基于指紋圖譜及一測多評法的芍藥甘草湯 物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量評價(jià)研究

劉紫璇，吳樣明，蔣鑫鋮，季巧遇，*，李詒光，（.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004；.江中藥業(yè)股份有限公司，南昌 330004）

芍藥甘草湯收錄于國家中醫(yī)藥管理局會(huì)同國家藥品監(jiān)督管理局制定并公布《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[1]。芍藥甘草湯出自漢代張仲景所著《傷寒論》，可養(yǎng)陰柔肝、緩急止痛?，F(xiàn)代藥理研究表明，芍藥甘草湯多以加減方應(yīng)用于治療解痙抗炎鎮(zhèn)痛[2]。國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定》在借鑒日本漢方藥管理經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，引入了物質(zhì)基準(zhǔn)的管理要求，以其作為質(zhì)量控制的基準(zhǔn)[3]。

在中藥制劑質(zhì)量控制方面，關(guān)鍵是有效性和安全性。由于中藥作用的整體性，中藥成分和作用機(jī)制的復(fù)雜性，多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)已成為行業(yè)的共識。目前，一測多評（QAMS）法多應(yīng)用于中藥材及中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量評價(jià)[4-6]。本實(shí)驗(yàn)采用QAMS法，以芍藥苷作為參照物，建立其他已知成分相對于參照物的相對校正因子，可同時(shí)測定8種成分的含量。建立了芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜并進(jìn)行相似度評價(jià)，以分析不同批次間樣品的質(zhì)量差異，為芍藥甘草湯的質(zhì)量評價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent 1260 Infinity 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Milli-Q IQ 7000超純水儀（美國Millipore公司）；MSA224S-1CE-DA型萬分之一分析天平、CPA225D型十萬分之一分析天平、MSA6.6S-OCE-DM型百萬分之一分析天平（德國sartorius 公司）；SB-500DTY型掃頻超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 試藥

芍藥苷（批號：110736-202044，純度：96.8%）、甘草苷（批號：111610-201908，純度：95%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，純度：96.2%）對照品（中國食品藥品檢定研究院）；芍藥內(nèi)酯苷（批號：19121705，純度：99.28%）、芹糖甘草苷（批號：20081705，純度：98%）、異甘草苷（批號：17042102，純度：98%）對照品（成都普菲德公司）；苯甲酰芍藥苷（批號：ST05580220，純度：95%）、甘草素（批號：ST07000120，純度：98%）對照品（上海Standard公司）；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸為分析純，水為超純水。經(jīng)考證，芍藥甘草湯中所用白芍和甘草為毛茛科植物芍藥Peaonia lactifloraPall.的干燥根和豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖，其中甘草的炮制方法為清炒[7-10]。15批芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)所用白芍和甘草藥材經(jīng)江中藥業(yè)股份有限公司鑒定人員謝斌鑒定為毛茛科植物芍藥Peaonia lactifloraPall.的干燥根和豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖，由江中飲片廠炮制。飲片信息見表1。

表1 樣品信息 Tab 1 Information of sample

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%～ 20%A；10～22 min，20%A；22～35 min，20%～40%A；35～50 min，40%A）；檢測波長230 nm；流速1.0 mL·min－1；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、苯甲酰芍藥苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為40.457、223.751、18.953、83.866、16.299、2.094、7.783、158.763 mg·mL－1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)的制備 芍藥甘草湯記載于漢代張仲景所著的《傷寒雜病論》，“白芍藥、甘草各四兩（炙）。上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分溫再服?！比“咨诛嬈?、甘草飲片各約 55.2 g，加水 600 mL 浸泡 30 min，加熱至沸騰，保持沸騰，煮至 300 mL，趁熱過濾，減壓濃縮，凍干，即得芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉。缺白芍樣品和缺炙甘草樣品的凍干粉，按上述方法制備。

2.3.2 供試品溶液的制備 取芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加入70%甲醇適量，超聲（600 W，40 Hz）30 min，放冷，定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系考察 將“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液按對半稀釋法稀釋4次，得到不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，以質(zhì)量濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 各成分的線性關(guān)系考察結(jié)果 Tab 2 Linear regression of 8 components

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積和保留時(shí)間，結(jié)果7種成分相對于芍藥苷的相對保留時(shí)間RSD均小于0.5%，8種成分峰面積RSD均小于0.96%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積和保留時(shí)間，結(jié)果7種成分相對于芍藥苷的相對保留時(shí)間RSD均小于0.13%；芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、苯甲酰芍藥苷、甘草酸的平均含量分別為1.15%、4.47%、0.55%、1.96%、0.37%、0.06%、0.18%、3.62%，RSD分別為0.61%、0.53%、1.3%、0.67%、1.0%、1.1%、0.59%、0.53%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別于0、2、4、8、10、12、24、48 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算得到結(jié)果7種成分相對于芍藥苷的相對保留時(shí)間RSD均小于0.11%，相對峰面積RSD均小于1.9%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉6份，每份約0.05 g，精密稱定，分別精密加入混合對照品溶液適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、苯甲酰芍藥苷、甘草酸的平均加樣回收率分別為100.02%、

99.26 %、100.91%、99.58%、99.29%、97.97%、93.83%、102.88%，RSD分 別 為0.40%、0.32%、0.79%、0.40%、0.67%、0.87%、0.92%、3.5%。

2.5 QAMS的建立

2.5.1 相對校正因子的計(jì)算 以芍藥苷為內(nèi)標(biāo)物，采用多點(diǎn)校正法計(jì)算相對校正因子[11-12]。fi/s＝fi/fs＝CiAs/AiCs，公式中Ci為待測成分的質(zhì)量濃度，Ai為待測成分峰面積，As為內(nèi)標(biāo)物對照品峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)物對照品濃度。取同一混合對照品溶液，分別進(jìn)樣5、10、15、20 μL，記錄8種成分色譜峰面積，計(jì)算芍藥內(nèi)酯苷、芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、苯甲酰芍藥苷、甘草酸的fi/s分別為1.146、0.756、0.532、0.850、0.311、0.634、3.656。

2.5.2 相對校正因子耐用性考察

① 儀器和色譜柱對相對校正因子的影響：考察不同色譜柱（Dikma diamonsil C18，Thermo Syncronis C18，Agilent zorbax SB-C18，規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm） 在Thermo U3000和Agilent 1260色譜儀上的相對校正因子，結(jié)果各成分相對校正因子的RSD＜3.0%，表明儀器和色譜柱對各成分的相對校正因子無顯著影響。

② 流速對相對校正因子的影響：考察不同流速（0.8、1.0、1.2 mL·min－1）下各化合物的相對校正因子，結(jié)果各成分相對校正因子的RSD＜2.0%，表明流速對各成分相對校正因子無顯著影響。

③ 柱溫對相對校正因子的影響：考察不同柱溫（25、30、35℃）下各化合物的相對校正因子，結(jié)果各成分相對校正因子的RSD＜3.0%，表明柱溫對各成分相對校正因子無顯著影響。

2.6 待測成分色譜峰的定位

相對保留時(shí)間法是QAMS法普遍采用的色譜峰定位方法[13-15]。以相對保留時(shí)間進(jìn)行色譜峰定位時(shí)，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷和異甘草苷5個(gè)待測成分的RSD小于3%，苯甲酰芍藥苷和甘草酸的RSD超過了5%，表明相對保留時(shí)間對于距內(nèi)參峰芍藥苷較遠(yuǎn)的峰的定位效果較差。若采用兩點(diǎn)校正法，選取芍藥苷和甘草酸進(jìn)行兩點(diǎn)校正[16-17]，僅有個(gè)別數(shù)據(jù)RSD大于5%，定位效果較好。

2.7 QAMS法與其他測定方法結(jié)果的比較

將15批芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液注入高效液相色譜儀測定，分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法、外標(biāo)一點(diǎn)法和QAMS法計(jì)算各待測成分的含量，結(jié)果見表3。采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法和QAMS法得到的含量之間無明顯差異，說明QAMS法在芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)含量測定研究中基本可行。

表3 8種成分不同方法含量測定結(jié)果 Tab 3 Content of 8 components by different methods

2.8 指紋圖譜的建立與相似度分析

2.8.1 指紋圖譜的建立 將15批芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，以S1色譜圖為參照圖譜，中位數(shù)法譜峰匹配，確定了13個(gè)共有峰，指認(rèn)出8個(gè)共有峰，分別為4號峰芍藥內(nèi)酯苷、5號峰芍藥苷、7號峰芹糖甘草苷、8號峰甘草苷、10號峰異甘草苷、11號峰甘草素、12號峰苯甲酰芍藥苷、13號峰甘草酸，見圖1和圖2。

圖1 樣品（A）、混合對照品（B）和空白溶劑（C）HPLC圖Fig 1 HPLC chromatogram of sample（A），mixed reference substances（B）and solvent blank（C）

圖2 樣品（A）、缺甘草陰性樣品（B）和缺白芍陰性樣品（C）HPLC圖Fig 2 HPLC chromatograms of sample（A），negative sample without licorice substances（B）and negative sample without Radix Paeoniae Alba（C）

2.8.2 芍藥甘草湯指紋圖譜相似度評價(jià) 對15批芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)，結(jié)果顯示15批樣品相對于對照圖譜的相似度 分 別 為0.994、0.995、0.987、0.995、0.987、0.986、0.984、0.975、0.961、0.984、0.950、0.966、0.990、0.981、0.962，均大于0.96，表明15批物質(zhì)基準(zhǔn)之間差異性較小，樣品疊加圖見圖3。

圖3 15批次芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)HPLC圖及對照指紋圖譜Fig 3 HPLC chromatograms and reference fingerprint chromatogram of the substance benchmarks of Shaoyao Gancao decoction

續(xù)表3

3 討論

本研究采用多點(diǎn)校正法計(jì)算相對校正因子，有關(guān)文獻(xiàn)記載采用斜率校正法，即以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值計(jì)算相對校正因子，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好，斜率與截距之比大于100時(shí)，斜率校正法計(jì)算得到的校正因子才具有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性[18-19]。

有文獻(xiàn)認(rèn)為，考察重現(xiàn)性以RSD＜5%的峰進(jìn)行定位[20]。但以相對保留值或保留時(shí)間差來定位時(shí)，保留時(shí)間較長的成分理論值與實(shí)測值RSD較大，并不能準(zhǔn)確定位。本試驗(yàn)采用兩點(diǎn)校正法，選用內(nèi)參物芍藥苷和保留時(shí)間靠后的甘草酸進(jìn)行兩點(diǎn)校正，能得到較好的定位效果。

本研究采用QAMS法，同時(shí)測定芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、苯甲酰芍藥苷和甘草素8個(gè)成分。在含量測定的基礎(chǔ)上，建立指紋圖譜，15批樣品指紋圖譜相似度均在0.96以上，表明不同批次物質(zhì)基準(zhǔn)的化學(xué)成分具有較好的一致性。QAMS法結(jié)合指紋圖譜的方法能更全面地評價(jià)芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量，可為經(jīng)典名方開發(fā)過程中的質(zhì)量控制提供參考。