白屈菜紅堿固體脂質(zhì)納米粒的制備及其體外釋放研究

趙義軍，葉曉楠，林春盛，孫健，車(chē)明徽，侯立強(qiáng)（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001）

白屈菜紅堿（chelerythrine，CHE）為苯并菲啶型生物堿，當(dāng)處于常溫條件時(shí)，其存在形式為淺白色或淡黃色粉末，主要分布在白屈菜、博落回、飛龍掌血與血水草等藥用植物的葉、根內(nèi)。白屈菜紅堿在有絲分裂中能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分布周期，由此有效阻滯腫瘤細(xì)胞增殖周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促使腫瘤細(xì)胞凋亡，如對(duì)胃癌、肝癌、肺癌細(xì)胞均效果顯著[1-2]。但由于該化合物溶解度極低，半衰期短、在體內(nèi)代謝較快，易出現(xiàn)不良反應(yīng)，導(dǎo)致其應(yīng)用存在一定局限性。為了解決上述問(wèn)題，應(yīng)合理延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，減慢藥物的釋放速度。

經(jīng)文獻(xiàn)檢索分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)白屈菜紅堿的新型遞藥系統(tǒng)的研究較為匱乏，有研究人員曾將其制備成為β-環(huán)糊精包合物，但包封率較低[3]。也有研究將白屈菜紅堿制備成為明膠微球，但成本較高、重現(xiàn)性較差[4]。此外，還有將白屈菜紅堿制備成為聚氰基丙烯酸丁酯納米粒[5]、磁性納米殼聚糖微球[6]、口服脂質(zhì)體[7]、復(fù)合磁性溫敏凝膠[8]、固體分散體[9]、磁性羧甲基殼聚糖納米粒[10]、磁性多壁碳納米管納米粒[11]的報(bào)道，但其同樣具有包封率低且制備工藝繁瑣等缺點(diǎn)。固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是指粒徑在10～1000 nm的固體顆粒，是以固態(tài)天然或者合成的多種類(lèi)脂質(zhì)材料如脂肪酸、脂肪醇及卵磷脂、單硬脂酸甘油酯等為載體，將藥物包裹或夾嵌于類(lèi)脂核中形成的固態(tài)膠體顆粒。固體脂質(zhì)納米粒因其被包封在生理相容且耐受性優(yōu)良的固體骨架之中，與傳統(tǒng)劑型相比，具有毒性小，安全性與生物相容性高，可延緩藥物釋放，增加藥物在體內(nèi)吸收和靶向性，增強(qiáng)藥物負(fù)載能力，防止藥物排出和更靈活地調(diào)節(jié)藥物釋放等優(yōu)點(diǎn)[12-14]，被認(rèn)為是有發(fā)展前景的藥物載體。它是為數(shù)不多的同時(shí)具有傳統(tǒng)膠體給藥系統(tǒng)如乳劑、脂質(zhì)體及聚合物納米粒生理相容性好、可生物降解，物理穩(wěn)定性高，可控制藥物釋放及有良好緩釋性和靶向性的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又避免了有機(jī)溶劑不能完全去除的缺點(diǎn)，且易于大規(guī)模生產(chǎn)[15-16]。綜上所述，本研究擬通過(guò)將藥物制備成SLN以提高藥物的包封率、載藥量[17]，并對(duì)其進(jìn)行體外釋放行為考察及對(duì)肝癌細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)，為白屈菜紅堿新型遞藥系統(tǒng)的研發(fā)提供思路。

1 材料

LC-20AT 型島津高效液相色譜儀（日本島津公司）；Diamonsil C18色譜柱[DIKMA（250 mm×4.6 mm，5 μm]；85-2A型恒溫磁力攪拌器（榮華儀器制造公司）；透射電子顯微鏡（Tecnai高分辨型）[FEI公司（荷蘭）產(chǎn)品]；Zetasizer 3000HS型激光粒徑分析儀[Malvem公司（英國(guó)）]；TGL-16c 型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ5200DE型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；超凈工作臺(tái)[Heal Force公司（香港）]；恒溫水浴箱、空氣浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（美谷分子儀器）；高壓滅菌鍋[ZEALWAY公司（美國(guó)）]；細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶[Corning公司（上海）]。

白屈菜紅堿原料藥（美國(guó)MCE公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.56%，貨號(hào)：26018）；白屈菜紅堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：98%，批號(hào)：110807-201703）；泊洛沙姆188（德國(guó)BASF公司，含量：95%，批號(hào)：WPWA544C）；大豆卵磷脂（雙旋微生物培養(yǎng)制品廠，批號(hào)：S100）；純凈水（娃哈哈品牌）；色譜甲醇（北京迪科馬科技有限公司）；RPMI-1640 液體培養(yǎng)基、10%優(yōu)級(jí)胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó) Hyclone 公司）；雙抗（青霉素/鏈霉素）（華北制藥廠）；PBS、MTT 溶液（武漢博士德公司）；5-Fu（USP級(jí)，含量：98%，上海金穗生物科技有限公司）；其他試劑皆為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白屈菜紅堿固體脂質(zhì)納米粒的制備

乳化蒸發(fā)法[18]制備白屈菜紅堿固體脂質(zhì)納米粒（CHE-SLN）。首先，向100%乙醇內(nèi)加入適量的藥物與脂質(zhì)材料（單甘酯，GMC），超聲溶解后，將適量大豆卵磷脂添加至該混合液內(nèi)，微熱處理，得到有機(jī)相，再將處方量的泊洛沙姆188（F-68）加入到純水內(nèi)溶解，得到水相。于1000 r·min－1磁力攪拌下，向水相內(nèi)低速注入有機(jī)相，整個(gè)過(guò)程操作的溫度應(yīng)高于脂質(zhì)材料的熔點(diǎn)，經(jīng)過(guò)數(shù)小時(shí)攪拌，濃縮至1/4，再將此半透明體系迅速移至另一低溫水相內(nèi)混合，同時(shí)進(jìn)行持續(xù)攪拌固化處理，制得CHE-SLN。

2.2 CHE-SLN包封率的測(cè)定

采用葡聚糖凝膠法，準(zhǔn)確吸量1 mL的CHESLN混懸液，上Sepha-dex G-50柱，用蒸餾水洗脫，流速設(shè)定1 mL·min－1，用試管收集洗脫液，每管2 mL，合并顯示藍(lán)色乳光的部分（含CHE的SLN），之后用100%乙醇超聲破乳，并稀釋為50 mL，HPLC法測(cè)定CHE含量，測(cè)定條件為30%甲醇∶70%的三乙胺-乙酸-水（0.3∶2.4∶230）為流動(dòng)相，進(jìn)樣量0.01 mL，流速1 mL·min－1，柱溫30℃，測(cè)定波長(zhǎng)264 nm[19-23]。精準(zhǔn)吸取1 mL的CHE-SLN混懸液，用100%乙醇超聲破乳，再稀釋為50 mL，HPLC法測(cè)定CHE含量，計(jì)算包封率（EE），EE（%）＝WE／WTotal×100%，WE為包封藥物量，WTotal為總的藥物量。CHE-SLN包封率為（63.84±3.9）%?？瞻讓?duì)照、對(duì)照品及供試品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 白屈菜紅堿固體脂質(zhì)納米粒高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of CHE-SLN

2.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化CHE-SLN的處方和工藝

基于前期單因素分析所得結(jié)果，選擇F-68濃度（A）、lecithin/單甘酯（GMC）之比（B）、主藥/GMC之比（C）、GMC用量（D），通過(guò)L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。具體因素和水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2、3。

表1 因素和水平 Tab 1 Factor and level

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Tab 2 Orthogonal experiment results

直觀分析結(jié)果極差R值順序?yàn)锽＞C＞D＞A；B、C差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。明確最優(yōu)處方構(gòu)成為A1B2C2D2：即F-68為0.4%濃度，lecithin/GMC之比為1∶2，藥物/GMC之比為1∶10，GMC質(zhì)量為0.05 g。

2.4 最優(yōu)處方驗(yàn)證

根據(jù)確定的最優(yōu)處方條件平行制備3批CHE-SLN，測(cè)定其包封率。結(jié)果最佳工藝條件下制備所得平均包封率為69.88%，RSD均小于2%，重現(xiàn)性強(qiáng)。

2.5 CHE-SLN的理化性質(zhì)

2.5.1 形態(tài)觀察 取1滴已稀釋的CHE-SLN混懸液，借助覆支持膜的銅網(wǎng)進(jìn)行蘸取，通過(guò)磷鎢酸鈉（1.2%）負(fù)染，于室溫中靜置干燥，透射電鏡下觀察，大小均勻，顯示為規(guī)則球狀（見(jiàn)圖2）。

圖2 CHE-SLN 透射電鏡圖Fig 2 Transmission electron micrograph of CHE-SLN

表3 方差分析結(jié)果 Tab 3 Analysis of variance

2.5.2 粒徑與zeta電位 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHE-SLN粒徑均值為106.1 nm，粒徑分布見(jiàn)圖3，zeta電位為－21.4 mV（見(jiàn)圖4），多分散系數(shù)為0.23。

圖3 白屈菜紅堿固體脂質(zhì)納米粒粒徑分布圖Fig 3 Particle size distribution of CHE-SLN

圖4 白屈菜紅堿固體脂質(zhì)納米粒的zeta 電位圖Fig 4 Zeta potential distribution map of CHE-SLN

2.5.3 穩(wěn)定性考察 制備的CHE-SLN為均一、穩(wěn)定的混懸體系，有明顯的丁達(dá)爾現(xiàn)象。為初步考察混懸體系的穩(wěn)定性，將新制備的5份CHE-SLN分別放置于4℃和室溫下，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定納米制劑的包封率，并觀察其外觀形態(tài)[24]。CHESLN在4℃條件下，連續(xù)放置1周，外觀和包封率變化不大，穩(wěn)定性較好。室溫下的CHE-SLN，最開(kāi)始的3 d內(nèi)外觀和包封率無(wú)明顯變化，第4日出現(xiàn)乳光減弱現(xiàn)象，1周后出現(xiàn)沉淀。說(shuō)明CHESLN在4℃條件下保存更理想，見(jiàn)表4。

表4 不同時(shí)間CHE-SLN穩(wěn)定性考察(±s，n＝5) Fig 4 Stability of CHE-SLN at different time (±s，n＝5)

表4 不同時(shí)間CHE-SLN穩(wěn)定性考察(±s，n＝5) Fig 4 Stability of CHE-SLN at different time (±s，n＝5)

時(shí)間/h 室溫 4℃外觀形態(tài) 包封率/% 外觀形態(tài) 包封率/% 24 澄清、淡藍(lán)色乳光 63.41±1.2 澄清、淡藍(lán)色乳光 63.72±1.5 48 澄清、淡藍(lán)色乳光 63.07±2.3 澄清、淡藍(lán)色乳光 63.21±1.7 96 澄清、淡藍(lán)色乳光減弱 59.86±3.3 澄清、淡藍(lán)色乳光 63.04±1.8 144 絮狀物 48.93±2.5 澄清、淡藍(lán)色乳光 62.83±3.1 168 沉淀 32.81±2.9 澄清、淡藍(lán)色乳光 62.11±1.4

2.6 CHE-SLN的體外釋放性質(zhì)考察

精密量取CHE-SLN混懸液10 mL（3.0 mg）于透析袋中（分子量為8000～12 000），兩端密封，100 mL放到錐形瓶?jī)?nèi)，加入50 mL釋放介質(zhì)（pH 7.4 PBS，40%乙醇），置于恒溫震蕩器內(nèi)，于（37±0.5）℃、100 r·min－1震蕩，分別在0.5、1、3、5、7、9、11、15、19、24、28、32、36、48、60、72、84、96、108，120 h取釋放液2 mL（并補(bǔ)加釋放介質(zhì)2 mL），0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，留存續(xù)濾液，HPLC對(duì)釋放介質(zhì)含藥物量測(cè)定，由藥物累積釋藥百分率（Q）、時(shí)間繪圖。

式中Ct為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的釋放介質(zhì)中的藥物質(zhì)量濃度（mg·mL－1），另W（mg）、V0、V依次代表投入藥物的總質(zhì)量、釋放介質(zhì)的總量、每個(gè)樣品的體積。

CHE和CHE-SLN的釋藥曲線見(jiàn)圖5。前期釋藥較快，在30 min藥物釋放率13.24%，2 h釋放率為19.89%?？赡艿脑蚴荂HE-SLN表面附著了游離藥物，導(dǎo)致前期藥物的釋放比較快，隨后釋藥曲線趨于平穩(wěn)，32 h內(nèi)累計(jì)釋放率為69.07%，表現(xiàn)出明顯的緩釋效應(yīng)。

圖5 白屈菜紅堿固體脂質(zhì)納米粒在介質(zhì)中的釋放曲線Fig 5 Release curve of CHE-SLN in the medium

對(duì)CHE-SLN的釋放曲線進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)擬合，具體見(jiàn)表5。

表5 不同方程擬合CHE-SLN的體外釋放度(n＝3) Tab 5 Fitting equation for the in vitro release rate of CHE-SLN (n＝3)

通過(guò)對(duì)零級(jí)、一級(jí)、Higuchi、Weibull釋藥模型的擬合，發(fā)現(xiàn)一級(jí)釋藥模型的R2最高，因此，CHE-SLN的體外釋放行為符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

2.7 CHE-SLN對(duì)HepG2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

MTT法檢測(cè)CHE-SLN對(duì)HepG2細(xì)胞毒性，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期濃度為0.5×104個(gè)·mL－1的HepG2細(xì)胞懸液，按照每孔200 μL 滴于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)液，再分別加入含不同 濃 度CHE-SLN（15、30、60、120、240、480、960 μg·mL－1）的RPMI-1640 培養(yǎng)基，其中對(duì)照組細(xì)胞為不加藥物的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h后取出，每孔加MTT（5 mg·mL－1）20 μL后繼續(xù)孵育4 h后棄上清液，每孔加入DMSO150 μL。通過(guò)酶標(biāo)490 nm處測(cè)得光度值OD。運(yùn)用SPSS 26.0軟件計(jì)算IC50值。

SLN對(duì)HepG2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6A所示，即使在高脂質(zhì)濃度下，載體也是無(wú)毒的，表明SLN是一種安全的給藥系統(tǒng)。與對(duì)照組比較，CHE-SLN和游離CHE有顯著的細(xì)胞毒性，游離CHE和CHE-SLN對(duì)HepG2細(xì)胞，IC50分別為249.29 μg·mL－1與38.67 μg·mL－1，以上結(jié)果表明SLN遞藥系統(tǒng)無(wú)毒且對(duì)肝癌細(xì)胞有明顯的抑制作用，效果較為理想。

圖6 SLN（A），游離CHE和CHE-SLN（B）對(duì)HepG2的細(xì)胞毒性（±s，n＝5）Fig 6 Cytotoxicity of SLN（A），CHE and CHE-SLN（B）to HepG2（±s，n＝5）

3 討論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)以包封率為指標(biāo)對(duì)超聲時(shí)間、加熱溫度、卵磷脂、硬脂酸、單硬脂酸甘油酯進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間和加熱溫度對(duì)制備的固體脂質(zhì)納米粒影響較小，當(dāng)硬脂酸作為藥物載體時(shí)，CHE-SLN的粒徑較為飽滿均一，且穩(wěn)定性良好，最終選擇GMC當(dāng)作載體材料。隨著GMC濃度的增加，SLN的粒徑不斷增加，為了防止對(duì)藥物包封率產(chǎn)生影響，需將GMC質(zhì)量減至最低。對(duì)于SLN的性能，表面活性劑類(lèi)型與用量也存在很大影響，若復(fù)配應(yīng)用多種乳化劑，可釋放協(xié)同效能，有效提升SLN的體系穩(wěn)定性，所得SLN具備良好形態(tài)。所以，最后將lecithin與F-68當(dāng)作復(fù)配乳化劑，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，隨著lecithin質(zhì)量的增加，制備所得SLN的穩(wěn)定性隨之提高。

在測(cè)定包封率方面，要先分離載藥納米粒和游離藥物，主要采取凝膠層析法、透析法、離心法，其中離心法對(duì)設(shè)備要求致高，且若高速離心，納米粒存在凝聚而受損風(fēng)險(xiǎn)；關(guān)于透析法，花費(fèi)時(shí)間多，內(nèi)外不等滲可導(dǎo)致納米粒受損，故此研究選擇凝膠層析法。

考察CHE-SLN各項(xiàng)理化性質(zhì)與穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，通過(guò)高溫乳化-低溫固化法制備出的CHE-SLN粒徑與要求相符，具備較好的包封率與穩(wěn)定性，同時(shí)制備工藝簡(jiǎn)單。由釋放曲線發(fā)現(xiàn)CHE-SLN開(kāi)始階段有藥物突釋現(xiàn)象，隨后釋藥曲線逐漸趨于緩和。前期釋放速度較快，主要源于未包裹至脂質(zhì)材料內(nèi)的游離藥物以及在表面上吸附的藥物，后期釋放緩慢，是因?yàn)楸话袼幬锝?jīng)由納米粒微孔擴(kuò)散難度較大，藥物的釋放主要由堅(jiān)硬的固體脂質(zhì)溶蝕決定。盡管納米粒在體外釋藥情況與體內(nèi)存在差別，但體外釋藥情況仍在一定程度可以反映體內(nèi)釋藥情況。采用MTT法檢測(cè)CHE-SLN對(duì)HepG2細(xì)胞毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于單純的CHE原料藥溶液，CHE-SLN由于自身的性質(zhì)，容易被HepG2細(xì)胞的吞噬作用攝取，增加藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積量，因此細(xì)胞毒性更強(qiáng)，說(shuō)明CHE經(jīng)SLN包載后對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷力明顯提高，SLN給藥系統(tǒng)顯著提高白屈菜的對(duì)抗肝癌細(xì)胞的活性。因此SLN是一種很有前景的提高抗白屈菜抗腫瘤活性的納米給藥系統(tǒng)。