保健品中42種非法添加物的HPLC-MS/MS法快速篩選和測定

李亞慶，陳深樹，鐘超群，康 剛，焦臺風(fēng)，董成高，楊宇航，程良紅

廣東南天司法鑒定所，廣東 深圳518003

我國保健品行業(yè)發(fā)展起始于20世紀80年代，改革開放之后，國民經(jīng)濟水平不斷提高，人們對保健品的需求有所上升。20世紀90年代至21世紀初，由于監(jiān)管寬松、高利潤等特點，保健品行業(yè)飛速發(fā)展［1-3］。近年來，隨著互聯(lián)網(wǎng)經(jīng)濟的發(fā)展和消費升級的觀念不斷深入人心，加上國人固有的中醫(yī)保健思想，保健行業(yè)迎來又一個高速發(fā)展階段，整體市場趨向于更加精細化、更加高品質(zhì)。行業(yè)利好背景下，監(jiān)管新政不斷出臺，推動行業(yè)規(guī)范化發(fā)展。

因筆者所屬行業(yè)的特殊性，了解到目前保健品中非法添加化學(xué)物質(zhì)的問題比較突出。這些非法化學(xué)添加物質(zhì)主要有6大類［4-6］：減肥類，代表性物質(zhì)為西布曲明，有增加心臟病的風(fēng)險，國家已明令禁止生產(chǎn)和使用；降糖降脂類，代表物質(zhì)為鹽酸丁二胍，易導(dǎo)致乳酸堆積，在我國未獲得藥監(jiān)部門批準生產(chǎn)和使用；降壓類，代表性物質(zhì)為尼群地平，超量攝取后可發(fā)生心力衰竭和心肌梗死；止咳類，代表性物質(zhì)有可待因，位于《麻醉藥品品種目錄》第111號，長期攝入會產(chǎn)生耐受性和成癮性；精神類，代表性物質(zhì)為扎來普隆，屬于國家特殊管制的第二類精神藥品；壯陽類，以添加西地那非為代表的壯陽類保健品在市場上最常見，非法添加易導(dǎo)致心源性猝死和腦出血［7-9］?，F(xiàn)有非法添加化學(xué)物質(zhì)的檢測方法主要有：拉曼光譜法［10-11］、高效液相色譜法［12-14］、薄層色譜法［15-16］、近紅外光譜法［17-18］以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［19-21］等，高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法［22］和高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜法［23］，但可篩選的化學(xué)添加物質(zhì)數(shù)量有限。近些年來國家食品藥品監(jiān)督管理總局不斷出臺關(guān)于保健品非法添加的補充檢驗方法，但是隨著不法分子對添加物質(zhì)和添加手段不斷改進，現(xiàn)行方法覆蓋范圍難以滿足市場上保健品非法添加的檢測要求。同時，近些年隨著儀器檢測技術(shù)不斷發(fā)展，對保健品中非法添加的檢測報道日益增多，但是筆者檢索近幾年國內(nèi)文獻，能同時高通量快速檢定數(shù)10種非法化學(xué)物質(zhì)的報道較少。

鑒于此，本文在現(xiàn)行國家標準基礎(chǔ)上選擇了6大類42種保健品中常見的非法添加的化學(xué)物質(zhì)作為目標物，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，選用多反應(yīng)監(jiān)測模式，建立了一套覆蓋范圍廣、耗時少、準確度高的高通量篩查和定量分析保健品中42種非法添加化學(xué)物質(zhì)的方法，參考相關(guān)國家標準的方法并用于實際樣品檢測，出具司法鑒定意見書，檢測結(jié)果均被辦案機關(guān)依法采信。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC20A高效液相色譜儀（日本島津公司），LCMS-8045三重四級桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、Labsolutions LCMS集合型工作站軟件（日本島津公司），Millipore Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司），AUW220D型電子分析天平（日本島津公司），Cenece＠ΤDZ5-WS離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器公司），KQ-250DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）。

鹽酸西布曲明（純度99.9%），鹽酸N-單去甲西布曲明（純度97.7%），鹽酸N，N-雙去甲西布曲明（純度94.4%），鹽酸氯卡色林（0.1 mg/mL甲醇溶液），酚酞（純度99.8%），鹽酸二甲雙胍（純度99.9%），鹽酸苯乙雙胍（純度99.7%），辛伐他?。兌?9.5%），瑞格列奈（純度99.8%），鹽酸羅格列酮（純度93.3%），格列齊特（純度99.9%），格列喹酮（純度99.5%），卡托普利（純度99.7%），苯磺酸氨氯地平（純度100.0%），尼群地平（純度99.4%），非洛地平（純度99.6%），鹽酸哌唑嗪（純度99.9%），鹽酸可樂定（純度100.0%），鹽酸氯丙那林（純度99.9%），鹽酸二氧丙嗪（純度99.8%），扎來普?。兌?00.0%），丁丙諾非（0.1 mg/mL甲醇溶液），硝苯地平（純度99.9%），煙酸（純度99.8%），麻黃堿（1.0 mg/mL甲醇溶液），可待因（1.0 mg/mL甲醇溶液），福爾可定（純度99.3%），鹽酸氟西?。兌?9.3%）等標準品均購自中國食品藥品檢定研究院；奧利司他（純度99.8%），鹽酸丁二胍（純度99.9%），甲苯磺丁脲（純度99.6%）等標準品均購自美國Cerilliant標準品公司；西地那非（純度98.0%），豪莫西地那非（純度99.8%），枸櫞酸羥基豪莫西地那非（純度99.4%），那莫西地那非（純度99.9%），紅地那非（純度99.9%），那紅地那非（純度99.7%），偽伐地那非（純度99.8%），鹽酸伐地那非（純度99.9%），硫代艾地那非（純度99.9%），他達拉非（純度99.8%），氨基他達拉非（純度99.9%）等標準品均購自英國LGC標準品公司；甲醇、乙腈均為色譜純，購自德國Merck公司；甲酸、乙酸銨均為質(zhì)譜純試劑，購自百靈威試劑公司；實驗用水為超純水。

實際樣品來源于深圳市龍華區(qū)某派出所、深圳市寶安區(qū)某派出所和深圳市某海關(guān)依法查獲或扣留送檢的保健品。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取42種非法添加化學(xué)物質(zhì)標準品10 mg（精確至0.1 mg），置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，配置成1 mg/mL的標準儲備液；用甲醇稀釋至1μg/mL于-20℃避光保存；再用甲醇配制成不同濃度的標準工作液，供上機使用。

1.3 樣品處理

準確稱取樣品約10 mg，置于15 mL聚乙烯離心管中，加入10 mL甲醇，超聲萃取30 min，冷卻至室溫，3 500 r/min離心3 min，取上清液1 mL通過0.22μm濾膜，濾液在50℃下使用高純氮氣吹干，用200μL甲醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至樣品瓶，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high-performanceliquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測。

1.4 基質(zhì)混標溶液配制

取空白樣品，按1.3所述方法制備空白基質(zhì)溶液，上機前使用空白基質(zhì)溶液稀釋42種化學(xué)物質(zhì)混合標準溶液，制成基質(zhì)混合標準溶液。

1.5 HPLC-MS/MS條件

1.5.1 液相色譜條件 色譜柱：Restek-UltraⅡPFPP（100 mm×2.1 mm，5μm）；柱溫：40℃；流速：0.3 mL/min；進樣體積：1.0μL；流動相：A為20 mmol/L乙酸銨和0.1%（體積分數(shù)）甲酸緩沖水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序（體積分數(shù)）：0～3min，10%～20%B；3～8 min，20%～75%B；8～10 min，80%～95%B；10～12 min，10%B。

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；霧化器流速：3 L/min；干燥器流速：10 L/min；加熱氣流速：10 L/min；接口電壓：4 000 V；接口溫度：300℃；DL溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃。對碰撞能量（CE）、Q1 Prerod偏差電壓和Q3 Prerod偏差電壓等質(zhì)譜條件優(yōu)化，保健品中常見42種非法添加化學(xué)物質(zhì)的多反應(yīng)監(jiān)測模式（reaction monitoring mode，MRM）參數(shù)如表1所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

本研究考察了填充料為十八烷基鍵合硅膠的Agilent Poroshell 120 EC-C18液相色譜柱和填充料為五氟苯基丙基鍵合物的Restek-UltraⅡPFPP液相色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)后者不論在分離效果和峰形上均優(yōu)于前者，由于極性化合物或者疏水作用類似的物質(zhì)的分離在C18柱上保留較弱，而PFPP柱分子中含有5個氟原子，具有較強的氫鍵作用力和陽離子交換作用力，因此本研究選用Restek-UltraⅡPFPP液相色譜柱。為提高各待測物的分離效果，保證檢測靈敏度，選用1.5.1所述的梯度洗脫方法，得到的42種化學(xué)物質(zhì)的總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 42種化學(xué)物質(zhì)的總離子流圖Fig.1 Τotal ion chromatograms of 42 kinds of substances

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要是確定各化學(xué)物質(zhì)的母離子、子離子以及選擇合適碰撞能量等。在本研究中，筆者借助安捷倫科技提供的Agilent MRM Database工具，查詢化學(xué)物質(zhì)的母離子和子離子并做記錄。取1μg/mL的混合化學(xué)物質(zhì)標準溶液直接進樣進行母離子掃描，獲取各化學(xué)物質(zhì)母離子，然后通過子離子掃描方式獲取其子離子，與記錄中的各母離子和子離子做對比，選取合適子離子做MRM參數(shù)優(yōu)化以確定Q1 Prerod偏差電壓、Q3 Prerod偏差電壓和碰撞能量，結(jié)果如表1所示。

表1 42種化學(xué)物質(zhì)的動態(tài)多反應(yīng)模式監(jiān)測參數(shù)Τab.1 Optimized MRM parameters of 42 kinds of substances

2.3 方法驗證結(jié)果

2.3.1 線性方程、檢出限和定量限 按1.4所述方法配制系列基質(zhì)混合標準溶液，以各化學(xué)物質(zhì)的色譜峰峰面積（y）對進樣質(zhì)量濃度（x，ng/mL）進行回歸計算，考察42種化學(xué)物質(zhì)的線性關(guān)系，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r2）如表2所示。結(jié)果表明，42種化學(xué)物質(zhì)在10～1 000 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均在0.990 3～0.999 7。在空白樣品中添加系列質(zhì)量濃度的混合標準溶液，記錄信噪比為3∶1及10∶1時的濃度為檢出限（limits of detection，LOD）和定量限（limits of quantification，LOQ）。結(jié)果表明，42種化學(xué)物質(zhì)的LOD為0.5～10 ng/g，LOQ為1～50 ng/g，能夠滿足非法化學(xué)添加物質(zhì)的檢測要求。

表2 42種化學(xué)物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Τab.2 Linear equation，correlation coefficients，limits of detection and limits of quantitation of 42 kinds of substances

2.3.2 回收率、精密度和穩(wěn)定性 以空白樣品為基質(zhì)，分別選取低質(zhì)量濃度（30 ng/g）中質(zhì)量濃度（600 ng/g）和高質(zhì)量濃度（1μg/g）3個水平的混合標準溶液，按優(yōu)化后的實驗條件，每個水平做6次平行實驗，連續(xù)3 d。結(jié)果顯示，在空白基質(zhì)中所有化學(xué)物質(zhì)的回收率相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于15%，滿足精密度要求。42種化學(xué)物質(zhì)的平均回收率為80.59%～136.76%，3個水平下回收率正態(tài)分布曲線如圖2所示，RSD為0.41%～13.44%，方法的隨機誤差滿足測定要求。

圖2 三個水平下回收率正態(tài)分布曲線Fig.2 Normal distribution curves of recovery at three levels

選取1μg/g混合標準溶液，在統(tǒng)一實驗條件下連續(xù)10次平行實驗以評價方法穩(wěn)定性，分別計算保留時間和出峰面積的相對標準偏差。結(jié)果表明，42種化學(xué)物質(zhì)保留時間RSD為0.059%～0.287%，峰面積RSD為0.536%～2.640%，方法穩(wěn)定性理想。

2.4 實際樣品檢測

按照上述方法，分別對深圳龍華區(qū)某派出所依法查處的4份保健品和深圳寶安區(qū)某派出所依法查處的3份保健品，以及深圳某海關(guān)依法扣留的8份保健品進行測定并出具司法鑒定意見書。結(jié)果表明，深圳龍華區(qū)某派出所依法查處的4份保健品中，3份檢出他達拉非，定量結(jié)果分別為5.5、9.4和7.9 mg/g；深圳寶安區(qū)某派出所依法查處的3份保健品中，其中2份分別檢出西布曲明和酚酞，定量結(jié)果分別為74.7和586.0 mg/g；深圳某海關(guān)依法扣留的8份保健品中，1份檢出為氟西汀，定量結(jié)果為18.6 mg/g，以上結(jié)果均被辦案機關(guān)依法采信?？瞻谆|(zhì)混合標準溶液（spiked sample，1μg/mL）與實際陽性樣品（actual sample）的MRM色譜圖和質(zhì)譜圖如圖3所示?？梢?，在保健品行業(yè)非法添加化學(xué)物質(zhì)的情況仍存在，相關(guān)部門應(yīng)加強監(jiān)管力度，嚴控保健品生產(chǎn)過程，保證產(chǎn)品質(zhì)量，保障消費者安全。

圖3 空白基質(zhì)混合標準溶液（1μg/mL）和陽性樣品的MRM色譜圖和質(zhì)譜圖：（a）酚酞，（b）西布曲明，（c）他達拉非，（d）氟西汀Fig.3 MRM chromatograms and mass spectra of spiked samples（1μg/mL）and actual samples：（a）phenolphthalein，（b）sibutramine，（c）tadalafil，（d）fluoxetine

3 結(jié) 論

本研究建立了HPLC-MS/MS快速篩選和測定保健品中42種非法添加化學(xué)物質(zhì)的分析方法。該方法樣品前處理簡便，分析覆蓋范圍廣、耗時少、準確度高，能滿足對保健品中非法添加物質(zhì)的測定要求。在實際樣品的檢測中，按照本方法對深圳市辦案機關(guān)送檢的保健品檢測，非法添加的化學(xué)物質(zhì)均被準確篩查和定量檢測并出具司法鑒定意見書，所有送檢樣品的檢測結(jié)果均被辦案機關(guān)依法采信。本方法為保健品中多種非法添加化學(xué)物質(zhì)的定性篩查和定量分析提供了高效、可靠的檢測方法。