復方植物精油與脫氫醋酸鈉抑制玉米霉菌效果的對比研究

◆作者：周鵬 董小英 高樂程 唐勝球

◆單位：韶關學院英東生物與農(nóng)業(yè)學院

據(jù)統(tǒng)計，全世界平均每年因霉變而損失的糧食約占總產(chǎn)量的10%。因此，糧食的防霉儲存尤為重要。在飼料行業(yè)中普遍使用化學合成品如苯甲酸及其鹽類、山梨酸及其鹽類等作為防霉劑，但一定程度上會對飼料風味產(chǎn)生不良影響。此類防霉劑的殘留還會對人體產(chǎn)生毒副作用。此外，合成類防霉劑效果易受溶解度、飼料微生物種類、pH 值等因素的影響，防霉效果下降。因此，開發(fā)新型高效安全的飼料防霉劑十分必要。

研究發(fā)現(xiàn)，天然防霉劑具有合成防霉劑無法比擬的優(yōu)點，例如抗菌性強、安全無毒、水溶性好、熱穩(wěn)定性好、作用范圍廣等。為此，開發(fā)安全、無毒、高效和低成本的植物精油飼料防霉劑已逐漸成為該領域研究的熱點之一。部分植物中的天然精油成分可以成為降低霉菌毒素的功能活性物質(zhì)，同時植物的性質(zhì)溫和，且含有較多的營養(yǎng)物質(zhì)，更有利于動物的健康成長。但這方面的研究目前還不夠深入和系統(tǒng)化，如何開發(fā)植物精油飼料防霉劑已成為亟待解決的難題。

早在公元前4500 年，古埃及人萃取出精油，并發(fā)現(xiàn)了該物質(zhì)具有殺菌、防腐、醫(yī)療、保健等特性。機理研究認為，植物精油所含的揮發(fā)性物質(zhì)可以抑制微生物的丁二酸脫氫酶以及還原酶的活性，從而影響微生物的初生能量代謝；另外精油中揮發(fā)性物質(zhì)可以通過抑制微生物呼吸過程中電子的傳遞及氧化磷酸過程，破壞微生物的呼吸作用及細胞膜功能實現(xiàn)抑菌的目的。由此可見，若將植物精油應用于飼料防霉，預期可取得非常好的抑制效果。據(jù)報道，丁香、小茴香、大蒜、香菜、山蒼子和八角等植物都具有較強的抑菌作用，且具有諸多的藥理作用。如丁香和小茴香可抑制致病性真菌及葡萄球菌、痢疾和大腸桿菌等。其中山蒼子是消除黃曲霉毒素最有效、最安全的物質(zhì)，因其含有檸檬醛等活性成分，其中檸檬醛易與黃曲霉毒素等有害物質(zhì)發(fā)生分解、氧化等化學反應。前期研究發(fā)現(xiàn)，小茴香和山蒼子（1∶5）抑菌效果最佳，本研究擬將小茴香和山蒼子復合精油與無機防霉劑蒙脫石相結(jié)合，探討以上處理對飼料霉菌的抑制效果。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

飼料：玉米粉

復合精油：小茴香精油：山蒼子精油=1∶5。

市場防霉劑：脫氫醋酸鈉新型防霉劑。

無機防霉劑蒙脫石。

1.2 實驗儀器和設備

分析天平、電子臺秤、生化恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、高精密溫度計、電熱干燥箱

1.3 試驗方法

試驗一：取12 袋1 kg 的飼料。試驗分為四組：A 組（復合精油0 mg/kg）、B 組（復合精油100 mg/kg）、C 組（復合精油200 mg/kg）、D 組（復合精油300 mg/kg）。各組飼料添加植物精油后充分搖勻后封閉好，置于27～28 ℃、相對濕度75%的培養(yǎng)箱中。觀察每組發(fā)霉的情況，記錄好數(shù)據(jù)，出現(xiàn)菌落時間最晚的一組取為最佳抑制濃度，方可進行試驗二。

試驗二：設對照組D（無防霉劑添加）、E 組（脫氫醋酸鈉500g/t）和F 組（復合植物精油200 mg/kg）。每個處理組分別設3 個重復，共9 袋，每袋30 kg。將9 袋飼料放在自然環(huán)境中，溫度16～28 ℃、濕度70%左右。飼料存放20 天后，取出作第一次觀察，快速觀察后密封放回原處，此后各5 天作一次同樣觀察，觀察時應避免污染樣品。存放55天后嚴格按照“中華人民共和國國家標準GB/T 13092-2006 飼料中霉菌總數(shù)的測定”測定各處理組飼料中霉菌總數(shù)。抽樣之前把飼料均勻，結(jié)塊飼料需粉碎，充分均勻后抽取。

1.4 測定的內(nèi)容與方法

1.4.1 最佳抑制玉米粉霉變濃度

采用觀察法，觀察每組發(fā)霉的情況，記錄好數(shù)據(jù)，出現(xiàn)菌落時間最晚的一組取為最佳抑制濃度。

1.4.2 飼料溫度

用精密溫度計分別測定飼料溫度（取平均值）。

1.4.3 飼料水分測定

參照GB/T 6435-2014 步驟進行飼料水分測定。

1.4.4 飼料變化的感官評定

包括飼料的氣味、發(fā)熱情況、結(jié)塊情況、發(fā)霉變質(zhì)情況，以及出現(xiàn)霉味天數(shù)為開始霉變天數(shù)。飼料處于不同存放階段的特征見表1。

表1 飼料處于不同存放階段的狀態(tài)

1.4.5 飼料霉菌數(shù)的測定方法

從各袋飼料中用取樣器按均勻原則取樣，樣品放入已編號的滅菌塑料袋，帶回實驗室檢測霉菌數(shù)量，具體方法如下：

（1）PDA 培養(yǎng)基的配置

取新鮮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL。先將馬鈴薯洗凈，去皮后切成0.5 cm3的小塊煮沸15～20 min，然后用四層紗布過濾，加入葡萄糖、瓊脂和蒸餾水至1000 mL，高溫滅菌20 min，做好備用。

（2）霉菌數(shù)的測定

測定方法采用平板稀釋法：稱取樣品10 g 于盛100 mL 無菌水的三角瓶中，搖動約5 min，取菌懸液1 mL 放入9 mL 無菌水的試管中，配成10-1濃度的菌懸液，再從中吸取1 mL 加入另一只9 mL 無菌水當中，配成10-2濃度的菌懸液。以此類推，配出10-3濃度的菌懸液。選擇濃度為10-2和10-3兩個濃度，分別取1 mL 加入無菌培養(yǎng)皿中，每個稀釋組做3 個重復，然后倒入經(jīng)溶解后溫度為45℃的PDA 培養(yǎng)基中，搖勻，冷凝后于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，到第三天長出小米大小的白色菌落時進行記錄。

（3）霉菌數(shù)的計算

選擇菌落數(shù)均勻的平皿進行計數(shù)，同稀釋度的3 個平皿的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或每毫升）檢樣中所含霉菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物精油添加量對飼料保存時間的影響

為探討復合植物精油對飼料保存時間的影響，分別在飼料中添加復合精油0 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg。表2 結(jié)果顯示，四組出現(xiàn)霉菌的時間分別為25d、33d、42d、39d，說明添加200 mg/kg 復合精油的霉菌出現(xiàn)時間最晚，提示飼料最佳復合精油的抑菌濃度為200 mg/kg。

表2 飼料溫度測定結(jié)果

2.2 復合植物精油對飼料溫度的變化影響

為探討復合植物精油對飼料保存的影響，在飼料中添加復合植物精油200 mg/kg（F 組），并設E 組（脫氫醋酸鈉500g/t）和對照組D（無防霉劑添加）。由表3 可以看出，飼料保存的55d 內(nèi)，飼料溫度高于室溫。處理組E 和F 的飼料溫度基本上都低于對照組，而處理組E 的溫度略低于處理組F，與室溫較接近。

2.3 復合植物精油對飼料水分含量的影響

當對照組達到溫度變化最高點（保存第55 天時），對照組（D 組）、E 組、F 組取樣，測定水分，結(jié)果見表4。由表4 可知，三試驗組的飼料水分在實驗過程中均增加，增加量分別為1.81%、0.92%、1.25%。D 組與E組水分增加量均小于對照組，添加脫氫醋酸鈉效果略高于復合植物精油。結(jié)合表3 各組溫度變化情況，我們發(fā)現(xiàn)在本次試驗中，各實驗組在一定范圍內(nèi)水分增加量與溫度升高量成正相關。

表4 飼料水分分析表

2.4 復合植物精油對飼料外觀的影響

由表5 可以看出，對照組D組飼料在第30 天開始隱約發(fā)霉，處理組D 組與F 組飼料均在第45 天隱約發(fā)霉?？傮w上看，處理D、F 組比對照組延長20 天發(fā)霉。由上述結(jié)果可知，植物精油對飼料防霉有一定作用，與防霉劑脫氫醋酸鈉的防霉效果相當。

表5 各處理組不同存放階段的觀察結(jié)果

2.5 復合植物精油對飼料中的菌落數(shù)的影響

由表6 可以看出，沒添加防霉劑對照組的菌落總數(shù)（5.03×105個/g）遠遠超過其他處理組，而添加了脫氫醋酸鈉新型復合防霉劑的處理組E 的霉菌最少（1.47×105個/g），略低于復合精油處理組F（1.76×105個/g）。由此可知，添加植物精油的飼料在延長保質(zhì)期上具備脫氫醋酸鈉新型復合防霉劑的優(yōu)勢，可用于飼料防霉。

表6 各處理組飼料存放至55 天后的菌落總數(shù)（個/g）

3 討論

飼料中的霉菌有很多種，最常見的有青霉菌和曲霉菌等霉菌，影響動物的生長發(fā)育，重則破壞機體免疫系統(tǒng)致死，甚至危害人類健康。因此，開發(fā)飼料防霉劑是必要的。究表明，植物精油具有抗菌殺菌、抗氧化以及增強機體免疫力等生物學功能。本實驗證實，復合植物精油效果與脫氫醋酸鈉新型復合防霉劑相當，植物精油能抗菌殺菌，延長飼料保質(zhì)期。另外，植物精油的特殊香味，能刺激動物味覺，增加采食量，促動物快速生長。

水分含量是影響飼料變質(zhì)的重要因素。飼料中含量為13%～14%時，有利于微生物的繁殖。霉菌在代謝中會產(chǎn)生一定的水分，使得貯存后期水分增加，又進一步加快了飼料霉變。本研究結(jié)果與以上學者的研究結(jié)果很相似：結(jié)合三組處理組的水分分析及不同階段中的觀察結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，霉菌在生長過程中，如呼吸作用時，會釋放熱量與產(chǎn)生水分，且在一定范圍內(nèi)，實驗中的水分增加量與溫度升高量、飼料霉變程度呈正相關。由此可見，在周遭環(huán)境較穩(wěn)定的情況下，霉菌生長繁殖代謝越活躍，實驗組飼料的水分含量及溫度越高，故飼料樣品溫度和飼料樣品含水量的變化均為霉菌生長活躍程度的重要指標。

飼料溫度的變化是由于飼料霉變而引起的，由于霉菌的新陳代謝，會產(chǎn)生熱量，從而改變飼料的溫度。溫度對飼料貯藏十分重要，大多數(shù)霉菌的最適溫度是24℃～32℃。廣東的天氣多變，一日內(nèi)空氣濕度和溫度變化較大，對飼料防霉也會有較大的影響，雖然防霉劑能延長飼料的保質(zhì)期，但防霉劑也會受環(huán)境因素影響而變質(zhì)。綜上所述，本實驗研制的復合精油防霉劑效果與市場防霉劑脫氫醋酸鈉新型復合防霉劑相當，對霉菌的抑制作用明顯。

參考文獻：(略)