探討高效液相色譜法測定海水魚中嘌呤含量

嚴(yán)瑋桐

（九江市檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心食品分中心，江西九江 332000）

1 材料與方法

1.1 原料

本次試驗(yàn)所用的海水魚，選擇新鮮的海鱸魚、黃花魚、鱈魚3種魚類，均購置某水產(chǎn)市場。

1.2 儀器和試劑

電子天平、HPLC儀、pH計、紫外-可見分光光度計、超聲清洗器、冷凍高速離心機(jī)、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、絞肉機(jī)、電熱恒溫水槽和超純水系統(tǒng)等。

色譜級的腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤，純度均＞99%；色譜純甲醇、四丁基氫氧化銨、冰乙酸、三氟乙酸；分析純甲酸、高氯酸等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

（1）流動相。參考曲欣[1]的研究，色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動相：水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氫氧化銨，體積比：879∶100∶15∶6；柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，檢測波長：254 nm。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳流速和檢測波長。

（2）流速。流動相確定后，選擇3種流速分離嘌呤， 分 別 是 0.8 mL/min、1 mL/min、1.2 mL/min，對比確定最佳流速。結(jié)果顯示：這3種流速均能在10 min內(nèi)完成嘌呤的分離，其中0.8 mL/min分離效果最好，峰型最明顯，因此確定最佳流速是0.8 mL/min。

（3）檢測波長。配置嘌呤溶液，濃度為10 mg/L，然后進(jìn)行全光譜掃描，設(shè)置范圍在200～400 nm，從而確定適宜檢測波長。結(jié)果顯示：嘌呤溶液在200～300 nm有吸收峰，腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤的最大吸收波長分別是265 nm、271 nm、254 nm、278 nm。INAZAWA[2]的研究中，波長選擇為260 nm；其他學(xué)者的研究中有254 nm、255 nm等[3-4]。本次試驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)幾種波長的檢測結(jié)果沒有明顯差異，最終選擇254 nm為檢測波長。

經(jīng)過優(yōu)化，最終確定色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色 譜 柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動相是水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氫氧化銨，體積比為879∶100∶15∶6；柱溫30 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量為 10 μL。

1.3.2 樣品處理

對海水魚樣品進(jìn)行處理，目前已知方法有超聲法、高氯酸法、混合酸法等。其中，超聲法雖然操作簡單，但嘌呤的提取率低。高氯酸法操作步驟復(fù)雜，等待時間長，容易生成氯氣，會危害人身健康?；旌纤岱ú粌H對嘌呤的提取率高，而且甲酸對嘌呤具有保護(hù)作用。本研究最終采用混合酸法進(jìn)行樣品處理，混合酸的組成是：三氟乙酸和甲酸，兩者的體積比是1∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，濃度為1 600 mg/L，置于冰箱內(nèi)在4 ℃恒溫下保存。取等體積4種嘌呤的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，濃度為4 00 mg/L。然后加入超純水稀釋處理，配制出不同濃度的溶液，分別是200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L 和 0.1 mg/L。這些溶液使用0.45 μm的微孔濾膜過濾，然后進(jìn)行色譜分析，檢出限是3倍信噪比對應(yīng)的濃度。

根據(jù)優(yōu)化后的色譜條件，檢測混合標(biāo)品中的嘌呤含量。以樣品濃度作為X軸，以峰面積作為Y軸，進(jìn)行線性回歸分析，得出回歸方程，并計算相關(guān)系數(shù)R，見表1。結(jié)果顯示，這4種嘌呤在0.1～400 mg/L的濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)≥0.998，檢出限在0.047～0.106 mg/L。

表1 線性回歸分析結(jié)果

2.2 精密度

采用優(yōu)化后的色譜條件，對300 mg/L的混合標(biāo)品連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)每一次的測定結(jié)果，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），見表2。結(jié)果顯示，6次進(jìn)樣測定值的RSD在0.021%～0.689，說明該方法的精度較高。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 加標(biāo)回收率

使用電子天平準(zhǔn)確稱量海鱸魚的魚肉樣品2.4 g，平均分為12份，每份樣品0.2 g。采用混合酸法進(jìn)行處理，并根據(jù)優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行檢測。按照嘌呤含量的0.5倍、1.2倍，分別加入嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，配制成不同濃度的樣品，每個樣品測定3次，計算回收率和RSD值，見表3。結(jié)果顯示，4種嘌呤的平均回收率在94.289%～102.919%，說明該方法處理樣品能減少嘌呤的損失量。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 嘌呤含量測定結(jié)果

對3種海水魚樣品，分別選擇魚肉、魚皮和內(nèi)臟3個部位，按照1.3.2方法進(jìn)行處理，采用優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行檢測，得到4種嘌呤含量，并計算總嘌呤含量，見表4。分析可知：①不同海水魚中的嘌呤含量差異明顯，海鱸魚的次黃嘌呤和黃嘌呤含量最高，黃花魚的腺嘌呤含量最高，鱈魚的鳥嘌呤含量最高，總嘌呤含量海鱸魚＞鱈魚＞黃花魚；②同一海水魚中，不同部位的嘌呤含量差異明顯，內(nèi)臟中的腺嘌呤和黃嘌呤含量最高，魚皮中的鳥嘌呤含量最高，魚肉中的次黃嘌呤含量最高，總體上魚皮＞內(nèi)臟＞魚肉。

表4 海水魚中4種嘌呤的含量測定結(jié)果（單位：mg/kg）

3 結(jié)論

HPLC技術(shù)具有高壓、高速、高靈敏度、進(jìn)樣量少和環(huán)保的特點(diǎn)[5]。本次研究針對海鱸魚、黃花魚、鱈魚3種海水魚類，建立HPLC檢測方案，優(yōu)化色譜條件后測定樣品不同部位的腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤含量，結(jié)論如下。

（1）選用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；以水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氫氧化銨為流動相，體積比為879∶100∶15∶6；柱溫30 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測波長為254 nm。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，4種嘌呤在0.1～400 mg/L的濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，精密度較高，回收率良好。

（2）總嘌呤含量方面：海鱸魚＞鱈魚＞黃花魚；不同部位方面：魚皮＞內(nèi)臟＞魚肉。為避免人體內(nèi)嘌呤含量增高，預(yù)防高尿酸血癥和痛風(fēng)，提示人們少食用海鱸魚，合理食用鱈魚、黃花魚；優(yōu)先食用魚肉，減少魚皮和內(nèi)臟的攝入量。