龍膽苦苷基于尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和NLRP3炎性小體信號(hào)通路 改善小鼠高尿酸血癥和腎臟炎癥

區(qū)淑雅，李燦濤，邵穎穎，謝保城，胡潤(rùn)凱（廣東省東莞市人民醫(yī)院，廣東 東莞 523000）

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）的直接誘因是人體嘌呤代謝紊亂造成體內(nèi)尿酸生成過(guò)多或排泄不足，可引發(fā)腎結(jié)石和間質(zhì)性腎炎等腎臟損傷[1]。目前，高尿酸血癥與高血壓、高血糖、高血脂并稱(chēng)為“四高”代謝性疾病[2]。尿酸（uric acid，UA）是來(lái)源于動(dòng)物嘌呤的最終產(chǎn)物，主要在肝臟合成，經(jīng)腎臟排泄[3]。隨著社會(huì)生活水平的提高，人們?cè)谌粘ｏ嬍持型鶗?huì)攝入過(guò)量的嘌呤，造成體內(nèi)尿酸濃度過(guò)高而增加患高尿酸血癥的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，尿酸可誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的分泌，增加促炎因子的生成和釋放，上調(diào)腎臟炎癥水平，造成腎臟的炎性損傷[4]。臨床上治療高尿酸血癥的臨床藥物主要有三類(lèi)：黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）抑制劑、尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（urate anion transporter 1，URAT1）抑制劑和尿酸氧化酶類(lèi)似物，這類(lèi)藥物對(duì)肝、腎和腸道的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者的康復(fù)進(jìn)程和生活質(zhì)量[5-6]。因此，尋找有效、不良反應(yīng)少的高尿酸血癥治療藥物顯得尤為重要。

中醫(yī)目前對(duì)高尿酸血癥無(wú)統(tǒng)一的辨證標(biāo)準(zhǔn)，有中醫(yī)學(xué)家綜合臟腑、經(jīng)絡(luò)、病因病機(jī)等因素，將高尿酸血癥的證型歸為濕熱蘊(yùn)結(jié)，故常用具有清利濕熱功效的中藥進(jìn)行治療[7-8]。龍膽是我國(guó)傳統(tǒng)的珍貴中藥材，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效，常用于濕熱蘊(yùn)結(jié)于下焦之證[9]。龍膽苦苷（gentiopicroside，Gent）是龍膽的主要活性成分，同時(shí)也是存在于龍膽、秦艽等龍膽科植物中的環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物。現(xiàn)代藥理研究報(bào)道龍膽苦苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖等作用[10]。已有研究證明，龍膽苦苷可抑制肝臟中NLRP3炎性小體的表達(dá)，減少促炎因子的生成和釋放，下調(diào)炎癥水平。然而龍膽苦苷在腎臟是否同樣具有抑制炎癥反應(yīng)從而保護(hù)腎臟的作用尚未有明確報(bào)道?；诖耍狙芯糠治鳊埬懣嘬諏?duì)小鼠高尿酸血癥的降尿酸作用和對(duì)腎臟NLRP3炎性小體信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步闡釋龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠的療效以及對(duì)腎臟炎癥的改善作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

60只雄性昆明小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK2020-0090。小鼠體質(zhì)量18～23 g，飼養(yǎng)溫度：23～25℃，濕度45%～55%，每日光照12 h，動(dòng)物自由食用標(biāo)準(zhǔn)飼料和自由飲用蒸餾水。

1.2 試藥

龍膽苦苷（默克Sigma Aldrich公司，批號(hào)：20200703-2，純度≥ 98%）；羧甲基纖維素鈉（批號(hào)：20200128）、別嘌呤醇（ALL，批號(hào)：20200311）、氧嗪酸鉀（純度≥ 97%，批號(hào)：20200351）（美國(guó)Sigma公司）。URAT1抗體（貨號(hào)：AF14543）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（OAT1）抗體（貨號(hào)：AF27322）、OAT3抗體（貨號(hào)：AF13328）、NLRP3抗體（貨號(hào)：AF21232）、ASC抗 體（貨 號(hào)：AF33461）、Caspase-1抗體（貨號(hào)：AF22156）、山羊抗兔抗體（貨號(hào)：AF43326）、山羊抗大鼠抗體（貨號(hào)：AF48565）、猴抗小鼠抗體（貨號(hào)：AF42241）（Affinity公司）；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9（GLUT9）抗體（貨號(hào)：AB14443）（Abcam公司）；IL-1β測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20200522）、IL-18 測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20200522）（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（貨號(hào)：P0312）、蛋白酶抑制劑PMSF（批號(hào)：P0137）、RIPA裂解液（批號(hào)：P0112B）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：P0122S）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；SYBR實(shí)時(shí)熒光定量（qPCR）試劑盒（批號(hào)：P10525）、PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（批號(hào)：C10112）、RNAiso plus總RNA提取試劑（批號(hào)：C26433）（日本TaKaRa公司）；4%多聚甲醛（批號(hào)：MA3302，美侖生物科技有限公司）；尿酸（UA，貨號(hào)：P29394）、肌酐（CRE，貨號(hào)：P30324）、黃嘌呤氧化酶（XOD，貨號(hào)：P26614）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器

Elx808全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（廣州吉源生物科技有限公司）；Nano Drop 2000c超微量分光光度計(jì)、CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)賽默飛生物科技有限公司）；伯樂(lè)垂直電泳槽、伯樂(lè)電泳儀（美國(guó)Bio-rad生物科技有限公司）；Tanon4600天能曝光儀（中國(guó)天能生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組及干預(yù)方法

60只雄性昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥ALL組、龍膽苦苷低劑量組、龍膽苦苷中劑量組和龍膽苦苷高劑量組，每組10只。實(shí)驗(yàn)期間，給予動(dòng)物普通飼料和蒸餾水自由飲食。模型組、ALL組、龍膽苦苷低劑量組、龍膽苦苷中劑量組和龍膽苦苷高劑量組動(dòng)物使用0.5%羧甲基纖維素鈉（0.2 mL/10 g）為溶劑，腹腔注射氧嗪酸鉀（300 mg·kg－1），連續(xù)注射15 d，構(gòu)建高尿酸血癥模型。對(duì)照組則腹腔注射等體積的蒸餾水。ALL組（5 mg·kg－1）、龍膽苦苷低劑量組（20 mg·kg－1）、龍膽苦苷中劑量組（40 mg·kg－1）和龍膽苦苷高劑量組（80 mg·kg－1）在腹腔注射氧嗪酸鉀1 h后，分別對(duì)小鼠灌胃相應(yīng)劑量的藥物。對(duì)照組與模型組灌胃等體積的蒸餾水。

2.2 血清和臟器的收集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行乙醚麻醉，眼眶取血。4℃、3500 g離心血液15 min得血清，－80℃保存?zhèn)溆?。隨后對(duì)小鼠脫頸椎法處死，剖取肝和腎，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 尿酸、肌酐和黃嘌呤氧化酶的檢測(cè)

分別剪取約0.5 g的肝組織加入到含有500 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS）的EP管中，勻漿，然后將所得勻漿液以3500 g離心10 min，取上清得肝上清液。采用BCA試劑盒檢測(cè)肝上清液的蛋白濃度。按照試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定動(dòng)物血清中的尿酸和肌酐，以及血清和肝臟中黃嘌呤氧化酶的含量。

2.4 IL-1β和IL-18的檢測(cè)

分別剪取約0.5 g的腎組織加入到裝有500 μL PBS的EP管中，勻漿，然后將所得勻漿液以3500 g離心10 min，取上清得腎上清液。采用BCA試劑盒檢測(cè)腎上清液的蛋白濃度。按照試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定動(dòng)物腎中IL-1β和IL-18，以及血清中IL-1β和IL-18的含量。

2.5 Western blot法檢測(cè)小鼠腎GLUT9、URAT1、OAT1、OAT3和NLRP3炎癥小體通路

將小鼠腎組織浸泡于RIPA裂解液中，冰上裂解30 min，勻漿，提取總蛋白。12 000 r·min－1離心15 min，取上清液。采用BCA試劑盒測(cè)定腎組織蛋白濃度。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2.5 h，加一抗（GLUT9、URAT1、OAT1、OAT3、NLRP3、ASC和Caspase-1）4℃冰箱孵育過(guò)夜；翌日加入相應(yīng)二抗，孵育1 h，隨后顯色曝光，拍照并保存相應(yīng)蛋白條帶，使用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值校準(zhǔn)。

2.6 qPCR測(cè)定iNOS和CD206的mRNA表達(dá)

按試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取腎上清總RNA并檢測(cè)RNA濃度，并保存于－80℃?zhèn)溆谩Ｊ褂梅崔D(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此cDNA為模板，用SYBR Green PCR Master Mix和相應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性，持續(xù)30 s，95℃變 性，持 續(xù)5 s，60℃退 火30 s，72℃延伸60 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所得數(shù)據(jù)均采用2-ΔΔct進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列 Tab 1 Primer sequence

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用±s的形式表達(dá)，應(yīng)用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊則采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnett T檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸和肌酐水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠血清尿酸、肌酐水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性藥ALL和各濃度的龍膽苦苷均能明顯下調(diào)血清中尿酸、肌酐的含量（P＜0.01），且具有劑量依賴(lài)性。說(shuō)明龍膽苦苷對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥具有明顯的改善作用。

圖1 各組小鼠血清尿酸（A）和肌酐（B）的含量Fig 1 Content of UA（A）and CRE（B）in each group

3.2 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠黃嘌呤氧化酶水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠的血清和肝臟中的黃嘌呤氧化酶水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，ALL陽(yáng)性藥能顯著下調(diào)黃嘌呤氧化酶水平（P＜0.01），同時(shí)龍膽苦苷各濃度也能下調(diào)血清和肝臟中的黃嘌呤氧化酶水平（P＜0.05，P＜0.01），且作用具有劑量依賴(lài)性（見(jiàn)圖2）。

圖2 各組小鼠血清（A）和肝臟（B）中黃嘌呤氧化酶的含量Fig 2 Content of XOD in serum（A）and liver（B）of each group

3.3 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠的GLUT9和URAT1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），OAT1和OAT3表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，龍膽苦苷各劑量和陽(yáng)性藥ALL能明顯降低GLUT9和URAT1蛋白表達(dá)水平（P＜0.01），升高OAT1和OAT3蛋白的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），且龍膽苦苷降低各蛋白表達(dá)的作用具有劑量依賴(lài)性（見(jiàn)圖3）。

圖3 各組小鼠尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig 3 Relative expression of uric acid transporter-associated proteins in each group

3.4 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠的GLUT9和URAT1 RNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），OAT1和OAT3表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，陽(yáng)性藥ALL和龍膽苦苷各個(gè)劑量均能升高小鼠的OAT1和OAT3表達(dá)（P＜0.01），且降低GLUT9和URAT1的表達(dá)（P＜0.01）（見(jiàn)圖4）。

圖4 各組小鼠尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig 4 Relative mRNA expression of uric acid transporter-associated proteins in each group

3.5 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠血清和腎臟炎性因子的影響

與正常組相比，模型組小鼠血清中和腎臟中的IL-1β和IL-18的含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，龍膽苦苷各劑量以及陽(yáng)性藥ALL均能顯著降低血清以及腎臟中IL-1β和IL-18的含量（P＜0.01）（見(jiàn)圖5）。

圖5 各組小鼠血清和腎臟IL-1β和IL-18的含量Fig 5 Content of IL-1β and IL-18 in serum and liver of each group

3.6 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠NLRP3炎性小體通路表達(dá)水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠腎臟的NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，龍膽苦苷各劑量組和ALL組小鼠腎臟中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)則明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）（見(jiàn)圖6）。結(jié)果表明龍膽苦苷能夠抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的表達(dá)。

圖6 各組小鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig 6 Relative expression of NLRP3，ASC and Caspase-1 in each group

3.7 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠NLRP3炎性小體mRNA水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠腎臟中NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，龍膽苦苷各劑量和陽(yáng)性藥ALL能夠顯著降低腎臟中NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA表達(dá)（P＜0.01）（見(jiàn)圖7）。結(jié)果表明龍膽苦苷能夠抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的表達(dá)。

圖7 各組小鼠NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig 7 Relative mRNA expression of NLRP3，ASC and Caspase-1 in each group

4 討論

流行病學(xué)研究表明，高尿酸血癥的發(fā)病率逐年升高，且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，防控形勢(shì)不容樂(lè)觀(guān)[11]。已有研究報(bào)道高尿酸血癥與尿酸生成過(guò)多和尿酸排泄減少密切相關(guān)[12-13]。臨床上對(duì)抗高尿酸血癥最廣泛的藥物為黃嘌呤氧化酶抑制劑，盡管其療效顯著，但藥物所伴隨的超敏綜合征可影響患者康復(fù)進(jìn)程[6，14]。中醫(yī)認(rèn)為，高尿酸血癥屬于“通風(fēng)”“歷節(jié)”和“虎咬風(fēng)”等范疇，其病機(jī)在于臟腑虧虛、濕痰瘀阻和濕熱蘊(yùn)結(jié)[15-17]。龍膽具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效，尤善清下焦?jié)駸?，被認(rèn)為是治療高尿酸血癥的潛在藥物[9，18]。本研究結(jié)果表明龍膽苦苷可調(diào)控尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，影響尿酸的排泄和重吸收，降低體內(nèi)尿酸含量改善高尿酸血癥，并抑制NLRP3炎性小體信號(hào)通路的表達(dá)，降低腎臟炎癥水平，發(fā)揮改善小鼠高尿酸血癥和腎臟炎癥的作用。

目前，已經(jīng)有許多小鼠模型用于研究高尿酸血癥的分子機(jī)制。這些模型主要通過(guò)4種不同的方式提高體內(nèi)尿酸的水平[19-21]：① 直接補(bǔ)充尿酸、尿酸前體或者高嘌呤食物，如黃嘌呤、次黃嘌呤、果糖或酵母；② 抑制尿酸排泄，可通過(guò)補(bǔ)充乙胺丁醇或者煙酸，抑制機(jī)體對(duì)尿酸的排泄能力；③ 抑制尿酸酶的活性，如氧嗪酸鉀，可抑制尿酸酶的活性降低尿酸的分解，造成尿酸在體內(nèi)的過(guò)度積蓄；④ 轉(zhuǎn)基因模型，如通過(guò)對(duì)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OAT1進(jìn)行敲除，促使尿酸排泄受限制。其中，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行氧嗪酸鉀飼養(yǎng)、灌胃以及腹腔注射是目前使用最廣泛的高尿酸血癥造模方法[22]。區(qū)別于飼養(yǎng)法和灌胃法，腹腔注射氧嗪酸鉀的操作既不影響動(dòng)物的后期進(jìn)食，也更能保證藥物的攝入量[23]，故本研究采用對(duì)動(dòng)物腹腔注射氧嗪酸鉀的方法，并成功構(gòu)建高尿酸血癥模型。

尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要分為兩類(lèi)：尿酸分泌蛋白和尿酸重吸收蛋白。作為尿酸分泌蛋白的主要成員之一，有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族有十余種亞型[24]。其中，OAT1和OAT3是參與尿酸分泌的關(guān)鍵蛋白，分布于近端小管上皮細(xì)胞的基底外側(cè)。OAT1和OAT3攝取血液中尿酸的機(jī)制相似，二者均充當(dāng)有機(jī)陰離子/酮戊二酸鹽交換體的角色，將α-酮戊二酸排出的同時(shí)完成對(duì)尿酸的攝取，降低血液中尿酸的含量[25-26]。另一方面，尿酸重吸收蛋白包括URAT1和GLUT9。URAT1分布于近端小管的上皮細(xì)胞管腔側(cè)或基底膜外側(cè)。根據(jù)近端小管管腔兩側(cè)的濃度梯度和電化學(xué)變化，URAT1介導(dǎo)管腔內(nèi)的尿酸與近端小管上皮細(xì)胞無(wú)機(jī)陰離子及有機(jī)陰離子的交換，進(jìn)而促使尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的尿酸經(jīng)過(guò)位于近端小管上皮細(xì)胞基底外側(cè)和頂端的GLUT9轉(zhuǎn)移到腎間質(zhì)，完成從尿液重吸收尿酸到血液的過(guò)程[27]。本次研究結(jié)果顯示，各劑量的龍膽苦苷可明顯上調(diào)高尿酸血癥小鼠腎臟OAT1和OAT3的表達(dá)，同時(shí)顯著抑制高尿酸血癥小鼠腎臟GLUT9和URAT1的表達(dá)，減少近端小管上皮細(xì)胞對(duì)尿酸重吸收，并且增加尿酸的排泄，達(dá)到改善高尿酸血癥的作用。

腎臟炎癥是高尿酸血癥的典型病理特征，在高尿酸血癥的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。尿酸的過(guò)度積蓄會(huì)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用[28-29]，其中的病理作用則包括誘導(dǎo)腎間質(zhì)炎性浸潤(rùn)。尿酸的促炎作用主要體現(xiàn)在尿酸鹽結(jié)晶和可溶性尿酸，通過(guò)激活核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域3蛋白（NLRP3）炎性小體和腎小管上皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)炎性細(xì)胞分泌促炎因子，上調(diào)腎臟的炎癥水平，造成腎臟的炎性浸潤(rùn)[30-31]。尿酸及尿酸鹽結(jié)晶激活NLRP3炎性小體[32]，NLRP3炎性小體通過(guò)模式識(shí)別受體3與凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白（ASC）和胱天蛋白酶1的前體（Pro-caspase1）寡聚而成[33]。在正常的生理情況下，Pro-caspase1處于無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)NLRP3炎性小體激活，對(duì)Pro-caspase1進(jìn)行加工并將其活化為具有活性的Caspase-1，進(jìn)而對(duì)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）前體和白細(xì)胞介素-18（IL-18）前體進(jìn)行剪切，生成和釋放IL-1β和IL-18，參與多種炎癥性疾病的發(fā)病進(jìn)程[34-35]。在本研究中，高尿酸血癥小鼠腎臟中IL-1β和IL-18含量上升，說(shuō)明NLRP3炎性小體被激活，產(chǎn)生炎性因子增加對(duì)腎臟的炎性損傷。經(jīng)龍膽苦苷干預(yù)后的高尿酸血癥小鼠腎臟中IL-1β和IL-18含量下調(diào)，提示NLRP3炎性小體激活受抑制，降低腎臟炎癥水平，改善腎損傷。

綜上所述，龍膽苦苷可通過(guò)調(diào)控小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，降低小鼠體內(nèi)尿酸含量，發(fā)揮治療高尿酸血癥小鼠的作用，并且抑制尿酸過(guò)度積蓄誘導(dǎo)的腎臟NLRP3炎性小體的激活，降低腎臟炎癥反應(yīng)水平，緩解腎臟炎癥。