基于合相色譜技術(shù)的麻黃多糖干預(yù)肺損傷小鼠糞便中短鏈脂肪酸測定方法的開發(fā)

魏禎，苑宏宇，劉俊希，梁軍，夏永剛

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

麻黃最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性溫，味辛微苦，歸肺、膀胱經(jīng)，具有發(fā)汗解表，宣肺平喘，利水消腫等功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，麻黃多糖對急性肺損傷，哮喘等肺部疾病都具有良好的治療作用?；谥嗅t(yī)基礎(chǔ)理論“肺與大腸相表里”，臨床研究發(fā)現(xiàn)肺部疾病與腸道疾病伴隨發(fā)生，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)麻黃多糖對肺部疾病有較好的治療作用，同時對腸道微生物和短鏈脂肪酸(SCFAs)具有一定的影響[2]。SCFAs是一種少于6個碳原子的飽和脂肪族脂肪酸。由于SCFAs的代謝、神經(jīng)調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)作用，SCFAs在穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用。它們可以影響腸道微生物的生長和組成，從而進一步影響宿主的健康[3]。SCFAs不僅是結(jié)腸細胞的主要能量來源，過量的SCFAs還具有其他功能，如提供日常卡路里需求和參與碳水化合物和脂肪等重要營養(yǎng)物質(zhì)的代謝[4]。常見的SCFAs包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸和異己酸。結(jié)腸腔中的SCFAs是重要的有機酸陰離子，主要由碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生[5]，也可能由蛋白質(zhì)和氨基酸分解產(chǎn)生[6]。研究表明，在一定濃度范圍內(nèi)，短鏈脂肪酸可促進細胞生長，改善腸道功能，影響心血管代謝，并具有抗炎、抗腫瘤活性[7]；此外，SCFAs與炎癥性腸病[8]、結(jié)直腸癌[9]、阿爾茨海默病[10]和2型糖尿病(T2DM)[11]以及肥胖[12]等疾病密切相關(guān)，它們在調(diào)節(jié)結(jié)腸免疫功能和能量代謝方面起著至關(guān)重要的作用[13]。因此，對SCFAs的定性和定量研究有助于闡明飲食、腸道菌群和宿主代謝穩(wěn)態(tài)之間的復(fù)雜相互作用，這對于相關(guān)疾病的診斷和治療也起著至關(guān)重要的作用[14]。故SCFAs分析方法的開發(fā)在多個領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。

由于SCFAs的高極性和寬濃度范圍,以及糞便樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，對其進行分析是一個重大挑戰(zhàn)。目前，常見的SCFAs定量方法包括氣相色譜法(GC)[15]，高效液相色譜法(HPLC)[16]，液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[17]和毛細管電泳法(CE)[18]。上述方法大多使用許多對環(huán)境和人類健康有害的有機溶劑和試劑。此外，復(fù)雜的衍生操作增加了反應(yīng)時間，降低回收率，影響方法的準確性和重復(fù)性。超高效合相色譜(Ultra Performance Convergence Chromatography，UPCC或UPC2)不同于傳統(tǒng)的氣相色譜與液相色譜[19-20]，其主要的優(yōu)點是用低成本且無毒的CO2代替了有毒的揮發(fā)性有機溶劑，不僅減少廢液處理環(huán)節(jié)，而且還保護了環(huán)境和實驗人員的身體健康。通過數(shù)據(jù)庫檢索，目前尚未發(fā)現(xiàn)在國內(nèi)外有科研人員采用超高效合相色譜法進行SCFAs的檢測，因此，本研究擬開發(fā)一種簡便、環(huán)保、準確度高、重復(fù)性好的SCFAs測定方法，并首次建立基于UPC2的SCFAs定性定量的分析方法測定麻黃多糖干預(yù)PM 2.5所致肺損傷小鼠糞便中短鏈脂肪酸的含量，通過對該方法的精密度、準確度和回收率的表征，證明了該方法可用于準確定量測定小鼠糞便中SCFAs，為研究動物體內(nèi)SCFAs類化合物的代謝提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

BALB/c小鼠，SPF級，雌性，體質(zhì)量18～20 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，質(zhì)量合格證書編號：SCXK(遼)2020-0001。實驗室溫度為22～24 ℃，濕度50%，明暗交替，自由飲水。本實驗符合實驗動物倫理委員會的倫理學(xué)標準。

1.2 藥物與試劑

異己酸、2-甲基丁酸、異丁酸、異戊酸、丙酸、乙酸標準品(美國CFW Laboratories公司，批號分別為：0606071-AS，4109261-AS，1208261-AS，4402071-AS，8014271-AS，0402161-AS)，丁酸標準品(美國Nu-Chek Prep公司，批號：N-4A-J5-B)，戊酸(美國CFW Laboratories公司)，二氯甲烷(天津星馬克科技發(fā)展有限公司)，甲醇，乙腈色譜級(美國Fisher公司)，水為超純水，其余均為分析純，高純度CO2(哈爾濱卿華工業(yè)氣體有限公司)，PM 2.5(哈爾濱市環(huán)境監(jiān)測中心)，卵白蛋白(OVA，美國sigma公司)，麻黃購于山西大同藥材公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室蘇連杰教授鑒定為麻黃科植物草麻黃(EphedrasinicaStapf)的干燥草質(zhì)莖，符合2020版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定，麻黃多糖(自制)。

1.3 儀器

本次實驗使用ACQUITY UPC2(Waters, Milford, MA, USA)色譜系統(tǒng)，帶有二氧化碳和助溶劑供應(yīng)的二元泵，自動進樣器，柱恒溫器，自動背壓調(diào)節(jié)器(ABPR)和PDA檢測器。TorusTMDEA色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.7 μm)，Viridis BEH色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.7 μm)，Viridis CSH Fluoro-Phenyl色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.7 μm)，TorusTMDIOL色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.7 μm)，TrefoilTMAMY1色譜柱(3.0 mm×150 mm,2.5 μm)，Viridis BEH-2EP色譜柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)以及TorusTM2-PIC色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)(美國Waters公司)。Milli-Q型超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 標準溶液的配置

精密稱取8種有機酸標準品，加入乙腈溶解，配置得混合標準品母液濃度為60 mg/mL，稀釋母液至濃度為0.25，0.5，1，2，4，8，10，16，40，60 mg/mL，0.22 μm有機濾膜過濾后，直接進行超高效合相色譜分析。這些混合標準品溶液用于優(yōu)化實驗條件，并構(gòu)建SCFAs定量的標準曲線。

2.2 動物實驗分組及給藥

將小鼠隨機分為空白組、模型組、給藥組，每組10只。經(jīng)過1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，模型組與給藥組小鼠分別在第1，8，15天腹腔注射OVA(濃度0.5 mg/mL)致敏，空白組小鼠腹腔注射生理鹽水；給藥組于第17天開始每日給藥麻黃多糖，給藥劑量為100 mg/kg (空白組與模型組給予同劑量的生理鹽水)，給藥10 d；模型組，給藥組于第22天先采用OVA溶液(濃度10 mg/mL)霧化30 min，再用自制的PM 2.5分散液(濃度10 mg/mL)進行霧化激發(fā)30 min(同時空白組采用生理鹽水霧化處理)；造模結(jié)束后直接接取小鼠糞便于無菌離心管中，立即放入-80 ℃冰箱儲存。

2.3 短鏈脂肪酸樣品的處理方法

根據(jù)ZHANG[21]等人對糞便樣品中SCFAs的預(yù)處理方法在本次實驗中進行了優(yōu)化。將收集的糞便樣品經(jīng)冷凍干燥后，研磨制成粉末。精密稱取不同樣本中小鼠糞便100 mg置5 mL離心管中，加入2 mL 1 mol/L稀鹽酸提取，渦旋10 min，充分混勻，超聲提取10 min后，在12 000 r/min 4 ℃條件下離心15 min，取1 mL上清液移入5 mL離心管中，0.22 μm水膜過濾，加1 mL二氯甲烷萃取，靜置5 min后，在12 000 r/min 4 ℃條件下離心15 min，取下層，0.22 μm有機濾膜過濾，進行SCFAs檢測。

2.4 色譜柱篩選

色譜柱篩選試驗的目的是選擇合適的色譜柱進一步優(yōu)化方法。篩選試驗的標準是8種標準品有機酸的峰形，峰寬以及分離率?；旌蠘藴势钒凑铡?.1”項下制備后，對7種不同類型的Acquity UPC2色譜柱進行了評價，包括TorusTMDEA 色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.7 μm)，Viridis BEH色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.7 μm)，Viridis CSH Fluoro-Phenyl色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.7 μm)，TorusTMDIOL色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.7 μm)，TrefoilTMAMY1色譜柱(3.0 mm×150 mm,2.5 μm)，Viridis BEH-2EP色譜柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)以及TorusTM2-PIC色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，流動相A為CO2，流動相B為5%水-甲醇，色譜條件為：柱溫:50 ℃，進樣量:5 μL，流速:0.7 mL/min，檢測波長：217 nm。梯度洗脫條件：0～2 min，10%B～18%B；2～5 min，18%B～20%B；5～8 min，20%B～50%B；8～10 min，50%B；在下一次注入之前重新平衡時間為5 min。

由圖1可知，8種SCFAs在不同的固定相上的色譜行為差別較大，其中僅DEA分離效果最佳，因此，確定SCFAs分析最佳色譜柱是DEA。

注：1.異己酸;2.2-甲基丁酸;3.異丁酸;4.異戊酸;5.戊酸;6.丁酸;7.丙酸;8.乙酸;A.AMY1;B.BEH-2EP;C.BEH;D.CSH;E.DIOL;F.2-PIC;G.DEA。圖1 不同固定相上的色譜行為

2.5 流動相篩選

試驗的目的是選擇合適的流動相進一步優(yōu)化方法，使8種標準品有機酸具有較好的峰形、峰寬以及分離率?；旌蠘藴势钒凑铡?.1”項下制備后，對以下流動相進行考察，包括純甲醇，50%乙腈-甲醇，0.2%磷酸-甲醇，50%異丙醇-甲醇，2.5%水-甲醇，5%水-甲醇。對流動相篩選試驗色譜條件為：柱溫:50 ℃，進樣量:5 μL，流速:0.7 mL/min，檢測波長：217 nm；梯度洗脫條件：0～5 min，10%B；5～10 min，10%B～50%B；在下一次注入之前重新平衡時間為5 min。

由圖2可知，8種SCFAs經(jīng)不同的有機相洗脫，洗脫速率有顯著差異，其中5%水-甲醇分離效果最佳，可以看到8個標準品峰，因此，確定SCFAs分析最佳有機相是5%水-甲醇。

注：1.異己酸;2.2-甲基丁酸;3.異丁酸;4.異戊酸;5.戊酸;6.丁酸;7.丙酸;8.乙酸;A.甲醇;B.50%乙腈-甲醇;C.50%異丙醇-甲醇;D.0.2%磷酸-甲醇;E.2.5%水-甲醇;F.5%水-甲醇。圖2 不同流動相的色譜行為

2.6 流速選擇

UPC2采用超臨界流體CO2作為主要流動相，因其具有液體的高密度及氣體低黏度的雙重特點，以及介于氣體與液體之間的擴散系數(shù)特征，使流動相在分離過程中具有較高的線速度[22]。本次實驗在0.6～1.0 mL/min范圍內(nèi)對流速進行優(yōu)化。混合標準品按照“2.1”項下制備后，采用ACQUITY UPC2(Waters Corp,USA)系統(tǒng)分析，色譜條件按照“2.4”項下所示。

由圖3可知，8種SCFAs經(jīng)不同的流速洗脫，隨著流速的不斷升高，分析時間不斷縮短，但同時系統(tǒng)壓力也隨之增大，使儀器損壞的風險不斷升高，同時考慮到對色譜柱的維護，并且為了使系統(tǒng)壓力保持在較低水平，且具有較短分析時間，保證SCFAs具有良好的分離度與峰型，本研究選擇的流速為0.7 mL/min。

注：1.異己酸;2.2-甲基丁酸;3.異丁酸;4.異戊酸;5.戊酸;6.丁酸;7.丙酸;8.乙酸;A.0.6 mL/min;B.0.7mL/min;C.0.8 mL/min;D.0.9 mL/min;E.1.0 mL/min。圖3 流速對短鏈脂肪酸分離選擇性的影響

2.7 動態(tài)背景壓力(ABPR)的選擇

在超高效合相色譜(UPC2)中，其動態(tài)的背景壓力(ABPR)控制CO2使其處于超臨界流體狀態(tài)，是影響分離過程的重要因素之一。在不同的ABPR下，超臨界流體CO2對各種待測物有著不同的溶解能力。當背壓升高時，超臨界流體密度會增大，溶劑化能力增強，柱壓升高[23]。本研究考察了ABPR為1 500，1 700，1 900，2 100 ，2 300 psi時，超臨界流體對待測物分離的影響。混合標準品按照“2.1”項下制備后，采用ACQUITY UPC2(Waters Corp., USA)系統(tǒng)分析，色譜條件按“2.4”項下所示。由圖4可知，8種SCFAs在不同的背景壓力下洗脫，色譜行為差異較小，考慮到色譜柱的維護，確定SCFAs分析最佳背景壓力是1 500 psi。

注：1.異己酸;2.2-甲基丁酸;3.異丁酸;4.異戊酸;5.戊酸;6.丁酸;7.丙酸;8.乙酸;A.1 500 psi;B.1 700 psi;C.1 900 psi;D.2 100 psi;E.2 300 psi。圖4 背景壓力對短鏈脂肪酸分離選擇性的影響

2.8 梯度優(yōu)化

由于SCFAs為極性化合物，因此必須使用有機改性劑來增加流動相的極性。甲醇具有良好的洗脫強度，是最常用的助溶劑之一[24]。甲醇梯度程序是影響SCFAs在UPC2中分析時間的最關(guān)鍵參數(shù)之一。為了選擇合適的梯度，考慮了梯度條件(包括梯度時間，流動相初始濃度和最終濃度)。助溶劑的最初濃度為10%，最終濃度為20%，可以保證峰形及不同化合物之間的分離度。同時，隨著梯度時間的減少，峰寬略有改善，而隨著流動相濃度的升高，分析時間縮短?；旌蠘藴势钒凑铡?.1”項下制備后，采用優(yōu)化的儀器方法，進一步優(yōu)化洗脫梯度，得到最優(yōu)色譜條件，對照品色譜圖如圖5所示。

注：1.異己酸;2.2-甲基丁酸;3.異丁酸;4.異戊酸;5.戊酸;6.丁酸;7.丙酸;8.乙酸。圖5 UPC2考察SCFAs的色譜圖

2.9 最優(yōu)色譜條件

采用ACQUITY UPC2(Waters Corp,USA)系統(tǒng)，包括色譜柱管理器，二元溶劑管理器，樣品管理器，等度溶劑管理器，PDA檢測器。定量分析采用ACQUITY UPC2TorusTMDEA(3.0 mm×150 mm,1.7 μm )色譜柱進行，柱溫:50 ℃，進樣量:5 μL，流速:0.7 mL/min，檢測波長：217 nm，流動相A為CO2，流動相B為5%水-甲醇。梯度洗脫條件，梯度洗脫條件：0～2 min，10%B～18%B；2～5 min，18%B～20%B；在下一次注入之前重新平衡時間為5 min。

2.10 方法學(xué)考察

2.10.1 標準曲線、最低檢測限及最低定量限

精密移取，按“2.1”項下制備的不同濃度的混合標準品工作液，每個質(zhì)量濃度點分別進樣3次，以質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標，平均峰面積值A(chǔ)為縱坐標，繪制標準曲線。以S/N=3和S/N=10分別確定其最低檢測限和最低定量限。所測得SCFAs的最低檢測限、最低定量限、線性范圍及回歸方程見表1。

表1 SCFAs的回歸方程、最低檢測限、最低定量限、線性范圍

2.10.2 精密度試驗

精密移取，按“2.1”項下配制的標準品溶液，測定有機酸化合物的日內(nèi)和日間精密度。所得異己酸、2-甲基丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸、丁酸及丙酸8種有機酸化合物日內(nèi)精密度RSD值分別為3.77%、3.18%、2.68%、6.76%、2.87%、4.26%、1.87%、3.91%，日間精密度RSD值分別為7.93%、6.43%、7.26%、7.51%、5.92%、4.74%、3.06%、6.02%，表明該儀器精密度良好。

2.10.3 重復(fù)性試驗

取同一批小鼠糞便供試品適量，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.9”項下色譜條件進樣測定，計算得到異丁酸、異戊酸、戊酸、丁酸、乙酸的RSD值分別為3.38%、6.78%、6.24%、3.10%、1.97%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10.4 穩(wěn)定性試驗

按“2.3”項下制備的同一批供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣，按“2.9”項下色譜條件進樣測定，測得異丁酸、異戊酸、戊酸、丁酸、乙酸5種有機酸化合物標準品中峰面積RSD值分別為6.62%、7.56%、3.35%、5.02%、3.51%，表明標準品溶液在4 ℃條件下放置24 h穩(wěn)定性較好。

2.10.5 加標回收率試驗

取已知含量的糞便樣品，加入“2.1”項下制備的一定質(zhì)量濃度的標準品溶液，經(jīng)前處理及UPC2分析后，測得糞便樣品中所含異丁酸、異戊酸、戊酸、丁酸、乙酸的加標回收率分別為90.98%、95.03%、92.89%、102.42%、93.93%，RSD值分別為6.96%、3.58%、5.91%、2.02%、5.64%，表明該方法具有較好的準確度，可以滿足后續(xù)實驗要求。

2.11 樣品測定

按“2.3”項下的方法對小鼠糞便樣品進行預(yù)處理，再采用“2.9”項下方法進行UPC2檢測，樣品各組間SCFAs含量及顯著性差異如表2所示。與空白組比較，模型組小鼠糞便SCFAs中異丁酸和戊酸含量顯著升高(P<0.01)，乙酸含量有所升高，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其中異戊酸和丁酸含量呈現(xiàn)降低的趨勢，不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，給藥組小鼠糞便SCFAs中異丁酸、戊酸和乙酸含量均顯著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.05)，其中異戊酸和丁酸含量呈現(xiàn)升高的趨勢，不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 小鼠糞便中SCFAs的分布情況

3 討論

本實驗開發(fā)了一種快速、高效、經(jīng)濟、環(huán)保、低耗，安全的定量分析SCFAs的新方法。在分析時間方面，目前的UPC2方法與HPLC及GC的方法相比，具有一定優(yōu)勢。通過UPC2對常見的8種SCFAs的分析進行了驗證，對SCFAs的極性物質(zhì)進行分析，具有較好的重現(xiàn)性和較快的分析速度。通過對PM 2.5所致急性肺損傷給藥麻黃多糖后的小鼠糞便中短鏈脂肪酸的研究，其結(jié)果表明，UPC2對于測定SCFAs等酸性化合物可以作為一種新的研究方法。該方法從生物樣品中分離測定SCFAs，具有以下優(yōu)點：不需要衍生，操作簡單，節(jié)省時間，所需的樣品和溶劑較少以及具有良好的重現(xiàn)性。

因此，通過UPC2建立的新型SCFAs的檢測方法不僅可以高效、準確地對其進行分離分析，而且能夠促進人們對其在機體代謝中所發(fā)揮作用的認識，有助于推動與SCFAs相關(guān)的臨床研究[25]，也為超高效合相色譜在測定不同生物樣品中短鏈脂肪酸中的應(yīng)用提供了技術(shù)支持，為短鏈脂肪酸的含量測定研究提供了新思路。同時，UPC2是改善分離條件的補充工具，如果串聯(lián)質(zhì)譜檢測器，其所呈現(xiàn)出的靈敏度與選擇性，將較本文討論的UPC2-UV具有更大的優(yōu)勢，其將是一種很有前景的短鏈脂肪酸分析方法。