胰島類器官基礎(chǔ)應(yīng)用的研究現(xiàn)狀與展望

吳玲玲 蔣鵬 武楨 李萬里 楊玉偉 高宏君

類器官（organoid）是指利用干細(xì)胞的全能性，將其在體外進行培養(yǎng)，使其不斷進行自我更新和自我組織，形成在結(jié)構(gòu)和功能上與原始器官相似的組織[1-4]。目前常用的是人類多能干細(xì)胞（human pluripotent stem cell，hPSC），包括胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC），它們具有分化為機體中幾乎所有細(xì)胞類型的潛能[5-9]。其中胰島類器官可解決器官移植供者來源稀少的問題，是治療糖尿病的潛在方法，也是類器官領(lǐng)域研究的熱點。本文對胰島類器官的起源與發(fā)展、胰島類器官的基礎(chǔ)應(yīng)用進行綜述。

1 胰島類器官的起源與發(fā)展

1978年，Goodman等[10]首次培養(yǎng)出雞血管壁類器官。經(jīng)過40多年的發(fā)展，類器官的研究技術(shù)日益趨向成熟，已成功培養(yǎng)出肝、腦、腎、胰、腸等類器官[11-15]。胰島類器官最早由Montesano等[16]于1983年通過分離大鼠胰腺分泌細(xì)胞，在體外重新結(jié)合形成。2018年，Candiello等[17]證實可通過誘導(dǎo)人類ESC（human ESC，hESC）產(chǎn)生分泌胰島素的胰島樣細(xì)胞。目前胰島類器官的研究取得了長足的進步，主要的基礎(chǔ)應(yīng)用包括疾病治療和疾病建模等。

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病。國際糖尿病聯(lián)盟在最新發(fā)布的糖尿病全球管理指南中指出，2040年世界糖尿病人口數(shù)將達到6.42億[18]。由于β細(xì)胞功能不全是糖尿病的共同特征之一，所以從可再生資源中找到可替代的功能性β細(xì)胞可能是治療糖尿病的有效方法[19-20]。胰島移植可用于替代1型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）中的β細(xì)胞功能，但由于缺乏供者器官，用于細(xì)胞替代治療的可移植β細(xì)胞來源極為有限[21-22]。目前，越來越多的科學(xué)家使用hESC和iPSC作為β細(xì)胞的來源，許多研究小組已研究出通過體外培養(yǎng)胰島樣細(xì)胞來模擬胰腺發(fā)育的方案[23-25]。

2 胰島類器官的基礎(chǔ)應(yīng)用

2.1 來源于hPSC的胰島類器官

2014年，Pagliuca等[26]將hPSC衍生的β細(xì)胞移植到糖尿病小鼠的腎囊下，發(fā)現(xiàn)移植了β細(xì)胞的小鼠空腹血糖平均值＜11.1 mmol/L，而對照組即未移植β細(xì)胞的糖尿病小鼠血糖水平逐漸升高，達到33.3 mmol/L，表明hPSC衍生的β細(xì)胞可降低糖尿病小鼠的血糖。2015年，Russ等[27]用hPSC衍生出胰十二指腸同源盒 1（pancreatic and duodenal homeobox 1，Pdx1）+和 Pdx1+/NK6 同 源 盒 1（NK6 homeobox 1，NKX6.1）+的胰腺祖細(xì)胞群，其在體外可產(chǎn)生葡萄糖反應(yīng)性β樣細(xì)胞。為了進一步研究hPSC衍生的β樣細(xì)胞在體內(nèi)的功能特性，研究者將其移植到鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的腎囊，發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠相比，移植組小鼠的血糖水平下降，表明hPSC衍生的β樣細(xì)胞對糖尿病小鼠的短期血糖控制具有一定的效果，但隨著時間的增加，糖尿病小鼠的血糖水平逐漸上升。2020年，Hogrebe等[28]在體外將hPSC誘導(dǎo)出能產(chǎn)生胰島素的β樣細(xì)胞，其功能特性與胰島β細(xì)胞相似，能顯著改善體內(nèi)和體外功能，將其通過腎囊注射的方式移植到糖尿病小鼠體內(nèi)，術(shù)后每周監(jiān)測小鼠血糖水平，發(fā)現(xiàn)其可維持正常血糖水平至少36周。

2.2 來源于hESC的胰島類器官

2007年，Jiang等[29]將hESC誘導(dǎo)成能產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可表達如Pdx1、胰島素、C肽等胰島特定基因，將這些β細(xì)胞移植到糖尿病裸鼠后，30%的裸鼠表現(xiàn)出明顯的血糖水平下降，且可維持6周以上。2015年，Shim等[30]將hESC誘導(dǎo)成胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，隨后使用STZ誘導(dǎo)雄性裸鼠建立糖尿病模型（血糖水平≥22.2 mmol/L），將胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞通過腎囊注射的方式移植到裸鼠體內(nèi)，術(shù)后50 d內(nèi)裸鼠血糖水平顯著降低，術(shù)后100 d去除移植物后血糖水平迅速升高，表明來源于hESC的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可改善糖尿病裸鼠的血糖水平。2016年，Kim等[31]將hESC誘導(dǎo)出能表達胰腺內(nèi)分泌激素的內(nèi)分泌細(xì)胞，1 d后內(nèi)分泌細(xì)胞自發(fā)形成內(nèi)分泌細(xì)胞簇（endocrine cell cluster，ECC），其中與β細(xì)胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平和胰島素分泌增加。隨后，研究者將ECC移植到STZ誘導(dǎo)的非肥胖性糖尿病（nonobese diabetes，NOD）/重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immune deficiency，SCID）糖尿病小鼠附睪脂肪墊，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組小鼠在停止胰島素治療后3 d因高血糖死亡，而ECC移植小鼠的血糖水平在術(shù)后3 d內(nèi)迅速下降至正常范圍，且存活超過40 d。表明hESC來源的胰島樣ECC可降低糖尿病小鼠的血糖水平，可能是治療糖尿病的替代細(xì)胞來源。2016年，Vegas等[32]誘導(dǎo)hESC產(chǎn)生了成熟的β細(xì)胞，將其移植到STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腹腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其可調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的血糖，且可維持小鼠正常血糖水平超過70 d。

2.3 來源于iPSC的胰島類器官

由于目前ESC在臨床上的應(yīng)用受到倫理道德限制，而具有特定基因型的iPSC在藥物研究等方面比ESC更具吸引力，使得iPSC成為能無限分泌胰島素的重要細(xì)胞來源[33]。最新研究表明，iPSC不僅能生成特異性的細(xì)胞類型，在疾病治療、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)等方面也具有重要意義[34]。iPSC治療T1DM屬于再生醫(yī)學(xué)范疇，其基本原理是將體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為早期未分化的多能干細(xì)胞，再經(jīng)各種細(xì)胞因子處理以模仿胚胎細(xì)胞的生長發(fā)育過程，誘導(dǎo)其變成具有分泌胰島素功能的胰島β細(xì)胞[35]。2010年，Alipio等[36]利用4種病毒轉(zhuǎn)錄因子將正常小鼠皮膚成纖維細(xì)胞重編程為iPSC，再將iPSC在體外誘導(dǎo)分化為胰島β樣細(xì)胞，通過門靜脈注射的方式將其移植到糖尿病小鼠體內(nèi)，術(shù)后2 d開始監(jiān)測小鼠空腹血糖，發(fā)現(xiàn)移植小鼠血糖水平正常，而對照組小鼠仍然處于高血糖狀態(tài)。2012年，Jeon等[37]從NOD/SCID小鼠成纖維細(xì)胞中衍生出iPSC，并使用定向分化的方法將其誘導(dǎo)為功能性胰島細(xì)胞，隨后使用STZ誘導(dǎo)NOD/SCID小鼠建立糖尿病模型，將功能性胰島細(xì)胞移植到小鼠的腎包膜下，發(fā)現(xiàn)移植術(shù)后2～4 d小鼠血糖水平逐漸恢復(fù)正常，而對照組小鼠血糖＞18.3 mmol/L。2013年，Wang等[38]將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式重編程為iPSC，再將iPSC誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞，隨后將胰島樣細(xì)胞移植到STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的肝左葉，6～7 d后小鼠的胰島素分泌和血糖水平逐漸正常化，表明iPSC衍生的胰島樣細(xì)胞具有逆轉(zhuǎn)高血糖的能力。2015年，Raikwar等[39]首先利用激活素A使人iPSC衍生出內(nèi)胚層，在視黃醇和角質(zhì)細(xì)胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）的作用下產(chǎn)生表達Pdx1的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞，隨后產(chǎn)生內(nèi)分泌祖細(xì)胞，最后內(nèi)分泌祖細(xì)胞自發(fā)地產(chǎn)生胰島樣細(xì)胞簇。為明確胰島樣細(xì)胞能否糾正糖尿病小鼠的高血糖，研究者將胰島樣細(xì)胞移植到STZ誘導(dǎo)的Rag2糖尿病小鼠腎囊下，術(shù)后150 d內(nèi)定期監(jiān)測小鼠空腹血糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠血糖水平顯著下降。2016年，Yabe等[40]將人iPSC誘導(dǎo)分化為胰島β細(xì)胞，隨后用STZ誘導(dǎo)SCID小鼠建立糖尿病模型，將胰島β細(xì)胞移植到SCID糖尿病小鼠的左腎囊，對照組注射磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），每周 1 次尾靜脈取血監(jiān)測小鼠血糖水平，發(fā)現(xiàn)移植了胰島β細(xì)胞的20只糖尿病小鼠中，6只在術(shù)后4周內(nèi)血糖水平逐漸降低，而對照組小鼠仍維持較高血糖水平。

2.4 來源于共培養(yǎng)的胰島類器官

2011年，Saito等[41]將iPSC和小鼠胚胎胰島細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，形成了能夠產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞群，該細(xì)胞群由胰島α細(xì)胞包繞中央的β細(xì)胞組成，與成年鼠的胰島相似。隨后，研究者通過腎囊注射的方式將iPSC與胚胎小鼠胰島細(xì)胞共培養(yǎng)產(chǎn)生的β細(xì)胞移植到糖尿病小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠隨機血糖水平顯著下降，表明iPSC和胚胎小鼠胰島細(xì)胞共培養(yǎng)產(chǎn)生的β細(xì)胞具有降血糖的作用。2019年，Lebreton等[42]將 人 羊 膜 上 皮 細(xì) 胞（human amniotic epithelial cell，hAEC）與胰島細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)成功能性的胰島類器官，隨后將150個胰島類器官移植到SCID糖尿病小鼠腎囊下，發(fā)現(xiàn)小鼠的隨機血糖水平在1個月內(nèi)顯著改善。

2.5 來源于基因重組的胰島類器官

有研究表明，神經(jīng)源素3（neurogenin 3，Ngn3）是胰腺中胰島干細(xì)胞的重要標(biāo)志，也是胰島β細(xì)胞再生的重要標(biāo)志，具有促進胰島干細(xì)胞向胰島β細(xì)胞分化的作用[43]。Pdx1是胰腺發(fā)育和功能維持的關(guān)鍵因子，在胰島β細(xì)胞的發(fā)育成熟及胰島素的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其缺失可能會導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生[44]。Vilarino等[45]發(fā)現(xiàn)敲除綿羊的Pdx1基因后，新生的綿羊體內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)部分胰腺殘余結(jié)構(gòu)，組織學(xué)檢測未發(fā)現(xiàn)胰島。肌腱膜纖維肉瘤腫瘤基因同系物A（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A，MafA）參與胰島素的分泌過程，是β細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，其表達與外周血糖水平相關(guān)[46]。

2014年，Chen等[47]通過將Ngn3、Pdx1和MafA等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)導(dǎo)入腸道隱窩細(xì)胞，成功地將其重編程為胰島類器官，這種胰島類器官有著與β細(xì)胞相似的超微結(jié)構(gòu)并能分泌胰島素。為了確定腸道來源的胰島樣細(xì)胞能否替代胰島β細(xì)胞發(fā)揮功能以維持血糖穩(wěn)態(tài)，研究者采用STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠，注射后4 d所有小鼠的隨機血糖水平均顯著升高，隨后給予多西環(huán)素治療3 d以產(chǎn)生Ngn3、Pdx1和MafA，發(fā)現(xiàn)Ngn3、Pdx1和MafA的表達可促進腸道隱窩細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞的快速轉(zhuǎn)化。再將胰島樣細(xì)胞移植到糖尿病小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠血糖水平逐漸恢復(fù)正常，表明腸道來源的胰島樣細(xì)胞能有效調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的血糖。胃腸道上皮是一種高度再生的組織，在進行細(xì)胞重編程后，有潛力成為胰島素陽性細(xì)胞的可再生來源。2016年，Ariyachet等[48]研究表明，可通過添加多西環(huán)素使Ngn3+內(nèi)分泌祖細(xì)胞表達Ngn3、Pdx1和MafA，繼而使胃腸道中的內(nèi)分泌細(xì)胞大量重編程為胰島素陽性細(xì)胞，將該胰島素陽性細(xì)胞移植到STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)移植小鼠的血糖水平保持正常，而對照組小鼠因高血糖在8周內(nèi)死亡。

3 小 結(jié)

綜上所述，胰島類器官可以來源于胰島細(xì)胞、ESC和iPSC，也可以通過兩種不同細(xì)胞共培養(yǎng)或者基因重組等方法獲得。目前主要的基礎(chǔ)應(yīng)用是將胰島類器官移植到動物體內(nèi)，使其分泌胰島素，從而調(diào)節(jié)血糖，治療糖尿病。hPSC具有無限增殖和多向分化等潛能，在疾病治療、疾病建模和藥物開發(fā)等方面具有巨大的潛力。與ESC不同的是，iPSC只能形成新的組織和器官，不能形成新的個體，所以能夠避免潛在的醫(yī)學(xué)倫理問題，而且細(xì)胞來源于病人自身，可減少或完全避免排斥反應(yīng)。由此可知，iPSC是胰島β細(xì)胞的主要來源，但由于iPSC療法體外誘導(dǎo)過程復(fù)雜，目前利用iPSC治療T1DM仍停留在基礎(chǔ)研究階段，如何優(yōu)化iPSC定向分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的條件，提高誘導(dǎo)分化的效率，促進體外分泌胰島素細(xì)胞的成熟，將胰島類器官移植到糖尿病病人體內(nèi)，實現(xiàn)基礎(chǔ)應(yīng)用向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，是未來研究的重點。