日本血吸蟲p38MAPK的克隆、表達(dá)和功能初步分析

李慧民，李 雪，Bikash R. Giri，劉軍濤，夏天奇，王立輝,2，杜鵬飛，陳永軍，Hanif Ullah，Abdul Qadeer，程國(guó)鋒

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384）

p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是一種具有重要調(diào)控作用的蛋白激酶，已有研究表明p38在豬、牛、小鼠等哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程和胚胎發(fā)育中具有重要的調(diào)節(jié)作用[1-5]。在曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni）中，研究表明Smp38MAPK對(duì)血吸蟲的纖毛擺動(dòng)速度具有調(diào)節(jié)作用[6]，而且抑制Smp38MAPK的活性會(huì)顯著降低毛蚴向母孢蚴的發(fā)育[7]。最近研究表明抑制Smp38MAPK可導(dǎo)致曼氏血吸蟲雌蟲的產(chǎn)卵量下降，成蟲體表受損，卵巢發(fā)育不全[8]。另外，還有研究表明曼氏血吸蟲Smp38MAPK還調(diào)控參與抗氧化防御、核糖體結(jié)構(gòu)組成、剪接體、細(xì)胞骨架以及嘌呤和嘧啶代謝途徑相關(guān)等重要信號(hào)通路[8]。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲Sjp38MAPK是多個(gè)信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。為深入闡明Sjp38MAPK在日本血吸蟲的生殖發(fā)育與產(chǎn)卵過(guò)程中的作用，本研究對(duì)Sjp38MAPK基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)及鑒定。另外，利用RNA干擾技術(shù)，對(duì)Sjp38MAPK在日本血吸蟲的生殖和發(fā)育中的功能進(jìn)行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 生物材料及試劑清潔級(jí)昆明小鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，雄性健康小鼠，8周齡；日本血吸蟲尾蚴購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心上海寄生蟲病預(yù)防控制所，經(jīng)腹部皮膚感染至昆明小鼠體內(nèi)，在感染后相應(yīng)時(shí)間，通過(guò)肝門靜脈灌注法，收取蟲體。RNAiso Plus購(gòu)自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；包涵體蛋白提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；UNICONTM qPCR SYBR?Green Master Mix（抗體法，No Rox）、2×Hieff Canace?PCR Master Mix高保真酶預(yù)混液、一步法快速克隆試劑盒購(gòu)自翌圣生物科技（上海）有限公司；Cell Titer-LumiTM發(fā)光法細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640、Gibco胎牛血清購(gòu)自上海奧吉生物技術(shù)有限公司；HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+g DNA wiper）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DMEM NUTRIENT MIX F12購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)Sjp38MAPK的cDNA序列，在NEBuilder網(wǎng)站上設(shè)計(jì)包含KpnⅠ和Hind Ⅲ 限制性酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增CDS全長(zhǎng)序列的引物，上游引物序列：5'-GACAGCCCAGATCTGGGTACCATG TCTTCCACCAAGGATTTG-3'；下游引物序列：5'-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTCTAGT TGTTTACTTTTAATTGATCCAAC-3'。利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物，上游引物序列：5'-TTGAAGTCTGGCTTTGTGTC-3'，下游引物序列：5'-GATTTAACCTGTCATCGTGTG-3'。根據(jù)擴(kuò)增的Sjp38MAPK的cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成siRNAs分子，分別命名為siRNA-170、siRNA-417、siRNA-977，siRNAs核酸序列見表1。

表1 siRNAs序列Table 1 The sequences of siRNAs

1.3 生物信息學(xué)分析Sjp38MAPK序列查找其他物種中p38MAPK的同源序列，應(yīng)用ClustalW對(duì)Sjp38MAPK及其同源序列進(jìn)行多重序列分析[9]，使用Neighbor joint在MEGA7．0上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10]。利用ScanProsite在線工具（https://prosite．expasy．org/scanprosite/）對(duì)Sjp38MAPK結(jié)構(gòu)域和特征序列（激酶ATP結(jié)合序列和MAP激酶序列）進(jìn)行了預(yù)測(cè)[11-12]。

1.4 Sjp38MAPK的克隆、表達(dá)及純化提取日本血吸蟲成蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并將其作為PCR模板擴(kuò)增Sjp38MAPK序列。將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后，然后連接到同樣雙酶切的pET-32a（+）載體質(zhì)粒上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至含有氨芐抗生素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定。提取重組質(zhì)粒pET-32a（+）-Sjp38MAPK，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET-32a（+）-Sjp38MAPK轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)加入1．0 mmol/L IPTG，在37℃條件下誘導(dǎo)約10 h，誘導(dǎo)產(chǎn)物應(yīng)用10%SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離，利用His-Bind純化試劑盒獲得重組蛋白，并用MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。

1.5 qRT-PCR分析Sjp38MAPK在日本血吸蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)[13]通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR（qRT-PCR）方法檢測(cè)日本血吸蟲在不同發(fā)育時(shí)期（蟲卵、尾蚴和感染后第14、21、28、35 d）中Sjp38MAPK的轉(zhuǎn)錄水平。分別提取每個(gè)樣品的總RNA，制備cDNA，以日本血吸蟲煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）作為內(nèi)參對(duì)照（上游引物序列：5'-CGAGGACCGAACAGCCAGAGAGG-3'，下游引物序列：5'-TCCAGACGAACTTTAGAATTC-3'）進(jìn)行PCR分析。

1.6 日本血吸蟲Sjp38MAPK的體外干擾根據(jù)Sjp38MAPK的cDNA序列，設(shè)計(jì)并化學(xué)合成siRNAs分子（siRNA-170、siRNA-417、siRNA-977）和對(duì)照siRNA（negative control siRNA，NC）。取干擾后26 d的日本血吸蟲，通過(guò)電轉(zhuǎn)的方法對(duì)日本血吸蟲的Sjp38MAPK基因進(jìn)行體外干擾，將干擾后的血吸蟲轉(zhuǎn)移到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔含有2 mL新鮮培養(yǎng)基和10條蟲體，每天更換培養(yǎng)基，并用顯微鏡觀察蟲體的活力。

在培養(yǎng)后的第5 d，收集蟲體，提取血吸蟲的總RNA，取500 ng RNA做qRT-PCR，對(duì)其干擾效果進(jìn)行評(píng)估，篩選干擾Sjp38MAPK效果最好的siRNA分子，用于功能研究。用干擾效果較好的siRNA再次干擾，并確定其干擾效果后，利用qRT-PCR分析血吸蟲的四個(gè)卵殼蛋白基因（GenBank登錄號(hào)：AY222895．1、M59318．1、AY814244．1和D32205．1，引物序列見表2）的m RNA表達(dá)情況。利用CellTiter-LumiTM發(fā)光法細(xì)胞活力測(cè)定試劑盒檢測(cè)蟲體的細(xì)胞活性。

表2 qPCR引物序列Table 2 The sequences of qPCR primer

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析Sjp38MAPK序列生物信息學(xué)分析表明Sjp38MAPK序列與曼氏血吸蟲的同源性為93．48%，與埃及血吸蟲的同源性為90．70%，與人和小家鼠的同源性均為57．10%（圖1A）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明Sjp38MAPK與曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲較近，與人、小鼠和斑馬魚較遠(yuǎn)（圖1B）。GenBank登錄號(hào)分別為：S．mansoni（XP_018647990．1）、S．haematobium（XP_012799766．1）、E．granulosus（ACT21201．1）、H．sapiens（NP_001306．1）和M．musculus（NP_001161980．1）。

圖1 Sjp38MAPK的序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.1 Sequence alignment and phylogenetic tree analysis of Sjp38MAPK

2.2 Sjp38MAPK編碼cDNA的克隆、重組蛋白的表達(dá)及純化將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2A）克隆到pET-32a（+）載體，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后用10%SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果表明在預(yù)期分子量55 kDa處呈現(xiàn)特異性的條帶（圖2B）。利用His親和層析，純化重組蛋白，電泳分析表明獲得單一條帶（圖2C），純化的重組蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定為Sjp38MAPK。

圖2 Sjp38MAPK的CDS序列的克隆、表達(dá)和純化Fig.2 Cloning, expression and purification of CDS sequence of Sjp38MAPK

2.3 qRT-PCR分析Sjp38MAPK在不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄情況利用qRT-PCR檢測(cè)日本血吸蟲中Sjp38MAPK在不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果表明，Sjp38MAPK在日本血吸蟲尾蚴、蟲卵、童蟲和成蟲時(shí)期均有表達(dá)，并且在成蟲（21、28、35 d）中的表達(dá)量顯著高于蟲卵、尾蚴和童蟲時(shí)期（圖3）。

圖3 qRT-PCR分析Sjp38MAPK在日本血吸蟲中的表達(dá)Fig.3 Expression of Sjp38MAPK in S. japonicum by qRT-PCR

2.4 日本血吸蟲Sj p38MAPK的干擾利用qRT-PCR分析三種不同的siRNAs分子對(duì)Sjp38MAPK的干擾情況，結(jié)果表明siRNA-977分子具有較好的干擾效果（圖4A）。隨后，選擇干擾Sjp38MAPK效果最好的siRNA-977分子再次干擾Sjp38MAPK的mRNA（圖4B），并檢測(cè)蟲體卵殼蛋白基因的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果表明Sjp38MAPK干擾后卵殼蛋白基因AY222895．1、M59318．1和D32205．1的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（圖4C）。另外，利用CellTiter-LumiTM發(fā)光法細(xì)胞活力測(cè)定試劑盒檢測(cè)蟲體的細(xì)胞活性，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干擾組日本血吸蟲蟲體活性顯著降低（圖4D）。

圖4 日本血吸蟲Sjp38MAPK基因的干擾Fig.4 Interference of Sjp38MAPK gene in Schistosoma japonicum

3 討論

有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，參與酶代謝、核酸調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程的蛋白分子在日本血吸蟲各生殖階段均可通過(guò)磷酸化和去磷酸化修飾，對(duì)血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和性成熟進(jìn)行調(diào)控[14]。此外，在曼氏血吸蟲的研究中表明，MAPK蛋白家族成員在不同的細(xì)胞功能中起著至關(guān)重要的作用[15]。p38MAPK為MAPK信號(hào)通路的重要成員，被認(rèn)為是眾多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中轉(zhuǎn)站[16]。因此，開展Sjp38MAPK的功能研究，對(duì)于深入揭示血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育分子機(jī)制具有重要意義。

我們對(duì)日本血吸蟲Sjp38MAPK的編碼cDNA進(jìn)行了克隆、重組蛋白表達(dá)和RNA干擾研究。如圖1A顯示，Sjp38MAPK存在蛋白激酶特有的結(jié)構(gòu)域，提示該蛋白可催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移使底物蛋白發(fā)生磷酸化[17]。進(jìn)一步研究表明Sjp38MAPK在血吸蟲成蟲中表達(dá)量較高（圖3），提示該蛋白可能在成蟲的寄生和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。對(duì)Sjp38MAPK RNA干擾研究表明，抑制Sjp38MAPK可影響蟲體卵殼蛋白基因的表達(dá)（圖4C）和蟲體活性（圖4D），提示Sjp38MAPK在蟲體的生殖發(fā)育和產(chǎn)卵中同樣發(fā)揮重要作用。