過對喜馬拉雅旱獺線粒體基因組測序,已獲得喜馬拉雅旱獺線粒體基因組全序列(序列號:JX069958) ,該報(bào)告顯示喜馬拉雅旱獺線粒體基因組長度為16 443bp,由13個蛋白編碼基因、2個核糖體RNA(rRNA)基因、22個轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)基因和一個典型的控制區(qū)組成,13個編碼蛋白質(zhì)的功能基因包括7個NADH脫氫酶復(fù)合體基因(ND1-ND6,ND4L),1個細(xì)胞色素b基因(cytB),3個細(xì)胞色素氧化酶復(fù)合體基因(COX1-COX3),2個ATP合成酶復(fù)合體基因(ATPase6、ATPase8)。這是松鼠科第一個完整線粒體基因組的報(bào)告,為該物種的遺傳功能及進(jìn)化分析提供了理論依據(jù)。

過去學(xué)者關(guān)于喜馬拉雅旱獺對低氧適應(yīng)的研究多集中在生理、生化、形態(tài)方面,賈榮莉[14]認(rèn)為喜馬拉雅旱獺的紅細(xì)胞數(shù)目及心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能與生化酶均未受到高原低氧的不良影響,表明其對高原低氧有很好的適應(yīng)性。馬嵋等[15]研究顯示,新疆灰旱獺為適應(yīng)高原低氧環(huán)境,與SD大鼠相比較,其心肌細(xì)胞明顯肥大,體重指數(shù)、右心室肥厚指數(shù)及纖維化程度也明顯增高,右心室發(fā)生重構(gòu)。馬英等[16]對喜馬拉雅旱獺DNA控制區(qū)研究表明地理隔離是影響其種群動態(tài)變化的主要因素。何建等[17]實(shí)驗(yàn)表明喜馬拉雅旱獺的平均紅細(xì)胞體積(MCV)隨海拔增高而降低,血小板(PLT)隨海拔增高而增加,且不同海拔地區(qū)的心肺組織切片均有不同程度的損傷。

線粒體能量代謝在生物進(jìn)化和物種形成過程中起著重要作用。早在1992年Wallace[18]提出人類mtDNA編碼的13個氧化磷酸化必需基因的變異可能是人類適應(yīng)缺氧的遺傳因素之一。為了驗(yàn)證這一說法,1994年Torroni[19]采用兩種方法來確定高海拔地區(qū)人群mtDNA變異的性質(zhì)是否與他們對高海拔的適應(yīng)有關(guān)。第一種是比較生活在不同海拔(4 500 m,3 600 m,3 000 m)的藏族人mtDNA變異,在此比較中,單倍型和單倍群在海拔高度上均無顯著差異,此外在多個受試者單倍型(AS62,AS65,AS131,AS143,ASA53)在不同海拔高度的藏族個體中進(jìn)行觀察,結(jié)果mtDNA單倍型與不同海拔之間沒有聯(lián)系,當(dāng)然這并不排除特定的mtDNA基因型有助于適應(yīng)高海拔的可能性,因?yàn)樗械难芯繕颖径紒碜杂谙鄬^高的海拔(3 000 m以上)；第二種是通過比較藏族人和其他亞洲人mtDNA單倍型和單倍群的頻數(shù)分析表明在高海拔地區(qū)任何單倍群均未出現(xiàn)大的選擇壓力。這兩種方法證實(shí)mtDNA突變不太可能在藏族人適應(yīng)高海拔的過程中起主要作用。

NADH脫氫酶又稱復(fù)合體Ⅰ或NADH-泛醌還原酶,是線粒體呼吸鏈中第一個也是最大的酶復(fù)合物[20],它接收從NADH氧化得到的電子并轉(zhuǎn)移給泛醌,發(fā)生在該復(fù)合物中的殘基取代可干擾質(zhì)子泵傳送效率從而影響代謝表現(xiàn)[21]。Shi等[22]研究表明mt-ND1和mt-ND2基因的遺傳多樣性與高原適應(yīng)相關(guān),可作為與高海拔適應(yīng)相關(guān)的候選基因。Zhou等[23]研究發(fā)現(xiàn)ND2、ND4、ATPase6在鳥類適應(yīng)高海拔過程中有積極選擇的重要證據(jù)。Bao等[24]在藏雞品種中發(fā)現(xiàn)了NADH脫氫酶mt-ND5亞基的錯義突變,通過測定不同基因型藏雞的線粒體呼吸控制率(RCR)和NADH脫氫酶活性,發(fā)現(xiàn)缺氧條件下藏雞ND5基因突變與線粒體呼吸功能密切相關(guān),認(rèn)為ND5是藏雞適應(yīng)低氧環(huán)境的候選基因。LiYu等[25]對2只中國高海拔地區(qū)(3 500 m)和其他8只越南東部低海拔地區(qū)(750 m)塌鼻猴線粒體基因組進(jìn)行測序,在中國塌鼻猴ND2和ND6中分別發(fā)現(xiàn)了2個重要的適應(yīng)性突變位點(diǎn)(533和3 307),認(rèn)為可能是中國塌鼻猴適應(yīng)低氧環(huán)境的突變位點(diǎn)。Xu等[26]對不同海拔(4 500 m,3 300 m,3 100 m)3匹藏馬線粒體基因組進(jìn)行測序分析,發(fā)現(xiàn)ND6基因在3匹馬中都具有較高的非同義突變率,表明ND6基因可能在西藏馬的高海拔適應(yīng)過程中起重要作用。Dehean等[27]在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),編碼線粒體ND6基因的T14634C發(fā)生突變,預(yù)測這種突變會破壞ND6蛋白的構(gòu)象,從而使細(xì)胞對低氧敏感喪失應(yīng)答能力。Luo等[28]在高原鼠兔的低氧適應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)在3只鼠兔的mtDNA編碼蛋白中,有186個基因內(nèi)氨基酸變異,鑒定出15種鼠兔專有氨基酸變異,且這些氨基酸在11種非鼠兔哺乳動物和人類的系統(tǒng)發(fā)育分析中都是100%保守的,受影響的鼠兔基因包括cytB、COX1、COX2、ND2、ND3、ND5和ND6,推測這些氨基酸位點(diǎn)的變異可能是鼠兔適應(yīng)低溫低氧環(huán)境的遺傳基礎(chǔ)。

細(xì)胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase,COX)即復(fù)合物Ⅳ,是呼吸鏈中的末端復(fù)合物,是氧化磷酸化過程中氧獲取和利用的唯一部位。真核細(xì)胞中COX由9～13個亞基多肽組成,三個線粒體編碼的亞基,即COX1-3構(gòu)成催化核心,它包含4個氧化還原中心,即COX1中的CuB、Hema、Hema3和COX2中的CuA,并催化電子從細(xì)胞色素c轉(zhuǎn)化為分子氧,其他亞基是核編碼的,在組裝和穩(wěn)定全酶和調(diào)節(jié)COX活性方面具有重要的作用[29]。COX催化氧的末端還原,可能是高海拔適應(yīng)過程中一個特別重要的選擇目標(biāo)。Zhang[30]等對青藏高原和華北地區(qū)遷徙蝗蟲種群的線粒體做缺氧處理,發(fā)現(xiàn)只有在西藏蝗蟲中COX表現(xiàn)出明顯較高的活性,且COX活性的增強(qiáng)不是由蛋白質(zhì)引起的,而是由COX的鐵細(xì)胞色素親和力的增加和通過催化氧化還原中心的電子傳輸效率的增加而導(dǎo)致催化效率提高,表明COX的功能調(diào)節(jié)是西藏蝗蟲適應(yīng)高原缺氧的基礎(chǔ)。Scott等[31]為避免后天環(huán)境因素的干擾,將斑頭雁和2個親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種在低海拔地區(qū)統(tǒng)一飼養(yǎng),并對3個品種代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)斑頭雁的COX功能有很大差異,斑頭雁的COX最大酶活性顯著低于低海拔品種,繼而對COX1-4亞基蛋白和mRNA進(jìn)行定量比較,發(fā)現(xiàn)3個品種之間的4個基因表達(dá)量沒有明顯差異,排除了酶表達(dá)量變化對COX酶活性的影響因素,又對COX 的4個亞基基因進(jìn)行測序,結(jié)果一個非同義突變位點(diǎn)在斑頭雁的COX3序列上被發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致COX3的第116位氨基酸殘基由Trp突變成了Arg,這種突變在脊椎動物中屬于保守位點(diǎn),通過結(jié)構(gòu)模型預(yù)測該突變可能改變了COX1和COX3亞基之間的相互作用,降低了氧化磷酸化對細(xì)胞內(nèi)缺氧的敏感性,從而適應(yīng)極度缺氧環(huán)境。

ATP合酶(ATPsynthase)即復(fù)合物Ⅴ,由F0和F1兩個功能域組成,與復(fù)合物Ⅰ-Ⅳ一起成為氧化磷酸化過程中ATP產(chǎn)生的基礎(chǔ)[32]。李耀東等[33]通過比較喜馬拉雅旱獺與平原地區(qū)同種動物松鼠線粒體ATPase6基因表達(dá)的差異,認(rèn)為旱獺組ATPase6基因的表達(dá)高于松鼠組,且旱獺組大都有ATPase6基因片段點(diǎn)突變。Zhao等[34]在藏雞的ATPase6基因中檢測到6個SNPs,發(fā)現(xiàn)1個錯義突變(9441G>A),導(dǎo)致了氨基酸的替換,推測該突變可能在藏雞能量轉(zhuǎn)換和代謝中起重要作用。李娜等[35]研究發(fā)現(xiàn)不同物種間高海拔地區(qū)西藏沙蜥線粒體基因組中蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)化最快,不同基因間ATPase8進(jìn)化速率最快,且在ATPase8基因上存在兩個正選擇位點(diǎn),因此認(rèn)為ATPase8可能在西藏沙蜥高海拔適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞色素b(cytochrome b) 是復(fù)合物Ⅲ的一個催化活性亞基,兩端有2個CoQ結(jié)合位點(diǎn),其中一個是位于細(xì)胞質(zhì)側(cè)的QH2氧化位點(diǎn)Q0,與低電位的細(xì)胞色素bL有關(guān),另一個是基質(zhì)側(cè)的Q還原位點(diǎn)Qi,與高電位細(xì)胞色素bH有關(guān)[36]。目前未見有關(guān)于細(xì)胞色素b與低氧適應(yīng)相關(guān)的報(bào)道。

3 展 望

近年來,高原世居動物的低氧適應(yīng)分子機(jī)制已成為高原醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn),目前國內(nèi)外關(guān)于動物線粒體基因組對高原低氧適應(yīng)的研究已取得初步成果,但仍未全面解析高原動物線粒體基因組適應(yīng)低氧環(huán)境的分子機(jī)制。喜馬拉雅旱獺能良好地適應(yīng)高原低氧、低溫等氣候,是研究高原低氧適應(yīng)機(jī)制的理想動物模型。高通量測序技術(shù)加速了線粒體基因組的測序,揭示了真核生物組織結(jié)構(gòu)、基因內(nèi)容、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄模式的多樣性,為學(xué)者從分子層面研究該機(jī)制提供了更為便捷有效的途徑。學(xué)者應(yīng)結(jié)合目前研究成果,從DNA-RNA-蛋白質(zhì)水平深入了解線粒體基因組在低氧適應(yīng)過程中的重要作用。明確喜馬拉雅旱獺低氧適應(yīng)的分子機(jī)制不僅有助于該物種種群多樣性的保護(hù),更為高原疾病的預(yù)防和治療提供了新的方向和思路。