AKAP10基因單核苷酸多態(tài)性與青海地區(qū)病態(tài)竇房結(jié)綜合征研究※

任 明，保積英，許博林，杜 娟，何 媛，Aqib Bilal

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西寧 810001；2.青海省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，西寧 810007；3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001；4.青海大學(xué)，西寧 810016)

病態(tài)竇房結(jié)綜合征(Sick Sinus Syndrome， SSS)病因及機(jī)制目前尚不完全明確，可能與竇房結(jié)細(xì)胞受損、竇房結(jié)內(nèi)各種離子通道改變、竇房結(jié)組織重構(gòu)等因素有關(guān)[1，2]。目前較多文獻(xiàn)認(rèn)為原發(fā)性心電異常發(fā)病機(jī)制主要是由其編碼的離子通道的基因突變引起的，被稱為“離子通道病”[3]。有研究指出，部分SSS的發(fā)生機(jī)制也與基因突變有關(guān)[1，4，5]。趙允梓等人認(rèn)為蛋白激酶A錨定蛋白(A-kinase anchoring proteins，AKAPs)家族中的AKAP10基因與心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)關(guān)系密切[6]，并且指出AKAP10中兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(rs203462和rs4925060)與竇性停搏密切相關(guān)。SSS的基因多態(tài)性研究為該病的診治提供了新思路，有研究認(rèn)為AKAP10通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞對(duì)膽堿能迷走神經(jīng)的敏感性來調(diào)節(jié)心率[7]。目前國內(nèi)對(duì)SSS患者基因多態(tài)性的研究僅限漢族人群。青海地區(qū)世居藏族的迷走神經(jīng)張力略高，致成人心率偏慢[8]，為了解青海地區(qū)漢藏族SSS的發(fā)病與AKAP10基因多態(tài)性的關(guān)系及藏族人發(fā)生SSS與漢族之間有無差異性，本研究選取青海地區(qū)漢族、藏族SSS患者及健康對(duì)照人群進(jìn)行對(duì)照研究?，F(xiàn)將有關(guān)研究情況報(bào)告如下。

1.對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集青海地區(qū)2018年1月至2019年12月來青海大學(xué)附屬醫(yī)院和青海省心腦血管病?？漆t(yī)院就診的符合入選標(biāo)準(zhǔn)的人員為研究對(duì)象：漢族SSS患者60例，平均年齡62.28±9.58歲，男性31例，女性29例；藏族SSS患者35例，平均年齡64.94±7.24歲，男性20例，女性15例。并將同期來兩院體檢的漢、藏族健康者納入對(duì)照組，其中藏族47例，平均年齡58.70±14.49歲，男性18例，女性29例；漢族48例，平均年齡59.67±12.33歲，男性21例，女性27例，各組間年齡、性別比較均無差異(P>0.05)，具有可比性。所有患者或家屬簽署了知情同意書。本研究經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 研究方法

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇

入選標(biāo)準(zhǔn)參照《內(nèi)科學(xué)》(第九版)標(biāo)準(zhǔn)：所有研究對(duì)象心電圖須符合以下條件之一：1)非藥物引起的持續(xù)而顯著的竇性心動(dòng)過緩(50次/分)，發(fā)作無明顯誘因，和臨床癥狀相關(guān)；2)竇性停搏或竇性靜止與竇房阻滯；3)竇房傳導(dǎo)阻滯與房室傳導(dǎo)阻滯并存；4)心動(dòng)過緩-心動(dòng)過速綜合征交替發(fā)作；5)既往診斷SSS患者并行起搏器植入治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有影響心臟傳導(dǎo)功能的器質(zhì)性心臟病(如風(fēng)濕性心臟病、急性下壁心肌梗死病和先天性心臟病等)患者。

1.2.2 一般資料收集

記錄入選研究對(duì)象的年齡、性別、身高、體重，同時(shí)采集清晨空腹?fàn)顟B(tài)下4 mL外周靜脈血，檢測(cè)總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、尿素氮(BUN)等生化指標(biāo)；根據(jù)體表心電圖及24小時(shí)心電監(jiān)護(hù)記錄判斷是否合并心房顫動(dòng)及左束支傳導(dǎo)阻滯。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟設(shè)計(jì)

取抗凝外周靜脈血2 mL→提取基因組DNA→用PCR擴(kuò)增目的基因→做PCR產(chǎn)物純化→制備電泳樣品→做序列測(cè)定、分析。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)過程設(shè)定

1.2.4.1 SNaPshot PCR引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增、純化

SNaPshot PCR引物見表1。

表1 SNaPshot PCR引物

擴(kuò)增：使用金牌綠酶 Mix進(jìn)行擴(kuò)增，加入金牌綠酶Mix 45 μL、上游Primer(10P)2 μL、下游 Primer(10P)2 μL、gDNA 1 μL。

PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性120 S；98 ℃變性10 S；60 ℃退火20 S；72 ℃延伸10 S，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸60 S后置4 ℃環(huán)境保存。

純化：在15 μL PCR產(chǎn)物中加入5USAP和2UExoI，震蕩混勻，置37 ℃環(huán)境保溫1 h，然后置75 ℃保溫15 min以滅活SAP、ExoI酶。

1.2.4.2 SNaPshot 延伸反應(yīng)

取經(jīng)過處理的PCR混合液各3 μL，加入5 μL SNapshot Reaction Mix、1 μL混合引物、1 μL DDH2O混合。

單核苷酸延伸：96 ℃變性10 S，50 ℃退火5 S；60 ℃延伸30 S，共25個(gè)循環(huán)。置4 ℃環(huán)境保存。

電泳樣品制備：加入上述SNaPshot 0.5 μL、高度去離子甲酰胺9.25 μL、GS-120 LIZ 0.25 μL，95 ℃變性5 min，迅速冰冷4 min。

1.2.4.3 序列測(cè)定、分析

光譜校正：將Hi-Di甲酰胺350 μL、Matrix標(biāo)準(zhǔn)品50 μL混合，95 ℃變性5 min→迅速冰冷5 min，平分2管，每管200 μL。分裝至上機(jī)板后對(duì)3730XL DNA Analyzer進(jìn)行光譜校正。

毛細(xì)管電泳檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析：使用3730XL DNA Analyzer儀對(duì)制備好的樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳并搜集信號(hào)。環(huán)境溫度：18 ℃～25 ℃，毛細(xì)管長度：50 cm，加熱爐溫度：60 ℃，運(yùn)行電壓：15 KV。使用GeneMapper V4.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果使用Sanger軟件測(cè)序校正。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.結(jié)果

2.1 各組一般臨床資料比較情況

比較各組研究對(duì)象一般臨床資料的差異，分析結(jié)果顯示：部分組間合并房顫差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BMI、TC、LDL及BUN水平在各組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其中，兩兩比較分析結(jié)果顯示：1)漢族SSS組與漢族對(duì)照組：合并房顫的組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2)藏族SSS組與藏族對(duì)照組：合并房顫的組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3)漢族對(duì)照組與藏族對(duì)照組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2～3。

表2 各組一般資料

表3 各組一般資料(%)

2.2 各組基因型Hardy-Weinberg檢驗(yàn)結(jié)果

對(duì)各組rs203462基因型行遺傳平衡的Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，分析結(jié)果顯示：藏族SSS組：χ2=1.033，P>0.05；藏族健康對(duì)照組：χ2=2.343，P>0.05；漢族SSS組：χ2=1.285，P>0.05；漢族健康對(duì)照組：χ2=0.486，P>0.05，藏、漢族SSS組、正常組的研究對(duì)象均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明入選人群符合遺傳平衡，具有代表性。

各組rs4925060基因型行遺傳平衡的Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，分析結(jié)果顯示：藏族SSS組：χ2=0.990，P>0.05；藏族健康對(duì)照組：χ2=0.535，P>0.05；漢族SSS組：χ2=0.413，P>0.05；漢族健康對(duì)照組：χ2=0.326，P>0.05，藏、漢族SSS組、正常組的研究對(duì)象均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明入選人群符合遺傳平衡定律，具有代表性。

2.3 漢、藏族不同位點(diǎn)SSS組與正常組間比較各基因型及等位基因頻率

分別比較漢、藏族SSS組與對(duì)照組在兩個(gè)位點(diǎn)rs203462和rs4925060的CC、CT、TT基因型及C、T等位基因頻率，CC、CG、GG各基因型及C、G等位基因頻率的差異用χ2檢驗(yàn)，分析結(jié)果顯示，rs203462位點(diǎn)：1)漢族SSS組與藏族SSS組基因型及等位基因的頻率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2)藏族SSS組與藏族對(duì)照組基因型及等位基因的頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3)漢族SSS組與漢族對(duì)照組基因型及等位基因頻率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs4925060位點(diǎn)：1)漢族SSS組與藏族SSS組基因型及等位基因的頻率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2)藏族SSS組與藏族對(duì)照組基因型及等位基因的頻率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3)漢族SSS組與漢族對(duì)照組基因型及等位基因頻率的差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4～5。

表4 漢族和藏族SSS rs203462基因型和等位基因(%)

表5 漢族和藏族SSS rs4925060基因型和等位基因(%)

3.討論

心律失常是當(dāng)今各個(gè)國家死亡的主要原因之一，每年有40萬到46萬美國人死于心律失常引起的猝死[7]。對(duì)于SSS的發(fā)病率報(bào)道不一，從22%～45%不等[9]。目前關(guān)于SSS遺傳學(xué)方面的發(fā)病機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)，國內(nèi)外學(xué)者在動(dòng)物及人體研究中發(fā)現(xiàn)遺傳基因的突變是導(dǎo)致SSS的主要因素之一[10-15]，如Klotho基因G395A位點(diǎn)多態(tài)性與SSS發(fā)病相關(guān)。AKAPs屬于與蛋白質(zhì)激酶A(PKA)結(jié)合的支架蛋白家族，在交感系統(tǒng)興奮的情況下，活化的 PKA可以磷酸化一系列參與調(diào)節(jié)電活動(dòng)性和收縮性的蛋白質(zhì)，AKAPs是其中一員，參與調(diào)節(jié) cAMP/PKA的活性和細(xì)胞內(nèi)的Ca2+信號(hào)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)心臟的功能。趙允梓等人[6]證實(shí)AKAP10中兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs203462和rs4925060與竇性停搏相關(guān)。我們的研究結(jié)果提示，AKAP10中rs203462位點(diǎn)在藏族SSS組及對(duì)照組中具有顯著差異，T等位基因的頻率明顯高于藏族健康對(duì)照組，攜帶T等位基因可能會(huì)增加SSS的易感性。Kammerer等人發(fā)現(xiàn)，1936A→G AKAP10轉(zhuǎn)換(rs203462)，即第646位氨基酸由異亮氨酸(Ile)變?yōu)槔i氨酸(Val)，進(jìn)而改變AKAP10與 PKA 調(diào)節(jié)亞單位 RI alpha (PKA-RIα) 的結(jié)合，進(jìn)而對(duì)心臟離子通道或交換器的磷酸化狀態(tài)產(chǎn)生顯著影響，導(dǎo)致心臟功能障礙[16]。有研究認(rèn)為，1936A→G，這種轉(zhuǎn)變與心率變異性和長QT間期有關(guān)，同時(shí)與心律失常、血壓變化也有關(guān)[9，17，18]。研究者發(fā)現(xiàn)AKAP10的I646V(A to G)多態(tài)性與老年人群心電圖中PR間期的變化有關(guān)，并且報(bào)道了老年人群中的純合子纈氨酸變異體的PR間期明顯低于異亮氨酸純合子個(gè)體的PR間期。在AKAP10突變的老鼠模型中，用ECG記錄發(fā)現(xiàn)竇性心動(dòng)過緩(P-P間期延長)和房室傳導(dǎo)減慢(P-R間期延長)兩種緩慢型的心律失常[19]，并證實(shí)了這種突變與膽堿能迷走神經(jīng)敏感性增高有關(guān)。以上研究結(jié)果均說明rs203462變異與SSS的發(fā)生有顯著關(guān)系，與我們的研究結(jié)果一致。藏族人群本身迷走神經(jīng)活性高致心率偏慢，再加上研究證實(shí)AKAP10突變體具有更強(qiáng)的壓力感受反射性，所以藏族SSS的發(fā)生可能與這兩者有關(guān)。

我們的研究結(jié)果顯示，AKAP10基因rs4925060位點(diǎn)的多態(tài)性與漢、藏族SSS的發(fā)病無關(guān)。另外我們的研究結(jié)果顯示，AKAP10單核苷酸多態(tài)性rs203462和rs4925060位點(diǎn)基因型與等位基因頻率在漢族SSS與藏族SSS間無差異，Tingley等人在研究中發(fā)現(xiàn)AKAP10突變體I646V在改變心率的研究中發(fā)現(xiàn)這種改變不存在種族、性別、年齡等差異[8]，這與我們的研究結(jié)果一致。

本研究比較漢、藏族SSS組與健康對(duì)照組一般臨床資料的差異，比較結(jié)果顯示：合并房顫(Af)可能與SSS的患病相關(guān)。SSS組較健康對(duì)照組更易合并房顫的發(fā)生，有研究發(fā)現(xiàn)在快速起搏構(gòu)建的Af模型中竇房結(jié)功能及竇房傳導(dǎo)功能出現(xiàn)明顯障礙，此外Af還會(huì)導(dǎo)致心房及竇房結(jié)纖維化最終導(dǎo)致SSS的發(fā)生與發(fā)展[20]。劉賽哲等人明確指出，Af是SSS的主要危險(xiǎn)因素[21]。由此可見心房顫動(dòng)既是SSS的重要危險(xiǎn)因素，同時(shí)也是常見并發(fā)癥。本研究僅僅統(tǒng)計(jì)了SSS合并房顫的情況，兩者之間的因果關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，青海地區(qū)漢、藏族間AKAP10單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs203462及rs4925060基因多態(tài)性無差異性，但AKAP10基因rs203462T/C多態(tài)性可能與藏族人群的SSS發(fā)生有關(guān)，攜帶T等位基因可能會(huì)增加藏族人群SSS罹患風(fēng)險(xiǎn)，但與漢族無關(guān)。本研究結(jié)果為青海地區(qū)提高SSS患者的診治水平提供了新的思路。