牛膝和白芍配伍對(duì)帕金森病肝陽(yáng)上亢證小鼠的 協(xié)同神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究

張靜艷，郭科東，金明，榮華，張曉杰（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150000；.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；3.黑龍江護(hù)理高等專(zhuān)科學(xué)校，哈爾濱 150000）

關(guān)健詞：帕金森?。桓侮?yáng)上亢證；牛膝；白芍；氧化應(yīng)激；核因子NF-E2相關(guān)因子2；血紅素氧合酶1

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是中老年人群常見(jiàn)的椎體外系神經(jīng)退行性疾病，以靜止性震顫、姿勢(shì)異常、行動(dòng)障礙為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者會(huì)造成情緒、記憶及認(rèn)知功能障礙。中腦黑質(zhì)致密部大量多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失及路易小體異常聚集為其典型的病理表現(xiàn)[1]。PD患者腦組織抗氧化酶活性顯著減少，脂質(zhì)過(guò)氧化水平異常增加[2]，而活性氧形成過(guò)量和DA能神經(jīng)元功能障礙及死亡密切相關(guān)[3]。目前，尋找具有抗氧化能力及神經(jīng)保護(hù)作用的藥物已經(jīng)成為PD治療的重要方向[4]。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯為《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》的經(jīng)典方劑，具有良好的抗氧化作用，在肝陽(yáng)上亢型PD的治療實(shí)踐中已經(jīng)取得顯著療效[5-6]。然而大復(fù)方由于成分眾多，藥味間作用關(guān)系復(fù)雜，藥物配伍在復(fù)方中的真實(shí)作用難以準(zhǔn)確反映。牛膝與白芍是鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的核心藥對(duì)，是治療PD方劑中出現(xiàn)頻率較高的藥對(duì)，課題組前期體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，牛膝與白芍有效組分配伍對(duì)DA能神經(jīng)元具有協(xié)同增效的神經(jīng)保護(hù)作用[7]，但其配伍的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及抗PD的具體機(jī)制鮮有研究。本研究采用中醫(yī)特色明顯的病證結(jié)合動(dòng)物模型，通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、生化檢測(cè)及分子生物學(xué)等方面探討牛膝和白芍配伍對(duì)PD肝陽(yáng)上亢證小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制，為臨床中藥復(fù)方的二次開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡健康C57BL/6雄性小鼠90只，體質(zhì)量（20±2）g [遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001]。飼養(yǎng)條件：室溫25℃，濕度40%～50%。

1.2 試藥與儀器

附子（湖北金貴中藥產(chǎn)業(yè)有限公司，批號(hào)：D4120201）；牛膝、白芍（北京同仁堂有限公司，批號(hào)：801000130、801001062），分別取附子、牛膝、白芍及牛膝白芍配伍組4組飲片按傳統(tǒng)煎藥法制成含附子、牛膝、白芍及牛膝白芍配伍組（生藥量分別為0.2、0.33、0.17、0.5 g·mL－1）水煎液。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯（齊齊哈爾醫(yī)藥商廈，相當(dāng)于生藥量為1.67 g·mL－1，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥物研究所鑒定專(zhuān)家進(jìn)行鑒定）；1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：M0896）；兔抗鼠酪氨酸羥化酶（TH，批號(hào)：58844S）、Lamin B抗體（批號(hào)：13435S）（CST公司）；兔抗鼠核因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素氧合酶1（HO-1）抗體（Abcam公司，批號(hào)：ab137550、ab189491）；谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為：A003-4-1、A001-3-2、A006-1-1）。全自動(dòng)凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；SA102轉(zhuǎn)棒式動(dòng)物疲勞測(cè)試儀（江蘇賽昂科技有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立與給藥

小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組、牛膝組、白芍組及牛膝白芍配伍組，每組15只。除對(duì)照組外，各組給予附子湯（3 g·kg－1）灌胃4周制備肝陽(yáng)上亢證動(dòng)物模型[5]。附子灌胃結(jié)束后，牛膝、白芍及牛膝白芍配伍組分別按4.5、2.3、6.8 g·kg－1灌胃給予相應(yīng)藥物水煎液，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組給予鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯（25 g·kg－1），1次·d－1，連續(xù)灌胃給藥14 d。于給藥第10日開(kāi)始，灌胃給藥前1 h，模型組及各給藥組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射MPTP（30 mg·kg－1）制備PD肝陽(yáng)上亢病癥結(jié)合小鼠模型[8]。造模結(jié)束后以小鼠出現(xiàn)易激惹、豎毛、弓背、震顫、抽搐等癥狀即視為模型建立成功[9]。本次模型制備全部成功。

2.2 小鼠易激惹程度的評(píng)定

易激惹程度分為3級(jí)：Ⅰ級(jí)為小鼠頭頸部被捉持時(shí)立即表現(xiàn)出尖叫、驚跳等癥狀；Ⅱ級(jí)為小鼠頭頸部被捉持時(shí)表現(xiàn)出攻擊行為；Ⅲ級(jí)為小鼠尾部被提起時(shí)即表現(xiàn)出尖叫、驚跳或攻擊行為。Ⅰ～Ⅲ級(jí)均不出現(xiàn)者為0級(jí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前測(cè)量1次[10]。

2.3 行為學(xué)檢測(cè)

2.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1 h。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放于曠場(chǎng)箱（50 cm×50 cm）中央，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)記錄小鼠運(yùn)動(dòng)總路程，測(cè)試時(shí)間為5 min[11]。

2.3.2 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)先訓(xùn)練，轉(zhuǎn)速30 r·min－1，訓(xùn)練時(shí)間為3 min，連續(xù)訓(xùn)練2 d。實(shí)驗(yàn)時(shí)以0.12 r·min－1的加速度從4 r·min－1開(kāi)始恒定加速，最大轉(zhuǎn)速為40 r·min－1，記錄小鼠在5 min內(nèi)，在轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間，即轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期[12]。

2.4 免疫組化法分析TH陽(yáng)性神經(jīng)元平均光密度

黑質(zhì)區(qū)取材進(jìn)行石蠟包埋切片，脫蠟，抗原修復(fù)，3%H2O2封閉。PBS漂洗后滴加兔抗TH多克隆抗體（1∶200），室溫孵育。PBS漂洗后滴加羊抗兔二抗孵育1 h。DAB工作液顯色，蘇木素復(fù)染，PBS充分沖洗返藍(lán)并封片。在顯微鏡下觀察黑質(zhì)中TH表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元并拍片，根據(jù)Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算各組平均光密度。

2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

于冰上取適量小鼠腦黑質(zhì)，加入9倍預(yù)冷的生理鹽水制備10%組織勻漿，離心（2500 r·min－1，15 min）后取上清液，按照試劑盒說(shuō)明采用生物化學(xué)法測(cè)定GSH與MDA的表達(dá)水平及SOD的活性。

2.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

冰上取腦組織剪碎，加入蛋白酶抑制劑及裂解液震蕩混勻，以12 000 r·min－1離心10 min，取上清液即為所提蛋白溶液。另取腦黑質(zhì)按照核蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提核蛋白，均采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。SDS凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加入一抗Nrf2（1∶1000）、HO-1（1∶1000）、β-actin（1∶500）及Lamin B（1∶1000），于4℃孵育過(guò)夜，二抗（1∶6000）孵育，TBST緩沖液洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影后，采用AlphaEase FC圖像分析軟件對(duì)免疫印跡條帶進(jìn)行分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法，等級(jí)資料采用Ridit分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 牛膝白芍配伍對(duì)小鼠易激惹程度的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠易激惹程度明顯增加；與模型組相比，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組、牛膝組、白芍組及配伍組均可不同程度改善小鼠的易激惹程度（見(jiàn)表1）。

表1 各組小鼠易激惹程度的比較(n＝15) Tab 1 Irritation degree of the mice in each group (n＝15)

3.2 牛膝白芍配伍對(duì)小鼠行為學(xué)的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)總距離明顯減少、轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期明顯縮短；與模型組相比，各給藥組均可不同程度增加小鼠曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)總距離、延長(zhǎng)轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期；配伍組作用明顯優(yōu)于牛膝和白芍單獨(dú)用藥組；配伍組與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖1及圖2）。

圖1 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)軌跡Fig 1 Movement trajectory of the mice in each group in the open field experiment

圖2 各組小鼠行為學(xué)比較（±s，n＝15）Fig 2 Behavioral comparison of mice in each group（±s，n＝15）

3.3 牛膝白芍配伍對(duì)小鼠神經(jīng)細(xì)胞TH陽(yáng)性表達(dá)比較

與對(duì)照組相比，模型組黑質(zhì)TH陽(yáng)性表達(dá)明顯減少；與模型組相比，各給藥組可不同程度增加TH陽(yáng)性表達(dá)水平；與牛膝、白芍單獨(dú)用藥組相比，配伍組TH陽(yáng)性表達(dá)增加更為明顯；配伍組與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖3）。

圖3 各組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞TH陽(yáng)性表達(dá)的比較（±s，n＝5）Fig 3 Positive expression of TH in the substantia nigra of the mice in each group（±s，n＝5）

3.4 牛膝白芍配伍對(duì)小鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠腦黑質(zhì)抗氧化物質(zhì)SOD活性、GSH水平明顯降低，氧化物質(zhì)MDA水平明顯增高；與模型組相比，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組、牛膝組及配伍組可不同程度逆轉(zhuǎn)SOD活性、GSH及MDA的水平，而白芍組對(duì)改善氧化應(yīng)激作用不明顯；配伍組改善氧化應(yīng)激效應(yīng)明顯優(yōu)于牛膝、白芍單獨(dú)用藥組；配伍組與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖4）。

圖4 各組小鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較（±s，n＝6）Fig 4 Oxidative stress index of the mice in each group（±s，n＝6）

3.5 牛膝白芍配伍對(duì)小鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組黑質(zhì)核Nrf2蛋白、漿HO-1蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)明顯差異；與模型組相比，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組、牛膝組及配伍組核Nrf2、漿HO-1蛋白表達(dá)量均明顯增加，而白芍組蛋白表達(dá)雖有增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；配伍組蛋白表達(dá)明顯優(yōu)于牛膝、白芍單獨(dú)用藥組；配伍組與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖5）。

圖5 小鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較（±s，n＝5）Fig 5 Nrf2 and HO-1 protein expression in the brain tissue of mice（±s，n＝5）

4 討論

隨著社會(huì)人口老齡化趨勢(shì)的逐年加重，PD的發(fā)病率日益增加，如何對(duì)該疾病進(jìn)行有效治療已成為醫(yī)藥界研究的重點(diǎn)課題[13]。西醫(yī)治療PD不良反應(yīng)明顯，長(zhǎng)期持續(xù)治療藥效減退，且不能阻止病情的進(jìn)展[14]。肝腎陰虛、肝陽(yáng)上亢是PD的核心中醫(yī)病機(jī)，臨床研究報(bào)道了鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)PD肝陽(yáng)上亢證的防治，療效確切[15]。然而中藥大復(fù)方藥味繁多，藥對(duì)的具體作用難以在方劑中研究與確定。牛膝白芍是鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的核心配伍藥對(duì)，牛膝補(bǔ)益肝腎、引火下行，具有明顯的抗氧化、調(diào)節(jié)免疫作用[16-17]；白芍養(yǎng)血濡筋、緩急止痙，具有神經(jīng)保護(hù)、鎮(zhèn)痛抗炎作用[18]。前期體外實(shí)驗(yàn)表明，牛膝和白芍的主要有效成分能抑制魚(yú)騰酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，有效成分配伍后作用增強(qiáng)[7]?；凇敖M分配伍研制現(xiàn)代中藥”的理念，本課題組提取鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的君藥牛膝和臣藥白芍為核心配伍藥對(duì)，探討兩者配伍對(duì)DA能神經(jīng)元是否具有協(xié)同神經(jīng)保護(hù)作用及具體作用機(jī)制。

附子辛燥大熱，久服耗傷陰血，附子灌胃可制備肝陽(yáng)上亢證動(dòng)物模型，使動(dòng)物出現(xiàn)煩躁、易怒（易激惹）癥狀[5，10]；MPTP是嚙齒及靈長(zhǎng)類(lèi)PD研究中使用最多的外源性神經(jīng)毒素，可選擇性損傷DA能神經(jīng)元并誘導(dǎo)PD的發(fā)生發(fā)展[19]。研究表明，由MPTP復(fù)制的PD模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能明顯異常且DA能神經(jīng)元數(shù)量顯著減少[20]。TH是催化DA、腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)合成的限速酶[21]，常用于驗(yàn)證PD模型是否構(gòu)建成功，細(xì)胞表達(dá)TH是判斷DA能神經(jīng)元數(shù)目的黃金標(biāo)準(zhǔn)[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以附子灌胃聯(lián)合腹腔注射MPTP制備的PD肝陽(yáng)上亢證小鼠模型，其激惹程度明顯增加，曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)總距離明顯減少，轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期明顯縮短，TH陽(yáng)性表達(dá)減少，人類(lèi)肝陽(yáng)上亢型PD的行為特征及病理特點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)小鼠模型中得到了較好的模擬。本研究發(fā)現(xiàn)，各給藥組可不同程度降低小鼠激惹程度，增加曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)總距離，延長(zhǎng)轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期，減少TH陽(yáng)性神經(jīng)元的丟失，說(shuō)明牛膝、白芍及兩者配伍均可有效改善小鼠肝陽(yáng)上亢癥狀及運(yùn)動(dòng)功能障礙，減少DA能神經(jīng)元損傷，并且配伍組比單獨(dú)用藥組的治療效果更為顯著。

PD的發(fā)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[22]，研究表明神經(jīng)毒素MPTP會(huì)使神經(jīng)元產(chǎn)生大量氧自由基而誘發(fā)氧化應(yīng)激[23]。氧自由基使神經(jīng)元膜結(jié)構(gòu)被氧化，產(chǎn)生大量MDA，使得DA能神經(jīng)元變性及缺失[24]，因此MDA可間接反映組織氧化損傷的水平[25]。為應(yīng)對(duì)過(guò)度氧化，機(jī)體在氧化應(yīng)激刺激下產(chǎn)生抗氧化物SOD及GSH。SOD可抑制氧自由基生成[23]，GSH對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)物進(jìn)行還原[27]，SOD及GSH水平體現(xiàn)機(jī)體對(duì)抗氧化損傷的能力[28]。為檢測(cè)小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激的損傷程度，本課題組檢測(cè)了氧化與抗氧化反應(yīng)的標(biāo)志物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠黑質(zhì)MDA含量明顯增高，SOD及GSH水平明顯降低，說(shuō)明模型組小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷明顯。而經(jīng)藥物治療后，牛膝組及配伍組小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)出現(xiàn)不同程度的改善，且配伍組改善氧化應(yīng)激的效果較優(yōu)。

Nrf2是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗氧化酶以對(duì)抗氧化應(yīng)激的重要因子[29]。在細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激或受內(nèi)源性、外源性反應(yīng)性物質(zhì)如H2O2、超氧化物攻擊時(shí)，生理?xiàng)l件下位于細(xì)胞質(zhì)中非活性狀態(tài)的Nrf2蛋白被激活，與其結(jié)合蛋白發(fā)生解離，轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，誘導(dǎo)SOD、GSH的表達(dá)，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA生成，并啟動(dòng)下游抗氧化酶HO-1的轉(zhuǎn)錄[30-31]。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1能保護(hù)器官免受氧化應(yīng)激[32]，其表達(dá)減少與PD等年齡依賴(lài)性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[33]。本研究表明，牛膝組及配伍組均可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞Nrf2的核內(nèi)表達(dá)并誘導(dǎo)其下游產(chǎn)物HO-1轉(zhuǎn)錄增加，改善腦內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，其中配伍組效應(yīng)最強(qiáng)，其作用與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯相當(dāng)，而白芍組對(duì)PD肝陽(yáng)上亢證小鼠雖有抗氧化趨勢(shì)，但作用不明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，牛膝與白芍雖對(duì)PD肝陽(yáng)上亢證小鼠均具有神經(jīng)保護(hù)作用，但兩者在抗氧化及相關(guān)靶通路發(fā)揮的作用仍存在差異，白芍在兩者配伍中發(fā)揮的作用將另文報(bào)道，牛膝白芍配伍發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)制與牛膝的抗氧化功能相關(guān)，兩藥配伍后發(fā)揮協(xié)同增效的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上，牛膝白芍配伍可有效改善PD肝陽(yáng)上亢證小鼠的易激惹程度及行為障礙，保護(hù)DA能神經(jīng)元，兩藥配伍具有協(xié)同作用，其機(jī)制可能是通過(guò)牛膝激活Nrf2/HO-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)證明牛膝白芍兩藥配伍在治療PD肝陽(yáng)上亢證方面存在相使作用，雖然其治療機(jī)制有待進(jìn)一步研究，但是本實(shí)驗(yàn)為中藥配伍“相使增效”的科學(xué)理論及中藥大復(fù)方的二次優(yōu)化升級(jí)提供了更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。