細(xì)胞因子與重癥肌無力分型及臨床病程的相關(guān)性研究

梁翠娟 馮蘇 范蓉 趙東蘭 宋國威 潘婧

重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是由自身抗體介導(dǎo)的細(xì)胞免疫依賴的獲得性自身免疫疾病[1]，多種免疫細(xì)胞包括Th1、Th17細(xì)胞、B細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-27、TGF-β、IL-21被認(rèn)為參與了重癥肌無力的發(fā)病[2]。在動(dòng)物模型中，IL-6抗體可以降低抗乙酰膽堿抗體(anti-AChR)水平，并下調(diào)IL-17、IL-21等表達(dá)。TGF-β可促進(jìn)效應(yīng)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化，IL-6和TGF-β可誘導(dǎo)細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，促進(jìn)炎癥及自身免疫發(fā)生，在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)IL-6和可以促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化成熟為成熟漿細(xì)胞。自身抗原在IL-17敲除小鼠不能或僅能誘導(dǎo)低水平抗乙酰膽堿抗體[3]。IL-27在自身免疫性疾病發(fā)病中具有復(fù)雜的作用，可拮抗IL-6，在多種自身免疫性疾病動(dòng)物模型中抑制自身性免疫性疾病的發(fā)生。本研究對重癥肌無力患者血清細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，以期了解上述細(xì)胞因子與疾病表型、病程的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 我院2018年4～6月診治的重癥肌無力患者，診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)參考《中國重癥肌無力診斷和治療指南2015》[1]，其中眼肌型26例，全身型24例。對照組為同期于我院進(jìn)行體檢的年齡和性別匹配的健康志愿者29例。在重癥肌無力患者中，初發(fā)期(眼肌型13例，全身型6例)，穩(wěn)定期18例(眼肌型9例，全身型9例)，加重期13例(眼肌型4例，全身型9例)。各期患者及對照組年齡及性別比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、2。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：近期無急慢性感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并慢性或急性炎癥性疾病疾病；(2)合并惡性腫瘤；(3)合并精神性疾??；(4)合并其他疾病或使用可能影響上述細(xì)胞因子水平的治療藥物。

表2 不同病程階段一般情況比較

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 初發(fā)期為初次入院未進(jìn)行任何治療；穩(wěn)定期為至少半年無肌無力的癥狀或體征,在此期間接受過MG 的藥物治療;經(jīng)專業(yè)的神經(jīng)肌病醫(yī)生檢查允許出現(xiàn)輕微眼瞼閉合無力；加重期為與穩(wěn)定期相比，肌無力臨床癥狀明顯加重或MG治療藥物劑量明顯增加。參考美國重癥肌無力基金會(huì)MGFA 干預(yù)后狀態(tài)分級癥狀描述。

1.4 細(xì)胞因子檢測 采用ELISA法測定血清IL-6、TGF-β、IL-17、IL-21、IL-27濃度，由Multiskan FC酶標(biāo)儀讀取OD值，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所用試劑盒為欣博盛QuantiCyto ELISA試劑盒IL-6(批號H171222-007a)、IL-17(批號H171222-170a)、IL-21(批號H171222-107a)，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料根據(jù)數(shù)據(jù)分布類型(非正態(tài)分布)采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組與不同分型重癥肌無力患者細(xì)胞因子水平比較 對照組血清IL-6水平[2.78(2.29～3.47)pg/ml]顯著低于眼肌型[4.47(3.00～8.87)pg/ml]及全身型[4.61(2.56～9.42)pg/ml]重癥肌無力患者(P<0.05)，而眼肌型與全身型重癥肌無力患者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其他細(xì)胞因子TGF-β、IL-17、IL-21、IL-27血清濃度在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3，圖1。

表3 對照組與眼肌型、全身型重癥肌無力患者細(xì)胞因子比較 pg/ml,median(IQR)

圖1 不同臨床分型重癥肌無力患者血清細(xì)胞因子比較

2.2 對照組及不同病程重癥肌無力患者血清細(xì)胞因子比較 (1)血清IL-6：對照組低于初發(fā)階段的重癥肌無力患者(P<0.05)，而與穩(wěn)定期、癥狀加重期重癥肌無力患者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同病程階段的重癥肌無力患者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)血清IL-17、IL-21、IL-27、TGF-β：在對照組及各不同病程階段重癥肌無力患者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4，圖2。

3 討論

IL-6可激活B細(xì)胞和T細(xì)胞，誘導(dǎo)Th17和Tfh細(xì)胞分化，并直接抑制Treg細(xì)胞，在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要的作用[4-6]。本研究并未發(fā)現(xiàn)眼肌型和全

表4 對照組及不同病程重癥肌無力患者細(xì)胞因子水平比較 pg/ml,median(IQR)

圖2 健康對照和不同病程階段重癥肌無力患者細(xì)胞因子比較

身型重癥肌無力患者血清IL-6存在顯著性差異，這與一部分研究的結(jié)果[7]是類似的，而另外一些研究則發(fā)現(xiàn)，全身型重癥肌無力患者血清IL-6水平要高于眼肌型患者[6]，這種差異可能由于入組患者病情嚴(yán)重程度不同所致，本研究中的全身型重癥肌無力患者均為Ⅱ型及Ⅲ型。本研究發(fā)現(xiàn)，初發(fā)期重癥肌無力患者血清IL-6水平顯著高于健康對照者，而穩(wěn)定期及加重期的患者血清IL-6水平與健康對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我院重癥肌無力科對兒童眼肌型重癥肌無力患者經(jīng)健脾益氣顆粒治療前后的細(xì)胞因子進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)治療后12個(gè)月時(shí)血清IL-6、IL-17水平低于治療前，并與臨床癥狀緩解相關(guān)[8]。重癥肌無力患者血IL-6升高的原因并不完全明確。在重癥肌無力患者中，LPS可能通過上調(diào)P2X7R，增加IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等促炎因子釋放[5]。在重癥肌無力動(dòng)物模型及患者肌細(xì)胞中可以觀察到IL-6表達(dá)增加，體外試驗(yàn)更進(jìn)一步證實(shí)，抗-AChR抗體可誘導(dǎo)人類肌細(xì)胞生成IL-6明顯增加，并且這種作用是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制而非肌細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的[9]。此外，還有研究表明重癥肌無力患者胸腺上皮細(xì)胞功能異常，可過量分泌IL-1、IL-6等細(xì)胞因子。IL-6獨(dú)自或與其他細(xì)胞因子協(xié)同，參與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)，在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用，如下調(diào)FoxP3表達(dá)，促進(jìn)IL-17產(chǎn)生，與IL-1協(xié)同可促使FoxP3+細(xì)胞分泌IL-17，與TGF-β協(xié)同可使Treg細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化[10]，通過STAT3—RORγt信號通路調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞。體外細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)提示，MG患者的Treg細(xì)胞功能異?？赡芘cIL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A信號通路相關(guān)[11]。在重癥肌無力患者或動(dòng)物模型中，IL-6可調(diào)節(jié)肌細(xì)胞蛋白分解，抗IL-6R抗體可拮抗這種作用[12]，并且下調(diào)IL-17、IL-21促炎因子，減少抗-AChR抗體生成，緩解重癥肌無力癥狀[13]。IL-6基因敲除模型動(dòng)物重癥肌無力癥狀輕于野生型[14]。動(dòng)物試驗(yàn)研究提示，抗IL-6抗體治療可以減輕模型動(dòng)物的肌無力癥狀[15]。結(jié)合我們及之前的研究，IL-6與重癥肌無力發(fā)病及病情密切相關(guān)，可能是未來重癥肌無力治療重要靶點(diǎn)。

在本研究中，重癥肌無力患者血清TGF-β與健康對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與一些研究結(jié)果[16]是類似的。另外T細(xì)胞體外功能檢測也未發(fā)現(xiàn)重癥肌無力患者與健康對照組培養(yǎng)液中TGF-β的差異[17]，但也有研究顯示重癥肌無力患者血清TGF-β升高[18]，而另一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)重癥肌無力患者TGF-β1水平較健康對照組降低，而在給予糖皮質(zhì)激素治療后升高[19]。在動(dòng)物模型中，MG動(dòng)物血清TGF-β1水平與對照組無差異[20]。TGF-β具有抗炎和促炎雙重作用，在自身免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，在IL-6、IL-23存在時(shí)，TGF-β可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞發(fā)揮促炎作用，而Treg細(xì)胞則通過TGF-β、IL-10、IL-25等細(xì)胞因子維持免疫耐受功能[21,22]。此外，TGF-β可能通過下調(diào)樹突細(xì)胞功能及抑制IL-2分泌、上調(diào)Treg細(xì)胞功能、增加髓源性抑制細(xì)胞等，抑制T、NK細(xì)胞增殖、遷移、激活、發(fā)揮功能，可抑制細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞細(xì)胞效應(yīng)，如穿孔素、顆粒酶B和A、IFN-γ、FAS配體表達(dá)等，調(diào)節(jié)抗體產(chǎn)生，在免疫抑制和免疫耐受中發(fā)揮著重要作用[23]。動(dòng)物試驗(yàn)表明，地塞米松可抑制TGF-β的表達(dá)[18]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過TGF-β等可溶性分子抑制T細(xì)胞及B細(xì)胞功能，從而抑制抗-AChR抗體生成[21]。

IL-17家族包括6個(gè)亞型(IL-17A,IL-17B,IL-17C,IL-17D,IL-17E,和 IL-17F)，IL-17可誘導(dǎo)IL-6、TNF-α、IL-1β、G-CSF等促炎細(xì)胞因子，其過表達(dá)被認(rèn)為與自身免疫疾病相關(guān)[14]，自身反應(yīng)性T細(xì)胞具有分泌IL-17、IFN-γ和GM-CSF增多而IL-10減少的特點(diǎn)[2]。在本研究中，未發(fā)現(xiàn)重癥肌無力患者血清IL-17與健康對照組存在顯著性差異。有研究顯示，全身型血清IL-17水平顯著高于眼肌型及健康對照組[7]，并且眼肌型重癥肌無力患者血清IL-17高于健康對照[6]，而另外一些研究則提示而眼肌型和健康對照者之間無差異[24]，甚至有研究發(fā)現(xiàn)全身型重癥肌無力患者血IL-17水平顯著下降，而在治療后顯著上升[25]。在 MuSK-MG患者研究中發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞分泌IL-17增加[26]。Meriggioli等[17]發(fā)現(xiàn)重癥肌無力患者CD4+CD25high CD127low/Treg細(xì)胞功能特別是抑制IL-17、IL-6分泌作用異常。IL-17在體內(nèi)具有雙重作用，一方面IL-17可促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體[26]，抗-AChR抗體產(chǎn)生即依賴于IL-17，同時(shí)分泌IL-17與GM-CSF的T細(xì)胞可誘導(dǎo)自身免疫，另一方面，同時(shí)分泌IL-17和IL-10的T細(xì)胞則具有維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用[27]。模型動(dòng)物中Th17細(xì)胞增多伴IL-17上調(diào)與發(fā)病相關(guān)，IL-17可促進(jìn)AChR特異性T細(xì)胞及產(chǎn)抗-AChR B細(xì)胞增殖[28]。有研究者結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17基因敲除模型動(dòng)物重癥肌無力癥狀輕于野生型[14]，并且抗IL-6抗體治療可抑制IL-17基因表達(dá)，減輕疾病癥狀[15]。我院重癥肌無力科發(fā)現(xiàn)兒童重癥肌無力患者治療后IL-17水平低于治療前，并與臨床癥狀緩解相關(guān)[8]。

IL-21是Th17細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子之一，可誘導(dǎo)Th2、Th17和Tfh細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞分化，并抑制Th1和Treg細(xì)胞分化[14,29]，與自身免疫性疾病密切相關(guān)，如活動(dòng)期狼瘡患者血IL-21顯著高于健康對照[30]。IL-21可增加CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[29]，降低CD4+CD25+T細(xì)胞對CD4+CD25-T細(xì)胞的抑制作用，通過STAT3信號通路誘導(dǎo)B細(xì)胞分化[29]，拮抗Treg細(xì)胞對于外周組織的免疫保護(hù)作用[31]。IL-21還可促使B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫耐受[29]。重癥肌無力患者的IL-21通路可能存在調(diào)節(jié)異常，其Tfh細(xì)胞通過分泌IL-21促進(jìn)自身抗體生成，在抗-AChR陽性的MG患者中，IL-21不能像在正常人中那樣抑制IL-17A分泌[11]，此外，MuSK陽性MG患者的CD4+T細(xì)胞分泌IL-21增加[26]。MG患者血清IFN-γ、IL-17、IL-21要高于健康人，全身型患者血清IL-21高于眼肌型[6]。本研究并未發(fā)現(xiàn)重癥肌無力患者血IL-21與健康對照存在差異，這可能與IL-21所具有的雙重作用有關(guān)，也可能與入組人群病情較輕有關(guān)。

IL-27在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用，既往研究提示乙酰膽堿受體抗體陽性的重癥肌無力患者血清IL-27顯著高于健康對照，而在免疫球蛋白治療后下降[32]。還有研究進(jìn)一步分析了不同亞型的重癥肌無力患者血清IL-27水平，發(fā)現(xiàn)全身型重癥肌無力患者血清IL-27水平顯著高于眼肌型和健康對照組，胸腺瘤相關(guān)重癥肌無力患者顯著高于無胸腺瘤重癥肌無力患者 ，抗-AChR陽性重癥肌無力患者顯著高于抗-AChR陰性患者，但眼肌型及非胸腺瘤相關(guān)重癥肌無力患者與健康對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[33]，在該研究中還發(fā)現(xiàn)血清IL-27水平與全身型重癥肌無力患者的MG-ADLs評分正相關(guān)，免疫球蛋白治療可以顯著降低血清IL-27水平[33]。而在另一項(xiàng)研究中，早發(fā)病MG患者血清IL-27水平顯著高于健康對照，而晚發(fā)病MG患者血清IL-27則與健康對照水平相近，并且AChR抗體陽性MG患者血清AChR水平與IL-27正相關(guān)[34]。但是本研究中與前述研究不同，未發(fā)現(xiàn)重癥肌無力患者血清IL-27較健康對照組升高，不同病程及亞型重癥肌無力患者血清IL-27差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是由于重癥肌無力患者之間較大的異質(zhì)性及自身免疫性疾病涉及復(fù)雜細(xì)胞因子調(diào)控所致。IL-27由抗原呈遞細(xì)胞如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等分泌，在固有和獲得性免疫中發(fā)揮著重要的作用，IL-27具有促炎和抗炎雙重作用，如其既可通過誘導(dǎo)Th細(xì)胞分化促進(jìn)炎癥發(fā)展，促進(jìn)IL-21分泌，誘導(dǎo)Tfh細(xì)胞分化并維持其存活[35]，另一方面可抑制Th17細(xì)胞功能并誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生[21]，負(fù)向調(diào)節(jié)IL-2、IL-6、IL-27等細(xì)胞因子，拮抗IL-6的促炎作用，控制免疫過程，IL-27缺陷小鼠可出現(xiàn)嚴(yán)重的T細(xì)胞介導(dǎo)致死性免疫應(yīng)答，給予IL-27可減輕炎癥造成的骨破壞[36]。在胸腺瘤相關(guān)的重癥肌無力患者中，IL-27可能通過IL-27/IFN-γ調(diào)節(jié)環(huán)形成正反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致胸腺濾泡增生[37]，這可能部分解釋了重癥肌無力患者常伴有胸腺異常的現(xiàn)象。

綜上所述，重癥肌無力患者可能存在著復(fù)雜的免疫調(diào)控異常，具有顯著的異質(zhì)性，但包括本研究在內(nèi)的多數(shù)研究提示重癥肌無力患者IL-6通路調(diào)節(jié)異常，并且IL-6細(xì)胞因子通路與多種細(xì)胞因子相互作用，可能在重癥肌無力患者免疫調(diào)控發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，有望成為新的治療靶點(diǎn)。