高效液相色譜柱后衍生法測定啤酒中甲醛含量

曾文祥，李珍妮，曾 川，鐘 敏

（1.拱北海關(guān)技術(shù)中心，廣東珠海 519000；2.廣東藥科大學(xué)，廣東中山 528400）

甲醛，化學(xué)式HCHO，又稱蟻醛，是無色有刺激性氣體，易溶于水和揮發(fā)于空氣中，對人體眼鼻等有刺激性，長時間接觸高濃度的甲醛容易致癌，已被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)列為一類致癌物[1]。近年來經(jīng)常有報料食品中檢出甲醛的新聞，食品中甲醛的來源廣泛，主要有：①不良商家將甲醛添加至食品中用于保鮮；②甲醛是細(xì)胞生理代謝的正常產(chǎn)物，許多天然食品自身產(chǎn)生甲醛本底，如水產(chǎn)品及水發(fā)產(chǎn)品中的牛百葉、魷魚、銀耳等[2]；③食品生產(chǎn)過程中產(chǎn)生甲醛，如食品發(fā)酵。啤酒作為發(fā)酵食品，甲醛又是細(xì)胞代謝的正常產(chǎn)物，所以啤酒在生產(chǎn)過程中或有少量甲醛產(chǎn)生，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵酒及其配制酒》（GB 2758—2012）規(guī)定啤酒中甲醛含量應(yīng)≤2.0 mg/L[3]，故對啤酒進(jìn)行甲醛檢測，顯得十分必要。目前啤酒中甲醛含量的檢測方法主要為GB/T 5009.49—2008乙酰丙酮紫外分光光度法[4]，該方法需要對啤酒樣品進(jìn)行蒸餾除雜，蒸餾過程容易損失甲醛，導(dǎo)致結(jié)果偏低；同時甲醛與乙酰丙酮衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，當(dāng)樣品數(shù)量比較多，或者實驗員測定衍生產(chǎn)物吸光度速度不夠快時，會導(dǎo)致前后樣品從開始衍生到測定紫外吸光度時間差異較大，導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。針對上述問題，參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）4.9節(jié)化妝品中游離甲醛的檢測方法[5]，開發(fā)出高效液相色譜柱后衍生法測定啤酒中甲醛含量方法，相對于GB/T 5009.49—2008乙酰丙酮紫外分光光度法，本方法具有前處理時間更短、無需蒸餾、回收率更高、重現(xiàn)性更好、利用色譜柱分離，樣品雜質(zhì)干擾更少等優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）；Pickering柱后衍生儀；不同牌子啤酒市購；甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg/L。試驗所用試劑及配制：10%磷酸溶液，取1 mL磷酸溶液，用水定容至10mL；衍生化溶液，稱取62.5 g乙酸銨，7.5 mL冰乙酸，5 mL乙酰丙酮，加水至1 000 mL。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Symmetry?C18（5 μm×250 mm×4.6 mm）；流動相：0.2%磷酸溶液等度洗脫；流量：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：50 μL；檢測波長：420 nm；柱后衍生儀衍生液流速：0.5 mL/min；柱后衍生反應(yīng)器溫度80 ℃。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)點溶液配制

取甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋成1 mg/L和10 mg/L，分別取稀釋后的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液適量于10 mL比色管中，加入0.2 mL 10%磷酸溶液，用水定容，配成濃度0 mg/L、0.01 mg/L、0.025 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L和5.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，上機測定。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確移取0.5 mL樣品于10 mL比色管中，加入0.2 mL 10%磷酸溶液，用水定容，過0.45 μm濾膜作為待測溶液，上機測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法專屬性

濃度為0 mg/L（試劑空白）的標(biāo)準(zhǔn)點色譜圖目標(biāo)峰（保留時間5.13 min）附近未出現(xiàn)干擾峰（圖1），方法專屬性良好。

圖1 濃度為0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 方法檢出限與定量限

分別配制濃度為1.0 mg/L、0.5 mg/L、0.2 mg/L、0.1 mg/L、0.05 mg/L、0.025 mg/L、0.01 mg/L、0.005 mg/L和0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，上機測定，用儀器軟件計算信噪比（計算模式6SD，選取色譜5.5～7.5 min作為基線噪音），信噪比結(jié)果見表1。

表1 不同標(biāo)液濃度信噪比

試驗結(jié)果顯示濃度為0 mg/L色譜圖無目標(biāo)峰，濃度0.01 mg/L的信噪比為6.3，濃度0.025 mg/L的信噪比為12.8，綜合色譜圖基線情況，分別擬取0.01 mg/L、0.025 mg/L作為本方法儀器檢出限、定量限，對應(yīng)方法的檢測限和定量限分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L。

移取0.5 mL樣品，平行測定3次，實驗結(jié)果顯示空白樣品甲醛含量低于檢出限（0.076 5 mg/L）；另移取0.5 mL樣品，分別按照方法檢出限0.2 mg/L和方法定量限濃度0.5 mg/L，加入甲醛標(biāo)液，進(jìn)行加標(biāo)實驗，平行測定6次，扣除樣品空白后，計算回收率及變異系數(shù)，檢出限加標(biāo)平均回收率為105.9%，變異系數(shù)為7.80%（表2）；定量限加標(biāo)回收率為102.4%，變異系數(shù)為3.89%（表3）。樣品空白及樣品定量限濃度加標(biāo)實驗色譜圖如圖2、圖3所示。

圖2 樣品空白色譜圖

圖3 方法定量限（0.5 mg/L）加標(biāo)色譜圖

表2 方法回收率、精密度（n=6）

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制濃度0 mg/L、0.01 mg/L、0.025 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L和5.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，上機測定，以甲醛濃度為橫坐標(biāo)，甲醛衍生物的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。甲醛濃度在0.01～5 mg/L與之對應(yīng)衍生物峰面積呈線性，線性方程為y=462.237 053x+1.683 071 8，相關(guān)系數(shù)為1.000。

2.4 方法準(zhǔn)確度考察

取未檢出甲醛（＜0.2 mg/L）的空白樣品0.5 mL，分別按照方法定量限、GB 2758—2012甲醛判定限量、10倍判定限量即0.5 mg/L、2.0 mg/L、20.0 mg/L濃度水平進(jìn)行加標(biāo)試驗，平行試驗6次，扣除樣品空白，計算平均回收率和RSD，試驗結(jié)果顯示（見表3）回收率在95.8%～102.4%，RSD在0.70%～3.89%，本方法準(zhǔn)確度良好。

表3 方法準(zhǔn)確度考察（n=6）

2.5 柱后衍生反應(yīng)器溫度考察

配制濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別將柱后衍生儀反應(yīng)器溫度設(shè)為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃和 120 ℃，每個設(shè)定溫度下，重復(fù)進(jìn)樣3次，并計算平均峰面積。以溫度為橫坐標(biāo)，平均峰面積為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖（圖4）；實驗顯示衍生物峰面積隨衍生溫度升高而變大，90 ℃衍生物峰面積達(dá)到最大，但與80 ℃差別不大，100～120 ℃衍生物峰面積有輕微變小，綜合考慮衍生物峰面積和溫度太高對儀器和衍生管路的影響，本方法以80 ℃作為柱后衍生儀反應(yīng)器溫度。

圖4 柱后衍生反應(yīng)器溫度與衍生物峰面積關(guān)系

2.6 取樣量對檢測結(jié)果影響考察

取未檢出甲醛（＜0.2 mg/L）的空白樣品適量于100 mL比色管中，加入0.2 mL濃度為1 000 mg/L的甲醛標(biāo)液，用空白樣品定容至刻度，制成濃度為2 mg/L加標(biāo)樣品。分別取加標(biāo)樣品0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL和8.0 mL于10 mL比色管中進(jìn)行試驗，按試驗方法平行測定3次，計算3次平均回收率，以取樣量為橫坐標(biāo)，平均回收率為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖（圖5），試驗顯示當(dāng)取樣量為0.5 mL時，加標(biāo)回收率最高96.7%，當(dāng)增加取樣量時，加標(biāo)回收率降低，當(dāng)取樣量低于0.5 mL時加標(biāo)回收率稍微偏低，可能是取樣量太少，上機濃度太低導(dǎo)致加標(biāo)回收率偏低，故將0.5 mL確定為本方法取樣量。

圖5 不同取樣量與加標(biāo)回收率關(guān)系

2.7 樣品分析

按試驗方法，對多種品牌啤酒進(jìn)行空白樣品檢測，及判定限量2 mg/L濃度水平加標(biāo)實驗，實驗結(jié)果顯示各品牌的啤酒甲醛含量均為未檢出（＜0.2 mg/L），甲醛含量均符合國家要求，2 mg/L水平加標(biāo)回收率在92.3%～102.1%，說明本方法適用大多數(shù)品牌啤酒中甲醛含量測定，方法專屬性強。

3 結(jié)論

本方法采用高效液相色譜分離出樣液中的甲醛，再經(jīng)過柱后衍生儀，在線與乙酰丙酮反應(yīng)，在420 nm波長下紫外檢測器檢測，經(jīng)過試驗驗證，儀器最低響應(yīng)濃度為0.01 mg/L，方法檢出限和定量限分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L，各濃度水平加標(biāo)回收率及RSD（n=6）均滿足檢測分析要求，確定了衍生器反應(yīng)溫度為80 ℃，最佳取樣量為0.5 mL；本方法適用于市面上大多數(shù)品牌啤酒甲醛含量檢測，各品牌啤酒2 mg/L濃度水平加標(biāo)回收率在92.3%～102.1%。與GB/T 5009.49—2008方法相比，本方法只需取0.5 mL樣品定容至10 mL和配制標(biāo)準(zhǔn)點溶液上機即可，樣品前處理更加簡便，無需蒸餾凈化樣品，同時確保了每個樣品衍生化時間一致，檢測結(jié)果精密度更高。