健康青年人腸道菌群的分布特征研究

田學(xué)梅，王慧，梁靜宣，王耘（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥信息工程研究中心，北京 102488）

人類腸道內(nèi)存在大量的微生物，在參與維持正常生理過程的同時(shí)，與疾病的發(fā)生發(fā)展也息息相關(guān)[1]。腸道微生物不僅可以調(diào)控肥胖[2]，干預(yù)多糖和纖維素在體內(nèi)消化吸收[3]，還影響胃腸道疾病如炎癥性腸病、心血管疾病如高血壓、代謝類疾病如肥胖、自身免疫性疾病等[4-6]。微生物組菌群結(jié)構(gòu)的變化與人類健康和疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，利用腸道菌群的分布差異進(jìn)行個(gè)體疾病、健康等的相關(guān)研究已逐漸增多。例如2型糖尿病患者與健康個(gè)體相比，其腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量減少[7]，膽汁淤積性肝病患者與健康對(duì)照者相比，腸道菌群存在特征性改變，韋榮氏球菌屬（Veillonella）相對(duì)高豐度表達(dá)與膽汁淤積性肝病強(qiáng)相關(guān)[8]等。腸道菌群的狀態(tài)會(huì)以各種方式反饋給宿主[9]，健康個(gè)體在不同生活方式、藥物、飲食、疾病狀態(tài)、地域以及年齡階段，其腸道菌群的分布存在很大差異[10-11]。通過研究不同健康人的腸道菌群的分布特征，調(diào)理腸道菌群的狀態(tài)以改善健康狀況。因此是否可以利用不同健康人群間腸道菌群的分布差異對(duì)健康人群進(jìn)行分類，以此來評(píng)價(jià)個(gè)體健康狀態(tài)并對(duì)個(gè)體健康進(jìn)行有效精準(zhǔn)的健康管理呢？基于以上思考，本研究利用16S rRNA技術(shù)[12]獲得的腸道菌群種層面相對(duì)豐度數(shù)據(jù)并轉(zhuǎn)換為定性數(shù)據(jù)，聚類分析將健康青年人群進(jìn)行分類，根據(jù)不同分類的健康青年人群間的差異菌通過數(shù)據(jù)挖掘方法[13-14]，建立以不同健康青年人分類間腸道菌群的分布差異為指標(biāo)的健康青年人群分類模型，并探討不同分類的健康青年人腸道菌群分布特征。以期為青年個(gè)性化的健康管理研究奠定基礎(chǔ)。

1 數(shù)據(jù)獲得

1.1 樣本來源

選擇就讀于北京中醫(yī)藥大學(xué)大一、大二的本科生4000人，隨機(jī)抽樣后共納入研究對(duì)象114人，男女性別比例1∶1，年齡18～22歲。研究經(jīng)學(xué)校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有研究對(duì)象均了解并簽署項(xiàng)目知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：健康大學(xué)生且正常飲食無明顯飲食偏頗情況。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 患有潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等炎癥性腸病及慢性便秘、慢性腹瀉等其他腸道疾病患者；② 使用抗菌藥物、進(jìn)行闌尾手術(shù)等的患者；③ 合并急性冠脈綜合征、急性腦血管意外等危急重癥者；④ 有嚴(yán)重情緒或精神異常而無法配合者；⑤ 重大疾病患者。

1.3 腸道菌群數(shù)據(jù)的收集與整理

受試者均無嚴(yán)重疾病，入組后前一個(gè)月避免抗菌藥物、胃腸道藥物等使用并正常飲食，取受試者的早餐前糞樣，通過16S rRNA 測序[15]技術(shù)進(jìn)行腸道微生物菌種的組成測定，獲得研究樣本腸道菌群種層面相對(duì)豐度數(shù)據(jù)。將腸道菌群種層面相對(duì)豐度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)槎ㄐ詳?shù)據(jù)（相對(duì)豐度＞0即定為含有這種菌，用1表示；沒有相對(duì)豐度即定為不含這種菌，用0表示）。

2 方法及原理

2.1 腸道菌群定性數(shù)據(jù)的聚類分析方法

聚類分析（clustering analysis）[13]是數(shù)據(jù)挖掘中的一個(gè)重要部分，屬于無監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法。根據(jù)研究目的，本文所選用的是凝聚聚類算法中的離差平方和法[16]，采用歐氏距離作為聚類分析的指標(biāo)，對(duì)“1.3”項(xiàng)下腸道菌群種層面定性數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，聚類分析工作基于軟件Orange 2.7實(shí)現(xiàn)。

離差平方和方法：如果有兩個(gè)樣本類G1、G2，n1、n2分別為G1、G2樣本個(gè)數(shù)

若G1，G2內(nèi)部點(diǎn)與點(diǎn)距離很小，則它們能很好地各自聚為一類，并且這兩類又能充分分離（D12很大），這時(shí)D就很大。

2.2 聚類分析結(jié)果差異菌的篩選

基于“2.1”項(xiàng)下的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，114名樣本的腸道菌群種層面組成個(gè)體間有顯著差異。為了提高后續(xù)人群分類模型構(gòu)建時(shí)建模數(shù)據(jù)的質(zhì)量，加快挖掘速度并且使挖掘出的規(guī)則更準(zhǔn)確易懂，本研究分析了受試樣本在不同分類時(shí)組間的差異菌，并對(duì)其進(jìn)行初步篩選得到人群分類的屬性指標(biāo)。

利用腸道菌群種層面相對(duì)豐度數(shù)據(jù)對(duì)不同組間進(jìn)行差異菌分析。當(dāng)聚類數(shù)為2，通過Welch’st-test統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行兩組差異菌的分析（P＜0.05）；當(dāng)聚類數(shù)為3～5時(shí)，通過方差分析進(jìn)行多組間差異菌的分析（P＜0.05）。不同分類間差異菌的篩選通過STAMP軟件進(jìn)行[17]。

2.3 基于差異菌的數(shù)據(jù)建立人群分類模型方法

首先將聚類后每類樣本差異菌的定性數(shù)據(jù)及屬性指標(biāo)分別作為模型輸入指標(biāo)，再分別利用樸素貝葉斯（NB）算法[18]、K最近鄰（IBK）算法[19]、決策樹（J48）算法[20]、隨機(jī)森林（RF）算法[21]進(jìn)行模型的構(gòu)建，并依據(jù)曲線下面積（AUC）選出優(yōu)的算法及分類，為后續(xù)模型的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。將各分類樣本集隨機(jī)劃分70%作為訓(xùn)練集，30%作為測試集。訓(xùn)練集用于構(gòu)建模型，同時(shí)運(yùn)用Cor（Correlation-based Attribute Evaluation）[22]屬性篩選算法進(jìn)行篩選，優(yōu)化訓(xùn)練模型；測試集用于驗(yàn)證模型，最終得到基于腸道菌群的人群分類模型，具體模型構(gòu)建思路如圖1所示。

圖1 基于腸道菌群的人群分類模型構(gòu)建方法Fig 1 Construction of population classification models based on the intestinal flora

本文中涉及分類算法和特征屬性選擇算法均在10折交叉的環(huán)境下運(yùn)行，交叉驗(yàn)證是數(shù)據(jù)建模中常用且有效的一種內(nèi)部驗(yàn)證方法，常用來測試模型或算法的準(zhǔn)確性[23-24]。所有操作均通過數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)軟件Weka 3.8實(shí)現(xiàn)；運(yùn)行過程中所有參數(shù)均采用平臺(tái)默認(rèn)的參數(shù)設(shè)置。

2.4 模型評(píng)價(jià)指標(biāo)

在本文中使用ROC的AUC，為ROC曲線提供了量化值，可以通過比較AUC值的大小來評(píng)估分類模型的性能[25-27]。

3 結(jié)果與討論

3.1 腸道菌群在門、種水平的微生物含量組成分析

在門水平上，研究對(duì)象的微生物含量組成如圖2所示：最終將所有的序列鑒定為22個(gè)門，其中擬桿菌門（Bacteroidetes）、硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）的含量較高，占測序序列總數(shù)的97%以上，其他菌門如梭桿菌門（Fusobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、無壁菌門（Tenericutes）、TM7、黏膠球形菌門（Lentisphaerae）等的含量較低。

圖2 門水平微生物含量組成Fig 2 Composition of microbial content at the phylum level

個(gè)體腸道菌群的組成在種水平上具有很大的差異，研究中的種水平的腸道菌群組分構(gòu)成，最終將序列鑒定為257個(gè)種，相對(duì)豐度比例最高的前50個(gè)種構(gòu)成的組分柱狀圖見如圖3。

圖3 受試者在種水平微生物相對(duì)豐度組成Fig 3 Relative abundance composition of subjects at the species level

3.2 腸道菌群定性數(shù)據(jù)的聚類分析

目前的聚類算法大多數(shù)需要預(yù)先給定聚類數(shù)，再對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析。確定最佳聚類數(shù)是聚類分析中的關(guān)鍵步驟。因此為了確定最佳的聚類數(shù)，保證數(shù)據(jù)集的劃分和評(píng)判結(jié)果是有效正確的，本研究依據(jù)腸道菌群種層面定性數(shù)據(jù)將受試人群劃分為2～5類的結(jié)果，通過后續(xù)建立人群分類模型的結(jié)果選擇最終的聚類數(shù)。聚類結(jié)果見表1。

表1 樣本分為兩至五類時(shí)聚類結(jié)果 Tab 1 Clustering of categories when divided into two to five categories

3.3 聚類分析結(jié)果差異菌的篩選

針對(duì)“3.2”項(xiàng)下不同分類人群差異菌的分析，以P＜0.05為檢驗(yàn)水平，發(fā)現(xiàn)當(dāng)數(shù)據(jù)樣本分為兩類時(shí)，組間差異菌有50個(gè)；當(dāng)分為三類時(shí)，組間差異菌有68個(gè)；當(dāng)分為四類時(shí)，組間差異菌有67個(gè)；當(dāng)分為五類時(shí)，組間差異菌有73個(gè)，如表2。可以看出不同的人群其差異菌的類別與其分類程度成正相關(guān)。

表2 聚類數(shù)為兩至五類時(shí)組間差異菌 Tab 2 Differences in bacteria between groups when divided into two to five categories

3.4 人群分類最優(yōu)模型的選擇與評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步說明可以依據(jù)差異性的腸道菌群對(duì)人群分類的可行性，基于前面試驗(yàn)結(jié)果將聚類后的每類樣本的差異菌的定性數(shù)據(jù)分別作為模型輸入指標(biāo)，再分別利用NB、IBK、J48、RF四種算法進(jìn)行模型的構(gòu)建。并篩選出不同人群分類模型中AUC值最高的算法及分類，所建模型的應(yīng)用算法及構(gòu)成模型的腸道菌屬性集結(jié)果見表3。

表3 聚類結(jié)果為兩至五類時(shí)人群分類模型 Tab 3 Crowd classification model when the clustering results are two to five types

基于不同分類人群間差異菌所建各類模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)如表4所示，ROC曲線圖見圖4。所建模型的訓(xùn)練集和測試集，各個(gè)指標(biāo)結(jié)果都趨近，這表明在應(yīng)用未知數(shù)據(jù)時(shí)，所建模型不會(huì)發(fā)生故障。

圖4 受試者工作特征曲線 Fig 4 Receiver operating characteristic curve

表4 聚類結(jié)果為兩至五類時(shí)模型各項(xiàng)指標(biāo) Tab 4 Indicators of the model when the clustering results in two to five types

通過綜合比較每種模型的ROC曲線圖、準(zhǔn)確性、SE、SP、BACC選擇最優(yōu)模型。最終，基于腸道菌群分為四類時(shí)，所建模型為最優(yōu)。對(duì)于最優(yōu)模型的選取，與各模型性能相關(guān)的多項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，及各模型的ROC曲線圖進(jìn)行了分析。最優(yōu)模型的性能是從訓(xùn)練集和測試集兩個(gè)角度進(jìn)行評(píng)價(jià)的。模型10折交叉驗(yàn)證測試的準(zhǔn)確性在82.50%～100%，平衡精度在0.672～1.000，受試者工作特征AUC在0.842～1.000。測試集的準(zhǔn)確性在85.29%～94.12%，平衡精度在0.808～0.904，受試者工作特征AUC在0.990～0.971。

續(xù)表2

續(xù)表3

由以上結(jié)果最終可將受試者分為四類，通過各評(píng)價(jià)指標(biāo)的數(shù)據(jù)表明，本文建立的基于腸道菌群建立的受試人群分類模型有較高的可靠性，而且還說明了通過腸道菌群建立健康青年人群分類模型是可行的。對(duì)于每一類人群其優(yōu)勢菌群在一定程度上影響人體健康，同時(shí)宿主也會(huì)影響腸道菌群。① 第一類人群以Mitsuokai、Dolichum、Citroniae等為主要的優(yōu)勢菌群，高脂飲食會(huì)導(dǎo)致其豐度增加腹部內(nèi)臟脂肪區(qū)[28]，腸道中短鏈脂肪酸的缺乏會(huì)影響宿主健康，常常與缺乏可發(fā)酵纖維有關(guān)，因此這類人群應(yīng)多食用膳食纖維，不僅可以促進(jìn)有益菌代謝產(chǎn)生人體所需的短鏈脂肪酸，還可以降低這類人群的優(yōu)勢菌群豐度[29]。② 第二類人群主要以intestinihominis、eggerthii、onderdonkii、indistinctus等為主要優(yōu)勢菌群，其中intestinihominis過度擴(kuò)張是微生態(tài)失衡的標(biāo)志[30]，其定植可降低血漿中具有抗炎作用的皮質(zhì)酮的水平，從而促進(jìn)腸道中的炎癥應(yīng)答[31]；eggerthii可以合成短鏈脂肪酸，食用高脂低碳水使得eggerthii增多導(dǎo)致棕櫚酸和硬脂酸等增加；onderdonkii、indistinctus菌群失調(diào)與炎癥、癌癥以及心理健康具有很高的相關(guān)性[32]。③ 第三類人群主要以longicatena、lactaris、johnsonii、putredinis等為主要優(yōu)勢菌群，longicatena屬于Dorea屬，是潛在等有益菌[33]，在帕金森患者中其豐度降低[34]，經(jīng)常使用小麥、黑麥、大麥、燕麥會(huì)使其豐度會(huì)增加[35]；此外lactaris具有降脂應(yīng)用效果[36]；Johnsonii是腸道中的有益菌，能提高血液中的還原型谷胱甘肽水平，從而改善肝臟的線粒體形態(tài)和功能，減少肝臟脂質(zhì)、改善系統(tǒng)性的糖代謝[37]；高鹽飲食通過改變腸道菌群的組成及代謝，減少Putredinis，從而提升皮質(zhì)酮水平以促進(jìn)高血壓，而Putredinis可通過其代謝產(chǎn)物花生四烯酸抑制皮質(zhì)酮的產(chǎn)生[38]。④ 第四類人群以lenta、symbiosum、cateniformis為主要優(yōu)勢菌群，lenta被認(rèn)為是潰瘍性結(jié)腸炎、肝臟和肛門膿腫以及全身性菌血癥的原因[39]；高脂飲食會(huì)導(dǎo)致symbiosum豐度增加[28]；經(jīng)常食用土豆抗性淀粉、玉米抗性淀粉，腸道中的有益益生菌Clostridioforme顯著增加，菌群產(chǎn)生丁酸能力更強(qiáng)[40]?？傊?，不同的人群其優(yōu)勢菌群不僅影響人體腸道微環(huán)境，還會(huì)間接或直接影響人體的消化、免疫以及情緒等，針對(duì)不同人群優(yōu)勢菌群作出不同的飲食管理、生活方式改變將有益于我們對(duì)健康管理，為個(gè)體化食療、醫(yī)療提供新的方向。

4 總結(jié)與展望

本研究闡釋了基于腸道菌群分類的健康青年人群分類模型的構(gòu)建的方法及原理?；谀c道菌群種層面數(shù)據(jù)，通過聚類分析獲得基于腸道菌群定性數(shù)據(jù)的健康青年人群分類，再依據(jù)分類的組間差異菌，運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘算法構(gòu)建了健康青年人群分類模型。構(gòu)建模型的準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、平衡精度、AUC值等幾個(gè)指標(biāo)驗(yàn)證了所建模型的可靠性。

人體的腸道微生物與宿主是共同生長的，人體不同狀態(tài)呈現(xiàn)不同的菌群特征。曾有研究通過隨機(jī)森林算法，構(gòu)建了基于腸道菌群區(qū)分酒精性脂肪肝的模型[41]。這為本文通過數(shù)據(jù)挖掘的方法進(jìn)行基于腸道菌群分類探討健康青年人群分類的研究提供佐證，進(jìn)一步證明了以腸道菌群分布差異作為客觀指標(biāo)對(duì)健康青年人群進(jìn)行分類的可能性。不僅為處理微生物數(shù)據(jù)提供了一種新的策略，而且為未來深入研究腸道菌群與人體健康關(guān)系提供了參考。