蓬子菜總黃酮對(duì)D-半乳糖致過氧化損傷大鼠SOD、MDA和GSH-Px水平的影響

崔明宇，尹義鳳，朱鳳梅，隋玥，閻雪瑩

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

蓬子菜(GaliumverumL.)為茜草科拉拉藤屬植物，臨床多用于周圍血管病的治療[1-2]。蓬子菜含多種結(jié)構(gòu)類型的化學(xué)成分，其中主要活性成分總黃酮(FVGL)能夠保護(hù)被H2O2損傷的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[3]，改善四氯化碳所致急性肝損傷[4]，對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷亦具有保護(hù)作用[5]。1956年Denham Harman提出的自由基老化理論認(rèn)為年齡相關(guān)性疾病的主要因素是氧化損傷[6]，如呼吸、動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病以及各種癌癥，但FVGL對(duì)衰老所致氧化損傷的影響尚不清楚。D-半乳糖正常情況下于肝臟中代謝為葡萄糖，較高濃度時(shí)則使衰老細(xì)胞數(shù)目增加，促進(jìn)機(jī)體活性氧形成，降低抗氧化酶活性，從而加速衰老進(jìn)程，是國(guó)內(nèi)外研究衰老及氧化損傷機(jī)制公認(rèn)的造模方法[7-8]。因此本研究采用D-半乳糖致氧化損傷大鼠模擬衰老模型，考察FVGL對(duì)過氧化損傷大鼠體內(nèi)的抗氧化相關(guān)指標(biāo)水平的影響，探究其抗氧化損傷的作用機(jī)制，為蓬子菜開發(fā)成臨床治療衰老相關(guān)疾病的新藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BT25S型分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；Allegra64R型低溫高速離心機(jī)(BeckMan coulter公司)；HHS型恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；XW-80A型渦旋混合器(上海醫(yī)用儀器廠)；T10型組織勻漿機(jī)(Sigma公司)；Multiskan GO 1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher公司)。

1.2 藥品與試劑

D-半乳糖(Biotopped公司，批號(hào)：20151201)；維生素E(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20150807)；蓬子菜總黃酮(含量>58%，實(shí)驗(yàn)室自制)；超氧化酶歧化物(T-SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170521)；丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170611)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170526)。

1.3 動(dòng)物

SD雄性大鼠，體質(zhì)量(220±20)g，青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(魯)2014-004。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%。

2 方法

2.1 過氧化損傷模型的建立

60只SD大鼠自由進(jìn)食飲水適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組及模型組，空白組腹腔注射7.5 mL/kg的注射用水，模型組腹腔注射20 mg/mL的D-半乳糖溶液，劑量為150 mg/kg，每日1次，6周后，眼眶后靜脈叢取血測(cè)定MDA值，確定過氧化損傷模型的建立。

2.2 分組及給藥

將造模成功的過氧化損傷大鼠根據(jù)MDA水平隨機(jī)分為模型組，VE陽性組(100 mg/kg VE)及FVGL低、中、高劑量組(45 mg/kg、90 mg/kg、180 mg/kg)，除空白組及模型組灌胃給予生理鹽水外，其余各組分別灌胃相應(yīng)藥物，給藥期間繼續(xù)腹腔注射D-半乳糖溶液。

2.3 體質(zhì)量及臟器系數(shù)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期間記錄大鼠每周體質(zhì)量情況，連續(xù)給藥14 d后，禁食不禁水12 h，經(jīng)眼眶后靜脈叢取血后，將大鼠脫頸處死，取其肝、脾、心、腎和腦組織，用冰生理鹽水沖洗臟器上的血液，濾紙吸干表面水分后稱重。

大鼠的臟器系數(shù)(g/100 g)=臟器質(zhì)量(g)/大鼠的體質(zhì)量(g)×100

2.4 血漿和組織樣品的制備

血漿：血液于4 000 r/min下離心10 min，吸取上清液分裝，凍存于-80 ℃冰箱中，備后續(xù)生化檢測(cè)。

10%組織勻漿：取各組大鼠肝臟和腦組織，以重量∶體積為1∶9的比例加入帶冰的生理鹽水中，采用組織勻漿機(jī)研磨各臟器組織，勻漿后的組織液于4 000 r/min離心10 min，收集上清液進(jìn)行分裝，凍存于-80 ℃冰箱中，備后續(xù)生化檢測(cè)。

2.5 抗氧化作用相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

采用試劑盒分別測(cè)定大鼠血漿、肝臟、腦組織中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的水平，考察不同劑量FVGL對(duì)不同組織內(nèi)抗氧化作用相關(guān)指標(biāo)的影響。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 FGVL對(duì)大鼠日常狀態(tài)的影響

空白組大鼠精神狀態(tài)良好，飲食正常，行動(dòng)敏捷，皮毛和膚色有光澤；模型組大鼠與空白組相比精神萎靡，毛色黯淡無光，毛發(fā)稀疏易于脫落，尾根部出現(xiàn)白斑，倦怠蜷臥，反應(yīng)遲鈍，出現(xiàn)簇?fù)碓训痊F(xiàn)象。給藥組大鼠日常狀態(tài)均有所好轉(zhuǎn)且優(yōu)于模型組，蓬子菜中、高劑量組大鼠狀態(tài)接近空白組。

3.2 FGVL對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)前大鼠平均體質(zhì)量大致相同，組間無顯著差異(P>0.05)。造模及給藥期間，各組大鼠體質(zhì)量呈逐漸上升趨勢(shì)，排便量增加，而FVGL各給藥組大鼠較其他組體質(zhì)量增長(zhǎng)較緩慢，但無顯著差異(P>0.05)。說明FVGL對(duì)大鼠的體質(zhì)量變化無顯著影響，見表1。

表1 不同給藥組大鼠的體質(zhì)量變化情況

3.3 FGVL對(duì)過氧化損傷大鼠臟器系數(shù)的影響

各組大鼠臟器色澤鮮艷，對(duì)其臟器系數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，過氧化損傷大鼠與空白組大鼠相比心臟質(zhì)量較小，給藥后，VE陽性組及FVGL各劑量組與模型組相比均提高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明此劑量D-半乳糖對(duì)大鼠心臟損傷不大，且灌胃給予FVGL能夠加以改善。而模型組大鼠肝、脾、腎等臟器質(zhì)量與空白組相比明顯降低，大腦嚴(yán)重萎縮，給藥后，F(xiàn)VGL低、中、高劑量組和VE陽性組大鼠臟器已基本恢復(fù)到正常水平，同時(shí)大腦萎縮現(xiàn)象得以改善，與空白組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 FGVL對(duì)過氧化損傷大鼠臟器指數(shù)的影響

3.4 FGVL對(duì)大鼠血漿和臟器中GSH-Px水平的影響

與空白組相比，模型組血漿、肝臟、腦組織中的GSH-Px水平明顯下降(P<0.05)。灌胃給予FVGL后，低、中、高劑量組和VE陽性組均可提高大鼠GSH-Px水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 FGVL對(duì)過氧化損傷大鼠血漿及臟器內(nèi)GSH-Px水平的影響

3.5 FGVL對(duì)大鼠血漿和臟器組織中T-SOD水平的影響

由表4可知，D-半乳糖連續(xù)注射一段時(shí)間后，大鼠的血漿、肝臟、腦組織中T-SOD水平下降，F(xiàn)GVL低劑量組灌胃后血漿中T-SOD水平增加，但無明顯差異，而中、高劑量組和VE陽性組可顯著提高T-SOD水平，差異具有顯著性(P<0.05)。除FVGL中劑量組外，低、高劑量組和VE陽性組均可顯著提高大鼠肝臟中T-SOD水平，且與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而對(duì)提高腦組織中T-SOD水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 FGVL對(duì)過氧化損傷大鼠血漿及臟器內(nèi)T-SOD水平的影響

3.6 FGVL對(duì)大鼠血漿和臟器組織中MDA水平的影響

與空白組相比，模型組血漿、肝臟、腦組織中的MDA含量明顯升高(P<0.05)。除 FGVL低劑量組外，各給藥組均能不同程度降低血漿、肝臟、腦組織中MDA含量，且與模型組比較具有顯著差異(P<0.05)，見表5。

表5 FGVL對(duì)D-半乳糖致過氧化損傷大鼠血漿及臟器內(nèi)MDA水平的影響

4 討論

機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生能夠攻擊生物膜中多數(shù)不飽和脂肪酸的超氧化物，進(jìn)一步引發(fā)脂質(zhì)過氧化，形成脂質(zhì)過氧化物(LOOH)，如醛基(丙二醛MDA)、酮基、羥基、羧基等，對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行攻擊并破壞。因此，MDA含量的高低間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。而總超氧化物歧化酶(T-SOD)能夠?qū)⒊趸镛D(zhuǎn)化為過氧化氫，進(jìn)而由過氧化氫酶或谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)轉(zhuǎn)化為水。此外，GSH-Px能夠使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，并特異性地將還原型谷胱甘肽(GSH)轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)(見圖1)，在保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性中起重要作用[9]。T-SOD和GSH-Px的含量能夠反映機(jī)體清除氧自由基的能力，通常被認(rèn)為是考察機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)能力的指標(biāo)[10]。因此，測(cè)定過氧化損傷大鼠血漿及臟器組織中MDA、T-SOD及GSH-Px的水平對(duì)于考察FVGL的抗氧化損傷作用具有重要意義。

圖1 FVGL抗氧化損傷機(jī)制

本研究造模及給藥過程中，各組大鼠心臟質(zhì)量與模型組大鼠差異不大，F(xiàn)VGL各劑量組和模型組較空白組大鼠心臟質(zhì)量小，陽性對(duì)照組及FVGL各劑量組與模型組相比均提高3.39%。說明此劑量(150 mg/kg)的D-半乳糖對(duì)大鼠心臟損傷不大[11]，且灌胃給予FVGL對(duì)大鼠的心臟沒有損傷。

目前研究表明，人類衰老是一個(gè)氧化損傷的過程，而很多疾病與氧化損傷相關(guān)，因此抗氧化損傷藥物對(duì)衰老相關(guān)疾病的預(yù)防及治療具有重要意義。本研究通過腹腔注射D-半乳糖建立大鼠過氧化損傷模型，以不同濃度FVGL給藥，探討其對(duì)過氧化損傷大鼠體內(nèi)抗氧化水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)VGL各劑量組和VE組能夠減輕過氧化損傷大鼠的衰老癥狀，且對(duì)過氧化損傷大鼠的肝、脾、腎和腦組織受損有一定的改善作用，增加臟器指數(shù)。同時(shí)，F(xiàn)VGL三個(gè)劑量組均能不同程度使血漿，肝臟，大腦組織中T-SOD、GSH-Px水平升高，MDA水平降低。因此，F(xiàn)VGL能夠提高大鼠抗氧化能力，改善組織器官的氧化損傷，延緩機(jī)體衰老。

綜上所述，蓬子菜作為藥食同源植物，可預(yù)防機(jī)體早衰，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化[12]、血栓、心腦血管[13]等慢性疾病的預(yù)防與治療具有重要意義及開發(fā)前景。