血清學聯合核酸檢測在承德市無償獻血者血液篩查中的應用研究

周靜江 劉明麗

血液輸注能快速補充血容量，改善組織細胞缺血缺氧狀態(tài)，已成為臨床上搶救急性大出血、嚴重創(chuàng)傷燒傷、器官移植等疾病的主要治療手段，但輸血同時也是導致HIV、HBV、HCV、TP等輸血相關病原體傳播的重要途徑[1,2]。因此，如何降低經輸血傳播HIV、HBV、HCV風險，提高輸血安全，已成為采供血機構的工作重點和難點。目前，采供血機構血清學輸血傳播病原體篩查項目包括HBsAg、抗-HCV抗體/抗原、抗-HIV抗體/抗原、抗-TP等，但由于檢測試劑窗口期的存在以及靈敏度的限制、獻血者免疫沉默、病毒突變等原因會導致部分陽性標本的漏檢[3,4]。核酸檢測(nucleic acid testing,NAT)因其直接檢測病毒體核酸成分，具有較高靈敏度和特異性，能有效縮短HIV，HCV 和 HBV檢測的 “窗口期”，防止低病毒載量標本的漏檢，提高血液安全[5,6]。我國2015版《血站技術操作規(guī)程》明確規(guī)定將 NAT作為采供血機構常規(guī)篩查方法及病毒核酸篩查全覆蓋[7]，因此，血清學聯合核酸檢測成為各采供血機構的常規(guī)病原體篩查模式。為了探究開展血液標本核酸檢測對于提高輸血安全的意義，本研究收集承德市中心血站無償獻血者標本，分析其免疫血清學檢測、血清學聯合核酸檢測篩查陽性率的不同，現將研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 調查對象 選擇承德市中心血站2018年1月至2019年12月采集的77 886份無償獻血者血液樣本作為研究對象。所有獻血者符合《獻血者健康檢查要求》的相關規(guī)定：體重男≥50 kg，女≥45 kg；90 mm Hg≤收縮壓<140 mm Hg,60 mm Hg≤舒張壓<90 mm Hg；脈搏60次/min～100次/min(高度耐力運動員≥50次/min)；血紅蛋白含量(硫酸銅目測法)男≥1.0520，女≥1.0510；丙氨酸氨基轉移酶(干化法)檢查結果正常；乙型肝炎病毒表面抗原(金標法)呈非反應性；不具有任何一條獻血禁忌癥。滿足以上指標者方能進入采血環(huán)節(jié)。

1.2 儀器與試劑 STAR全自動加樣儀(瑞士HAMILTON公司)，FAME全自動酶免分析系統(tǒng)(瑞士HAMILTON公司),sunrise酶標儀(瑞士TECAN公司)，ABI7500熒光定量PCR儀、人類免疫缺陷病毒(HIV RNA)-丙型肝炎病毒(HCV RNA)-乙型肝炎病毒(HBV DNA)核酸檢測試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司),HBsAg檢測試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)、抗-HCV抗原抗體聯合診斷試劑盒(北京萬泰生物制藥有限公司)、抗-HIV抗原抗體聯合診斷試劑盒(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司)、抗TP檢測試劑盒(珠海麗珠試劑有限公司)。所有檢測試劑均為國家合格產品且在有效期內使用。

1.3 血液標本的檢測

1.3.1 血清學檢測:采用兩種不同廠家的酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒對本血站2018年1月至2019年12月采集的77 886份無償獻血者血液樣本進行HBsAg、抗-HCV抗原/抗體、抗-HIV抗原/抗體、抗-TP的血清學篩查，檢測過程嚴格按照試劑盒操作說明和實驗室的標準操作規(guī)程進行。結果判讀：初次篩查如兩種ELISA試劑檢測結果均呈非反應性，判定該標本為陰性；如均呈反應性，判定該標本為陽性。如一種檢測試劑呈反應性，另一種試劑為非反應性，則將該標本采用呈反應性的檢測試劑進行雙孔復檢，若結果顯示單孔或雙孔存在反應性，則判定該標本的血清學檢測結果為單試劑陽性，若雙孔均呈非反應性，則判定該標本血清學檢測結果為陰性。

1.3.2 核酸檢測:采用唐山啟奧軟件信息管理系統(tǒng)Shinow 9.0(唐山啟奧科技有限公司)對無償獻血者血液標本的血清學檢測結果進行篩查,將血清學篩查陰性和單試劑陽性標本進行病毒核酸檢測。本實驗室采用8∶1核酸混合檢測模式，即將8個血液標本混合在一個匯集管內，然后再進行病毒核酸的提取、純化，擴增體系的配置，最后采用TaqMan熒光探針PCR擴增技術對血清學篩查陰性和單試劑陽性標本進行HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA核酸檢測。結果判讀 ：若核酸混檢呈非反應性，則判定標本為陰性，如呈反應性則進行拆分檢測，拆分結果若為非反應性，判定該標本為陰性，如呈反應性，則判定標本為陽性。注意：核酸標本采集后應盡快檢測，從采集到完成檢測需<72 h。核酸檢測過程嚴格按照試劑盒操作說明和實驗室的標準操作規(guī)程進行。

1.4 觀察指標 (1)觀察77 886份無償獻血者血液樣本的血清學結果： HBsAg、抗-HCV抗原/抗體、HIV抗原/抗體、抗-TP單試劑和雙試劑陽性例數，計算各檢測項目不合格率以及總體不合格率。(2)比較HBV、HCV、HIV三種檢測項目血清學篩查陽性率、血清學與核酸聯合篩查陽性率的不同。(3)血清學單試劑陽性標本核酸檢測結果，分析血清學篩查結果與核酸篩查結果的符合率。(4)血清學篩查陰性標本的核酸檢測結果，分析血清學篩查試劑的漏檢率。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計數資料以百分率表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 獻血者標本血清學篩查結果 經兩種不同ELISA試劑檢測共篩查出不合格標本752例，不合格率0.966%。其中， HBsAg陽性共228例，包括單試劑陽性184例，雙試劑陽性44例；抗-HCV抗原/抗體陽性共132例，包括單試劑陽性66例，雙試劑陽性66例；HIV抗原/抗體陽性共104例，包括單試劑陽性76例，雙試劑陽性28例；抗-TP陽性共288例，包括單試劑陽性95例，雙試劑陽性193例。見表1。

表1 獻血者標本血清學篩查結果 例

2.2 獻血者標本血清學篩查陽性率、血清學聯合核酸篩查陽性率比較 獻血者標本HBV、HCV、HIV血清學篩查陽性率分別為0.293%、0.169%、0.134%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 54.798，P=0.000)；獻血者標本HBV、HCV、HIV血清學與核酸聯合篩查陽性率分別為0.311%、0.178%、0.137%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 61.312，P=0.000)。見表2。

表2 獻血者標本血清學篩查陽性率、血清學聯合核酸篩查陽性率比較

2.3 血清學篩查單試劑陽性標本的核酸檢測結果 獻血者標本HBV、HCV、HIV血清學篩查單試劑陽性例數分別為184例、66例、76例，再經核酸檢測呈陽性反應例數分別為2例、0例、3例。血清學篩查試劑與核酸檢測試劑篩查陽性符合率分別為1.09%、0、3.95%。見表3。

表3 血清學篩查單試劑陽性標本的核酸檢測結果

2.4 血清學篩查陰性標本的核酸檢測結果 77 886例獻血者標本經兩種不同廠家血清檢測試劑HBV、HCV、HIV篩查，呈非反應性的標本例數分別為77 658例、77 754例、77 782例，陰性標本再經HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA核酸檢測呈反應性樣本例數分別為14例、7例、3例，血清學試劑篩查漏檢率分別為 0.018%、0.009%、0.004%，三者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 7.771，P=0.021)。見表4。

表4 血清學篩查陰性標本的核酸檢測結果

3 討論

降低輸血相關病毒傳播風險，提高輸血安全，已經成為采供血機構、醫(yī)療行業(yè)甚至全社會關注的焦點。因此，如何提高陽性標本檢出率、降低經輸血傳播病毒殘余風險目前已成為各采供血機構持續(xù)改進的工作重點和難點。酶聯免疫吸附試驗是我國采供血機構普遍使用的血液篩查技術，尤其隨著近幾年ELISA檢測試劑的不斷更新換代，其穩(wěn)定性的不斷提高，實驗室血清學篩查技術在在降低經血HBV、HCV、HIV等病原體傳播，保障輸血安全上更是發(fā)揮著重要作用。盡管ELISA檢測試劑的靈敏度經過不斷改進，得到很大提高，但仍然無法避免病毒檢測窗口期的存在，HBV窗口期為56 d、HCV為72 d、HIV為22 d，加之病毒亞型、病毒變異、患者免疫沉默等情況的存在，必然會導致弱陽性標本尤其是窗口期標本的漏檢[8]，這給輸血安全帶來嚴重威脅。此外，ELISA檢測試劑的低特異性，也會導致假陽性結果的增加，獻血者獻血資格的淘汰，這不僅浪費了寶貴的血液資源，同時也對獻血者的獻血愛心帶來不利影響。核酸擴增技術是直接檢測病毒核酸的一系列技術的總稱，該檢測技術具有高度的靈敏度和特異性。研究表明：對無償獻血者血液標本進行核酸檢測，可將HBV、HCV、HIV的感染窗口期分別縮短至為41 d、12 d和11 d[9,10]，并可防止低病毒載量標本及隱匿性乙型肝炎感染(occult HBV infection,OBI)的漏檢[11,12]。我國于2016年實現無償獻血核酸檢測全覆蓋。目前，國內采供血機構的核酸檢測模式主要有混樣檢測和單人份檢測兩種模式，混樣檢測一般在去除血清學篩查陽性標本后進行，單人份檢測一般與血清學檢測同時進行。承德市中心血站采用8人份混樣模式對獻血者標本進行核酸檢測。本研究通過觀察承德市中心血站獻血者標本免疫血清學檢測陽性率、血清學聯合核酸檢測篩查陽性率的不同，分析核酸檢測對于提高血液安全，降低輸血風險的重要意義。

HBV、HCV、HIV是我國采供血機構常規(guī)病原體篩查項目，本研究的77886無償獻血者標本經HBV、HCV、HIV血清學篩查呈陽性反應標本例數分別 228例、132例、104例、篩查陽性率分別為0.293%、0.169%、0.134%， 血清學聯合核酸檢測陽性率分別為0.311%、0.178%、0.137%，HBV、HCV、HIV的篩查陽性率均呈現HBV>HCV> HIV的趨勢，這與我國人群HBV、HCV、 HIV三種病毒的流行率相吻合，與劉麗等[13,14]的研究得出的HBV、HCV、HIV陽性率趨勢也一致。

檢測試劑的靈敏度決定真陽性標本的檢出率，而特異性決定真陰性標本的檢出率，對于靈敏度和特異性均較高的試劑既可以降低真陽性標本的漏檢，又可以避免真陰性標本的誤診。近幾年，血清學檢測試劑通過改進其靈敏度和特異性不斷提高，核酸檢測因其高特異性和靈敏度曾被作為血液篩查的金標準。本研究中，血清學篩查單試劑陽性的184例HBV、66例HCV、76例HIV獻血者標本再經核酸檢測呈陽性反應例數分別為2例、0例、3例。血清學篩查試劑與核酸檢測試劑篩查陽性符合率分別為1.09%、0、3.95%。推測可能是因為血清學檢測試劑靈敏度高而特異性太低，導致出現大量假陽性標本，經高特異性的核酸檢測試劑檢測呈陰性結果。提示：應進一步提高血清學檢測試劑的特異性，防止出現大量假陽性結果，導致無償獻血者獻血資格的淘汰，獻血人群的流失。

本研究中，77886例獻血者標本經HBV、HCV、HIV血清學篩查呈非反應性者分別為77 658例、77 754例、77 782例，這些血清學檢測陰性標本經核酸檢測呈反應性樣本例數分別為14例、7例、3例。這說明HBV、HCV、HIV三種核酸檢測試劑均存在陽性標本漏檢情況。如果這些漏檢標本被發(fā)往臨床，必然給輸血安全和患者的生命健康帶來嚴重威脅，因此應進一步提高血清學試劑的檢測靈敏度，降低弱陽性標本的漏檢。同時此結果也說明：通過核酸檢測可彌補血清學檢測的不足，提高陽性標本的檢出率，降低漏檢率，進一步提高血液安全。這與其他多項核酸與血清學聯合檢測相關研究的結果[15-17]一致。

此外，我們的研究結果還顯示：HBV、HCV、HIV三種血清學試劑篩查漏檢率分別為 0.018%、0.009%、0.004%，具有明顯統(tǒng)計學差異。這種差異除了與病毒在獻血人群的流行率不同有關外，還與HBV、HCV、HIV三種血清學篩查試劑的靈敏度密切相關。不同的 ELISA 試劑生產廠家包被的抗原、抗體片段以及酶標抗體的濃度均不同，這必然會導致各檢測試劑靈敏度的差異。本研究中HCV和HIV的血清學漏檢率均低于HBV，推測一方面是因為HCV和HIV在獻血人群中的流行率低于HBV，另一方面是因為HCV和HIV血清學篩查試劑均為抗原抗體聯合檢測，縮短了窗口期，提高了弱陽性標本的檢出，而HBV血清學篩查試劑只檢測乙肝病毒表面抗原。

通過本研究表明：在無償獻血者標本血清學篩查的基礎上，開展核酸檢測，可降低窗口期和弱陽性標本的漏檢，提高檢測準確性和血液質量，降低輸血傳播病原體的風險。同時，應進一步提高血清學篩查試劑靈敏度和特異性，降低血液標本的漏檢率和誤診率。