接骨木提取物對(duì)酒精性骨重構(gòu)大鼠模型骨代謝、骨穩(wěn)態(tài)及骨凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

申意偉，李雪，李毅，范楨亮，李佐，楊冰佑

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150001；3.北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150040；4.東北師范大學(xué)生命科學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130024；5.浙江省中醫(yī)院腎病科,浙江 杭州 310006)

酒精性骨重構(gòu)(Alcoholic Bone Remodeling，ABR)是以全身骨質(zhì)和骨量異常為特征[1-2]，是酒精誘導(dǎo)骨組織細(xì)胞異常代謝而導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡的綜合反映，表現(xiàn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等活性和功能異常[3]，破壞了成骨/破骨生理平衡，破壞了骨生物力學(xué)性能[4]，是酒精性骨壞死、酒精性骨質(zhì)疏松癥[5-6]等的共同病理過(guò)程。接骨木(SambucuswilliamsiiHance)系忍冬科接骨木屬植物，又名續(xù)骨木、鐵骨散、舒筋樹(shù)，為落葉灌木或喬木，分布于中國(guó)，韓國(guó)和日本的不同地區(qū)，其天然資源極為豐富。接骨木為民間骨病治療常用藥，已有數(shù)千年歷史，其性味甘苦平，無(wú)毒，具有祛風(fēng)利濕、活血止痛等功效，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化等作用，主要用于治療骨質(zhì)疏松[7]、骨折[8]、跌打腫痛及創(chuàng)傷出血等病癥[9-10]。在前期研究證實(shí)接骨木促進(jìn)骨折愈合、抗炎癥、抗氧化及改善骨穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)上[8,11-13]，本研究擬進(jìn)一步采用酒精腹腔注射復(fù)制酒精性骨重構(gòu)大鼠模型，從骨代謝、骨穩(wěn)態(tài)及骨凋亡等角度評(píng)價(jià)接骨木對(duì)酒精性骨紊亂的干預(yù)作用，為臨床防治酒精性骨病提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10周齡雄性SD大鼠30只，清潔級(jí)，體質(zhì)量205～245 g，由遼寧沈陽(yáng)長(zhǎng)生科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。屏障系統(tǒng)條件下[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(黑)2016004]，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，周期照明，室內(nèi)室溫 20～25 ℃，相對(duì)濕度 40%～70%，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲食和飲水。

1.1.2 儀器

酶標(biāo)儀，杭州奧盛儀器有限公司(型號(hào)：AMR-100)；大小鼠電子秤，北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司(型號(hào)：JNT-DC)；實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，美國(guó)Applied Bio-Systems Instruments公司(型號(hào)：ABI 7900HT)；電泳儀，美國(guó)Electrophoresis Power Supply公司(型號(hào)： EPS 301GE)；分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司(型號(hào)：NanoDrop 2000C)；顯微鏡，日本Nikons公司(型號(hào)：Eclipse Ci-L) ，雙色紅外熒光成像系統(tǒng)，美國(guó)LI-COR Odyssey公司(型號(hào)：ODY-2569)。

1.1.3 藥品與試劑

1.1.3.1 接骨木提取物制備方法

干燥的接骨木根皮(5 kg)，經(jīng)95%乙醇(75 L)回流提取2次，每次2 h，過(guò)濾，合并提取液，濃縮干燥得乙醇提取物(264 g)。將乙醇提取物加水溶解，經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱色譜柱，用20倍樹(shù)脂床體積的蒸餾水洗去糖等水溶性雜質(zhì)，用50%乙醇、95%乙醇依次洗脫，減壓回收50%乙醇洗脫液，即為本研究供試藥品(105 g)，已經(jīng)證明為接骨木主要藥效部位及組分[8,11]。

1.1.3.2 試劑

無(wú)水乙醇(致遠(yuǎn)化學(xué)科技有限公司，批號(hào)20171113)；切片石蠟(匯恒化工科技有限公司，批號(hào)39601095)；中性樹(shù)膠(索萊寶科技有限公司，批號(hào)20190827)；中性福爾馬林固定液(索萊寶科技有限公司，貨號(hào): G2161)；改良HE染色試劑盒(索萊寶科技有限公司，貨號(hào):G1121)；RIPA緩沖液(碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：P0013B)；BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：P0012)；QuickBlockTMWestern封閉液(碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：P0252)；TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15596018)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司，批號(hào)：A5000)；實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系試劑盒(美國(guó)Promega公司，批號(hào)：A6010)。Anti-Cleaved Caspase-3抗體(Abcam ,ab49822)、重組Anti-Caspase-3抗體(Abcam ,ab224271)、重組Anti-Bax抗體 (Abcam ,ab32503)、Anti-beta Actin抗體(Abcam，ab8226)。維生素D(VD)檢測(cè)試劑盒(美國(guó)ImmunoClone(I&C)公司，貨號(hào)：ZY-VD-Ge)；大鼠IGF-1檢測(cè)試劑盒(上海康朗生物科技有限公司，貨號(hào)：im-E30653)；大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶(ACP5)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)：E-EL-R0939c)；大鼠骨鈣素/骨谷氨酸蛋白(OT/BGP)ELISA Kit(武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)：CSB-E05129r)。

1.2 分組與干預(yù)

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后, 隨機(jī)分為空白組、模型組和中藥組, 每組10只。模型組和中藥組大鼠參考酒精性骨重構(gòu)模型造模方法[14]采用20%(v∶v)酒精腹腔注射，10 mL/kg, 每日1次，共12周，復(fù)制酒精性骨損傷模型；正常組給予等體積生理鹽水腹腔注射。在造模開(kāi)始第1天，中藥組在酒精造模基礎(chǔ)上給予接骨木提取物340 mg/kg，每日1次灌胃，共12周；空白組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.3 樣本采集及處理

大鼠稱重后禁食12 h，麻醉后心臟取血，3 000 r/min、4 ℃離心15 min后分離血清，-80 ℃恒溫冰箱保存?zhèn)溆?。游離取股骨、椎體，剔除附著軟組織，根據(jù)不同檢測(cè)指標(biāo)給予相應(yīng)處置、備用。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 椎體HE染色

取動(dòng)物新鮮組織塊投入固定液中使組織、細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性凝固；用不同梯度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水分；將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫，待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋；將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成薄片，一般厚度為5～8 μm，貼到載玻片上，放45 ℃恒溫箱中烘干；用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經(jīng)不同濃度酒精洗脫，最后入蒸餾水；放入蘇木精-伊紅染色液染色數(shù)分鐘；經(jīng)無(wú)水乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明，封片。

1.4.2 qRT-PCR法檢測(cè)骨代謝標(biāo)記基因表達(dá)

游離腰5椎體，剔除周?chē)浗M，預(yù)處理骨組織樣品[14]，注意樣品完整性。根據(jù)操作指南說(shuō)明，使用TRIzol試劑(Invitrogen，CA，USA)提取骨組織樣品總RNA，并根據(jù)操作指南說(shuō)明使用高效cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。qRT-PCR在ABI 7900實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，條件如下：保持階段為95 ℃ 10 min，循環(huán)為40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s。檢查了以下基因的表達(dá)：I型膠原蛋白Alpha 2鏈(COL1A2，上游5′-AAGAATGCATACAGCCGTGC-3′，下游5′-ACTGCTCTGACCAATCCTTC-3′)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2，上游5′-TGCGGTCTCCTAAAGGTCG-3′，下游5′-GGACTTAAGACGCTTCCGCT-3′)，骨γ-羧基谷氨酸蛋白(BGLAP，上游5′-TGCGGTCTCCTAAAGGTCG，GGACTTAAGACGCTTCCGCT-3′)，NF-κβ配體的受體激活劑(RANKL，上游5′-TGATGGAAGGTTCGTGGCTC-3′，下游5′-GGTACGCTCCCTGAGGTTTC-3′)，白介素6(IL-6，上游5′-CCAGTTGCCTTCTTGGGACT-3′，下游5′-TCTGACAGTGCATCATCGCT-3′)和骨保護(hù)素(OPG，上游5′-GGCACACGAGTGATGAATGC-3′，下游5′-TCTTCGCACAGGGTGACATC-3′)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，上游5′-GTGAAGGTCGGTGTGAACGG-3′，下游5′-CCCCATTTGATGTTAGCGGG-3′)基因的表達(dá)水平作為參考。每個(gè)基因qRT-PCR進(jìn)行3次重復(fù)處理。隨后確定循環(huán)閾值(Ct)，并使用2-ΔΔCT方法比較計(jì)算mRNA表達(dá)的相對(duì)定量。

1.4.3 ELISA法檢測(cè)血清骨代謝標(biāo)物IGF-1和Vitamin D以及骨穩(wěn)態(tài)標(biāo)物OCN和TRAP含量

按照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4 Western blot法檢測(cè)凋亡標(biāo)記基因表達(dá)

骨組織在RIPA裂解緩沖液中裂解，離心，用上樣緩沖液稀釋?zhuān)?5 ℃加熱6 min。使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。隨后，蛋白樣品通過(guò)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并印跡到聚偏二氟乙烯膜上(Millipore，Billerica，MA，USA)。將膜在封閉液中封閉2 h，分別在Anti-Cleaved Caspase-3抗體、重組Anti-Caspase-3抗體、重組Anti-Bax抗體和Anti-beta Actin抗體稀釋液中4 ℃過(guò)夜。TBST洗滌3次，10 min/次，將膜與熒光基團(tuán)偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1.5～2 h。熒光條帶通過(guò)奧德賽(Odyssey)雙色紅外熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并可視化定量分析。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)結(jié)果

HE染色結(jié)果表明，模型組較空白組骨小梁數(shù)目、骨小梁連通度減少，髓腔脂肪細(xì)胞數(shù)目增加，提示酒精攝入可導(dǎo)致骨質(zhì)減少；中藥組較模型組骨小梁數(shù)目、骨小梁連通度增加，髓腔脂肪細(xì)胞數(shù)目趨于正常水平，提示長(zhǎng)期酒精攝入可導(dǎo)致大鼠骨質(zhì)和骨量紊亂及髓脂代謝異常，接骨木提取物可在一定程度上拮抗酒精誘導(dǎo)的骨質(zhì)和骨量代謝異常，可對(duì)酒精性骨重構(gòu)起積極干預(yù)作用，見(jiàn)圖1。

注：A.空白組；B.模型組；C.中藥組。圖1 椎體HE染色(×50)

2.2 各組對(duì)骨重構(gòu)標(biāo)志物mRNA的影響

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組骨形成相關(guān)基因BMP2、COL1A2和BGLAP mRNA 表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示長(zhǎng)期酒精攝入對(duì)骨形成有顯著抑制作用；破骨活化相關(guān)基因RANKL和IL-6 mRNA表達(dá)顯著增加，而骨保護(hù)素OPG mRNA表達(dá)顯著降低，提示長(zhǎng)期酒精攝入可激活破骨水平，增加骨質(zhì)吸收，由此可見(jiàn)，酒精性骨重構(gòu)表現(xiàn)為骨形成減少、骨吸收增加的骨穩(wěn)態(tài)失衡。與模型組比較，中藥組骨形成相關(guān)基因BMP2、COL1A2和BGLAP mRNA表達(dá)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示骨碎補(bǔ)提取物可在一定程度上拮抗酒精對(duì)骨形成有顯著抑制作用；破骨活化相關(guān)基因RANKL和IL-6 mRNA表達(dá)顯著降低，而骨保護(hù)素OPG mRNA表達(dá)顯著增加，提示骨碎補(bǔ)提取物可在一定程度上拮抗長(zhǎng)期酒精攝入誘導(dǎo)破骨水平激活，抑制骨質(zhì)吸收，由此可見(jiàn)，骨碎補(bǔ)提取物可在一定程度上恢復(fù)酒精性骨重構(gòu)所致骨形成減少、骨吸收增加的骨穩(wěn)態(tài)失衡，平調(diào)成骨/破骨動(dòng)態(tài)水平，平衡骨質(zhì)代謝，見(jiàn)表1。

表1 各組骨重構(gòu)標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平情況

2.3 各組對(duì)血清骨代謝標(biāo)物IGF-1和Vitamin D水平的影響

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組血清骨代謝標(biāo)物IGF-1含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示長(zhǎng)期酒精攝入可使IGF-1含量降低，有礙骨質(zhì)形成；與模型組比較，中藥組血清骨代謝標(biāo)物IGF-1含量顯著增加(P<0.05)，提示骨碎補(bǔ)提取物可在一定程度上拮抗長(zhǎng)期酒精攝入誘導(dǎo)的骨質(zhì)形成紊亂。血清Vitamin D含量在各組間均無(wú)顯著差異，見(jiàn)表2。

表2 各組血清骨代謝標(biāo)物IGF-1和Vitamin D水平

2.3 各組對(duì)血清骨穩(wěn)態(tài)標(biāo)物OCN和TRAP含量的影響

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組血清骨穩(wěn)態(tài)標(biāo)物TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase 5)(骨吸收標(biāo)記物)含量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示長(zhǎng)期酒精攝入可破壞骨穩(wěn)態(tài)失衡，有利骨質(zhì)吸收；與模型組比較，中藥組血清骨穩(wěn)態(tài)標(biāo)物TRAP含量顯著減少(P<0.05)，提示骨碎補(bǔ)提取物可在一定程度上拮抗長(zhǎng)期酒精攝入誘導(dǎo)的骨質(zhì)吸收紊亂。血清OCN(骨形成標(biāo)記物)含量在各組間均無(wú)顯著差異，見(jiàn)表3。

表3 各組血清骨穩(wěn)態(tài)標(biāo)物OCN和TRAP含量

2.4 各組對(duì)CASP3、BAX凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組凋亡相關(guān)蛋白Cl-CASP3(CASP3活化形式)、BAX表達(dá)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示長(zhǎng)期酒精攝入可增加細(xì)胞凋亡水平，誘導(dǎo)骨重構(gòu)紊亂與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。與模型組比較，中藥組凋亡相關(guān)蛋白Cl-CASP3(CASP3活化形式)、BAX表達(dá)顯著降低，提示骨碎補(bǔ)提取物可在一定程度上拮抗酒精誘導(dǎo)的凋亡活化，見(jiàn)表4、圖2。

表4 各組CASP3、BAX凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

圖2 各組CASP3、BAX凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討論

酒精性骨重構(gòu)(又稱酒精性骨重建、酒精性骨重造、酒精性骨重塑、酒精性骨減少等)是以全身骨質(zhì)和骨量異常為特征[1]，是酒精誘導(dǎo)骨組織細(xì)胞異常代謝而導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡的綜合反映(本研究中，酒精誘導(dǎo)的骨代謝紊亂及微觀結(jié)構(gòu)異常可見(jiàn)圖1和表1、2等)，其最終表現(xiàn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞活性和功能異常，破壞了成骨/破骨生理平衡，是酒精性骨壞死、酒精性骨質(zhì)疏松癥[5]等的共同病理過(guò)程。本研究結(jié)果表明，骨碎補(bǔ)提取物可在一定程度上拮抗長(zhǎng)期酒精攝入誘導(dǎo)破骨水平激活，抑制骨質(zhì)吸收，一定程度上恢復(fù)酒精性骨重構(gòu)所致骨形成減少、骨吸收增加的骨穩(wěn)態(tài)失衡，平調(diào)成骨/破骨動(dòng)態(tài)水平，平衡骨質(zhì)代謝(見(jiàn)圖1和表1等)。前期動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酒精對(duì)骨重構(gòu)的影響是多維態(tài)的，既可表現(xiàn)為骨微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)異常、骨生物力學(xué)性能降低、機(jī)體代謝紊亂、氧化 還原失衡和破骨細(xì)胞異常活化，又可表現(xiàn)為酒精介導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)形態(tài)異常、氧化應(yīng)激增高、自噬改變、凋亡亢進(jìn)[15]和成骨分化紊亂等[4]。中藥單體丹酚酸B可能主要通過(guò)調(diào)節(jié)酒精介導(dǎo)的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)增高來(lái)緩解BMSCs凋亡，增加細(xì)胞活力和促進(jìn)細(xì)胞存活，柚皮苷對(duì)BMSCs活力作用不如丹酚酸B顯著;柚皮苷可能主要通過(guò)促進(jìn)BMSCs 成骨分化來(lái)干預(yù)酒精對(duì)骨形成的抑制作用，丹酚酸B對(duì)酒精性成骨分化抑制亦有一定改善作用，但不如柚皮苷顯著，且丹酚酸B對(duì)成脂分化的抑制作用亦較柚皮苷弱[4]。補(bǔ)腎活血法可作為防治酒精性骨病的方法之一[6,16]。酒精對(duì)骨重構(gòu)的影響是多維態(tài)的，抗氧化、抗凋亡和調(diào)節(jié)成骨/成脂骨穩(wěn)態(tài)可能是干預(yù)酒精性骨重構(gòu)的有效靶點(diǎn)[3-4]。

接骨木含有粗脂肪、粗蛋白、粗纖維、總糖等主要營(yíng)養(yǎng)成分和鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等礦質(zhì)元素以及氨基酸等，營(yíng)養(yǎng)豐富,各種營(yíng)養(yǎng)成分較為全面。前期實(shí)驗(yàn)我們已經(jīng)確定了接骨木根皮促進(jìn)骨折愈合的有效部位及可能活性組分[17]。(7R,8S)-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphe-noxy]-1,3-propanediol (PPD)是一種從接骨木分離鑒定的具有骨保護(hù)作用的化合物，可以在大鼠類(lèi)成骨UMR 106細(xì)胞、前成骨MC3T3-E1細(xì)胞以及BMSC細(xì)胞的成骨過(guò)程的不同階段發(fā)揮類(lèi)雌激素活性，從而刺激成骨細(xì)胞功能。進(jìn)一步研究表明，PPD可能通過(guò)ER配體非依賴性方式激活ERK / MAPK信號(hào)通路而在UMR 106細(xì)胞中發(fā)揮其雌激素作用。淫羊藿苷也曾報(bào)道過(guò)類(lèi)似的作用方式調(diào)節(jié)UMR 106細(xì)胞[18]、MC3T3-E1細(xì)胞[19]和骨細(xì)胞[20]成骨分化。木質(zhì)素類(lèi)為接骨木主要組分之一。一些研究報(bào)告了木脂素在體內(nèi)和體外對(duì)骨骼的有益作用。從杜仲中提取的總木脂素有效地抑制了卵巢切除術(shù)(OVX)誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失，并促進(jìn)了原代成骨細(xì)胞的增殖，分化和骨蛋白原(OPG)表達(dá)[21]。芝麻中的主要木脂素芝麻素通過(guò)加速成骨細(xì)胞基因的表達(dá)來(lái)刺激成骨細(xì)胞成熟而發(fā)揮功能[22]。北五味子果實(shí)和種子中的木質(zhì)素增加成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶的活性[23]。盡管已經(jīng)證明了一些木脂素對(duì)骨骼的合成代謝作用，但兩項(xiàng)臨床研究表明，亞麻籽中的木脂素在防止更年期婦女骨質(zhì)流失方面并不有效[24-25]。關(guān)于木脂素對(duì)酒精性骨骼損傷的作用的報(bào)道相對(duì)有限，并且亞麻籽中木脂素對(duì)骨骼缺乏保護(hù)作用可能是由于所使用的木脂素的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同所致。因此，為了系統(tǒng)地評(píng)估木脂素對(duì)骨骼的保護(hù)作用，并解析接骨木骨骼保護(hù)作用的機(jī)制需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和臨床研究。本研究證實(shí)，接骨木提取物對(duì)酒精性骨病有積極干預(yù)作用，其干預(yù)直接可能通過(guò)改善骨質(zhì)代謝、恢復(fù)骨穩(wěn)態(tài)和拮抗酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制有關(guān)。

本研究HE染色結(jié)果提示長(zhǎng)期酒精攝入可導(dǎo)致大鼠骨質(zhì)和骨量紊亂及髓脂代謝異常，接骨木提取物可在一定程度上拮抗酒精誘導(dǎo)的骨質(zhì)和骨量代謝異常，可對(duì)酒精性骨重構(gòu)起積極干預(yù)作用。骨重構(gòu)標(biāo)志物mRNA分析結(jié)果表明，長(zhǎng)期酒精攝入對(duì)骨形成有顯著抑制作用，卻可激活破骨水平，增加骨質(zhì)吸收，由此可見(jiàn)，酒精性骨重構(gòu)表現(xiàn)為骨形成減少、骨吸收增加的骨穩(wěn)態(tài)失衡；骨碎補(bǔ)提取物可在一定程度上拮抗長(zhǎng)期酒精攝入誘導(dǎo)破骨水平激活，抑制骨質(zhì)吸收，一定程度上恢復(fù)酒精性骨重構(gòu)所致骨形成減少、骨吸收增加的骨穩(wěn)態(tài)失衡，平調(diào)成骨/破骨動(dòng)態(tài)水平，平衡骨質(zhì)代謝。IGF-1是一種參與骨骼生長(zhǎng)和骨骼合成的關(guān)鍵激素，在酒精性骨重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中起重要作用[26]。本研究表明乙醇處理引起了血清IGF-1水平的降低，提示骨合成代謝紊亂。Vitamin D作為參與骨結(jié)構(gòu)和骨代謝的重要物質(zhì)[27]，本研究中未觀察到酒精攝入導(dǎo)致血清Vitamin D水平顯著變化。骨鈣素是骨合成的標(biāo)志物，是成骨細(xì)胞分泌的高度豐富的骨蛋白，調(diào)節(jié)骨骼的重塑和能量代謝，其編碼的蛋白質(zhì)包含一個(gè)Gla(γ羧基谷氨酸)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可與鈣和骨骼的礦物質(zhì)羥磷灰石結(jié)合。本研究中未觀察到酒精攝入導(dǎo)致血清骨鈣素水平顯著變化。甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)能刺激破骨細(xì)胞分泌TRAP；甲狀旁腺激素是甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的堿性單鏈多肽類(lèi)激素，主要靶向骨和腎臟來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣和磷的代謝，促使血鈣水平升高，血磷水平下降，在骨穩(wěn)態(tài)維持中起重要作用。結(jié)果表明，長(zhǎng)期酒精攝入可增加TRAP水平，有利骨質(zhì)吸收；骨碎補(bǔ)提取物可在一定程度上拮抗長(zhǎng)期酒精攝入誘導(dǎo)的骨質(zhì)吸收紊亂。Cl-CASP3(Cleaved caspase-3，為caspase-3活化形式)作為調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子。酒精增加Cl-CASP3表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，研究表明骨組織活化的caspase-3含量與骨密度呈負(fù)相關(guān)[15]，接骨木可能通過(guò)拮抗酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)干預(yù)酒精性骨重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。

本研究表明，接骨木提取物可能是通過(guò)拮抗酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡亢進(jìn)、增加血清IGF-1水平和降低TRAP含量，增加骨小梁數(shù)目，來(lái)恢復(fù)酒精性骨穩(wěn)態(tài)失衡，促進(jìn)骨質(zhì)形成而抑制骨質(zhì)吸收，恢復(fù)正常骨代謝和維持正常骨穩(wěn)態(tài)以減緩酒精對(duì)骨質(zhì)和骨量的毒副作用，同時(shí)為臨床防治酒精性骨病提供了參考和依據(jù)。