同種異體骨植骨臨床應(yīng)用與研究進展

滕沙格 陳 哲 范佳俊 陳巖松

人體骨骼具有自我再生和自我修復(fù)功能，這使得受損器官能夠完全恢復(fù)到其損傷前的組成、結(jié)構(gòu)和功能[1]。然而，在病理性骨折或大段骨缺損時，骨的修復(fù)重建往往失敗，導(dǎo)致骨延遲愈合或不愈合。這些患者常常需要進行骨移植處理，然而各種骨移植材料僅能體現(xiàn)骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)、骨生成中的一種或數(shù)種作用[2]。同種異體骨移植是從骨庫取同種異基因捐贈者的骨，植入到患者骨質(zhì)缺損部位，其來源豐富，不受形態(tài)、大小限制，生物活性良好，顯示了良好的骨組織修復(fù)的效果。據(jù)文獻報道，同種異體骨移植仍有較高的失敗率[2-5]，主要表現(xiàn)為植骨延遲愈合、不愈合及疲勞骨折，免疫反應(yīng)及骨吸收。本文對同種異體骨植骨的臨床應(yīng)用和相關(guān)研究進展作一綜述。

1 同種異體骨的種類

1.1 新鮮的同種異體骨塊 同種異體骨移植與實質(zhì)性臟器移植不同，可以沒有存活的細胞。為減少免疫反應(yīng)，盡量刮除新鮮骨塊軟組織、骨膜和骨髓等，用高壓反復(fù)沖洗骨髓腔。當(dāng)然，這種機械的方法并不能完全去除細胞成分，移植后免疫排斥反應(yīng)較明顯，各種傳染性疾病傳播的可能性也較大，故較少應(yīng)用。

1.2 深低溫冷凍骨 先將獲得的同種異體骨表面的肌肉、韌帶、骨膜、軟骨等盡量徹底剔除，切成各種形狀和大小的移植骨塊。對需要保留關(guān)節(jié)軟組織的關(guān)節(jié)移植物，盡量去除骨膜，保留肌腱、韌帶和關(guān)節(jié)囊。用無菌生理鹽水或加抗生素的生理鹽水加壓沖洗，去除骨髓組織。制備過程和使用期間須重視細菌培養(yǎng)。用8%～10%的2-甲基亞砜或甘油浸泡30min 后進行無菌包裝，采用逐漸降溫法深凍處理。深凍法適用于各種骨移植材料的保存，尤其是要求保留軟骨活性的帶關(guān)節(jié)的大塊骨塊。它對移植骨的生物學(xué)和生物力學(xué)性能無明顯的影響，但滅菌不徹底。深凍法保存的同種異體骨移植后，也會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但以慢性排斥反應(yīng)為主。

1.3 冷凍干燥骨 將新制成的深凍骨放入真空冷凍干燥機中凍干24h（使其水分少于5%），再裝入滅菌塑料袋中真空密封，環(huán)氧乙烷滅菌，或采用鈷60 輻照滅菌（25kGy），室溫?zé)o菌封存。常溫下可保存5 年。應(yīng)用前一般要經(jīng)水化，即復(fù)水處理。優(yōu)點是常溫保存、便于運輸?shù)?。缺點是骨塊的骨強度受到明顯影響。

1.4 脫鈣骨 鹽酸脫鈣骨基質(zhì)具有很強的骨誘導(dǎo)能力，可以誘導(dǎo)血管周圍的未分化間充質(zhì)細胞、骨髓基質(zhì)細胞向成軟骨細胞或成骨細胞分化。在同種異體脫鈣骨處理基礎(chǔ)上，又制成脫鈣骨基質(zhì)（demineralized bone matrix，DBM）、骨基質(zhì)膠原（Bone matrix collagen，BMC）等品種。其最大優(yōu)點在于塑形方便，具有異位骨誘導(dǎo)活性。缺點是力學(xué)強度低，只能作為充填材料，不適用于修復(fù)負重部位。

1.5 自消化抗原去除骨 自消化抗原去除骨（Autolyzed Antigen-extracted Allogeneic bone，AAA 骨）。先將同種異體骨進行脫脂（用1:1 氯仿甲醇液混合液）10h，以提取細胞膜上的移植抗原。然后進行脫鈣（0.6mmol/L 鹽酸，2h）。再在中性磷酸緩沖液中孵育，以激活內(nèi)源性酶系統(tǒng)進行抗原的自身消化和提取。緩沖液中加入巰基蛋白酶可抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白酶（Bone Morphogenetic Protein，BMP），使BMP 免受破環(huán)。最后進行凍干和滅菌處理。滅菌可采用鈷60 輻照（15～25kGy）和環(huán)氧乙烷（1600mg/h），4℃左右保存。使得同種異體骨不但降低抗原性而且增強骨誘導(dǎo)能力。其骨誘導(dǎo)活性來自于骨的脫鈣作用和與基質(zhì)有關(guān)的BMP。

1.6 脫蛋白骨 分別采用20%過氧化氫和乙醚法制備的脫蛋白骨（deproteined bone，DPB），可較徹底的去除材料中主要的免疫原性物質(zhì)，即蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成份，避免其植入體內(nèi)后引起排斥反應(yīng)。封裝后，液態(tài)環(huán)氧乙烷（化學(xué)純）消毒。由于制作材料來源于松質(zhì)骨，其孔隙率高，孔徑在100～300μm2左右，較好的保留原骨組織的三維孔隙一網(wǎng)架結(jié)構(gòu)系統(tǒng)。該材料因網(wǎng)架有效空間大，保證良好的骨傳導(dǎo)性，為細胞的貼附、生長、增殖和成骨提供理想場所。

2 同種異體骨植骨的并發(fā)癥及預(yù)防、處理

2.1 感 染 感染可導(dǎo)致骨髓炎和骨溶解，延緩骨愈合，降低臨床效果[6-7]。整體上同種異體移植的感染率約為1.2%～9%[5，8-10]（骨腫瘤術(shù)后患者感染發(fā)生率為8%[9]，大段同種異體骨移植后感染率可達9%[8]）。同種異體骨污染最常見的病原體為凝固酶陰性葡萄球菌[11]。數(shù)據(jù)分析顯示，移植同種異體骨感染艾滋病毒的概率僅為160 萬分之一，低于輸血感染艾滋病毒的概率[12]。約75%的移植物感染發(fā)生在同種異體移植后4 個月內(nèi)[11]。Wu 等[10]發(fā)現(xiàn)同種異體移植物的陽性培養(yǎng)結(jié)果與隨后的手術(shù)部位感染無關(guān)，術(shù)中對移植物的培養(yǎng)是多余的，并不能預(yù)測術(shù)后感染的發(fā)生[13]。脛骨骨干重建感染風(fēng)險高的重要原因之一為軟組織覆蓋有限，肌瓣移植有助于降低風(fēng)險，骨皮質(zhì)切除程度也與感染率密切相關(guān)，原因可歸于廣泛軟組織切除和手術(shù)時間延長[14]。Aponte-Tinao 等[8]回顧了60 例同種異體骨移植術(shù)后發(fā)生的感染病例，其中僅有18%的患者通過抗生素和清創(chuàng)治愈，82%的患者進行了翻修手術(shù)，移除了同種異體移植物，并置入帶抗生素的骨水泥填充物（成功率68%），感染控制后再植入同種異體骨、假體，或進行截肢，這些病人二次移植失敗率較高（34%）。

臨床應(yīng)用最廣泛的滅菌劑為環(huán)氧乙烷，其通過對微生物的蛋白質(zhì)、DNA、RNA 產(chǎn)生烷基化作用，主要優(yōu)點為殺菌譜廣，殺菌力強，毒副作用低，但其無法穿透骨皮質(zhì)[12]。其他化學(xué)處理如過乙酸-乙醇等同樣缺乏對深層的完全滲透[6]，鹽酸和二甲基亞砜則對一些逆轉(zhuǎn)錄病毒無效[12]。而放射滅菌作用原理主要為射線激發(fā)的電子使DNA 分子鍵斷裂或引起細胞內(nèi)水的解離，但需控制放射劑量來防止骨組織強度的下降。熱力滅菌也是醫(yī)學(xué)常用的滅菌手段之一，F(xiàn)olsch 等[15]研究了加熱對松質(zhì)骨拔出強度的影響，發(fā)現(xiàn)松質(zhì)骨的熱消毒可以保持臨床所需的拉伸強度。目前這種方法較少應(yīng)用于同種異體骨。臨床上應(yīng)注重產(chǎn)品的滅菌、加強術(shù)中的無菌操作及受體易感因素的管控。經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮Y選和制備程序，同種異體骨傳播疾病風(fēng)險可降到最低。

2.2 無菌性骨不連、再骨折 骨不連，是指術(shù)后6 個月，同種異體移植骨和宿主骨接口處沒有任何骨橋性骨小梁組織通過。再骨折，是指術(shù)后同種異體骨移植區(qū)新出現(xiàn)不連續(xù)或斷裂，這些并發(fā)癥一般發(fā)生在術(shù)后3 年內(nèi)。Delloye 等[5]在同種異體骨關(guān)節(jié)翻修、骨腫瘤術(shù)后骨移植病例回顧性分析中發(fā)現(xiàn)，骨不愈合是最常見的并發(fā)癥（35%），移植物骨折是第二常見的并發(fā)癥（16.4%）。Gharedaghi 等[9]統(tǒng)計了113 例接受了大段骨腫瘤切除和同種異體骨移植的患者（多數(shù)患者為接受放療、化療后），其中5.9%的患者出現(xiàn)移植骨骨折，5.9%的患者出現(xiàn)骨不愈合。

引起無菌性骨不連的主要因素包括粉碎性骨折、骨缺損程度大、周圍軟組織血運狀況差。局部力學(xué)穩(wěn)定性是骨不連主要因素，而不是免疫反應(yīng)[15-16]?？傮w來說大段同種異體骨的不愈合率和骨折率大于其他形式的同種異體骨植骨。在大段骨移植中，影響骨愈合最重要的變量是重建方式，相比整段關(guān)節(jié)移植及結(jié)合金屬固定物移植等方式，單純同種異體骨作為骨間橋接的方式具有最高的骨不連率（優(yōu)勢比為12.26～8.77）[5]。大段同種異體骨結(jié)合鋼板比結(jié)合髓內(nèi)釘更容易發(fā)生骨折[17]。結(jié)構(gòu)性異體骨的生物力學(xué)性能極為重要，而各種加工方法均可不同程度影響移植骨強度、彈性模量、最大應(yīng)力、最大吸收能量等承載能力的量度指標(biāo)，加之病人過早負重及內(nèi)固定不夠堅強，引起再骨折。新鮮人骨皮質(zhì)的強度和凍融人骨皮質(zhì)并無明顯差異，但凍干處理可使骨發(fā)生縱向微細骨折，增加移植骨的脆性，對移植力學(xué)性能產(chǎn)生顯著影響。凍干骨移植前的再水化可以恢復(fù)其部分性能[18]。其次，對異體骨進行大劑量γ 射線可以破壞骨膠原分子間的交連[19]，當(dāng)γ 射線照射劑量達到50J/g 時，冷凍、凍干皮質(zhì)骨的抗壓強度和硬度均有明顯降低，否則無明顯影響[20]。經(jīng)過消毒滅菌、消除抗原處理的同種異體骨幾乎不存在細胞，骨誘導(dǎo)及骨生成性能明顯降低，植骨后遺留部分未轉(zhuǎn)變的移植骨，以及后期因此發(fā)生的過度吸收，均可造成愈合時間延長和再骨折。另外，同種異體骨的血管重建是愈合過程的重要部分，血管化不良也是同種異體骨移植后骨折、不愈合的主要原因之一[21]。血管重建的過程受到手術(shù)時間的延長、軟組織損傷以及大量的肌肉或腫瘤的切除等因素的影響。

雖然最新的研究已經(jīng)提出了很多預(yù)防同種異體骨骨不連、再骨折并加快愈合的思路，但大多有待進一步完善和推廣。Aronin 等[20]設(shè)計的一種新的連續(xù)聚合物（FTY720，一種選擇性鞘氨醇1-磷酸受體激動劑）涂層系統(tǒng)，被證明顯著提高了同種異體骨移植后的機械穩(wěn)定性，并減少因局部疲勞引起的骨折，其機制包含減少破骨細胞對移植骨的過度吸收和誘導(dǎo)微血管重塑等。而Das 等[21]發(fā)現(xiàn)其能通過局部免疫調(diào)節(jié)改善血管生成-成骨偶聯(lián)，從而改善移植物血管形成，加速骨組織的形成，以及增強與宿主組織的相容性。姬傳磊等[22]使用同種異體骨與帶血管自體腓骨嵌套式復(fù)合骨并填充β-磷酸三鈣，在動物實驗中取得良好效果，為增加大段同種異體骨機械穩(wěn)定性與加快愈合過程提供了一種新思路。Vadalà 等[23]的前瞻性試驗表明骨髓細胞濃縮物和富含血小板的血漿有助于增加同種異體骨移植的愈合率，其中骨髓基質(zhì)細胞起到主要作用。Fernandes 等[24]的動物實驗也證明骨髓基質(zhì)細胞細胞化的同種異體骨，更有利于強度鞏固、再塑形、及在結(jié)構(gòu)和形態(tài)上重建骨和骨髓。笪虎等[25]在動物實驗中，用多聚賴氨酸表面改性后的同種異體骨，通過促進細胞貼附及增長，顯著提升了其對兔骨髓間充質(zhì)干細胞的親和性。

DBM 因其保留I 型膠原蛋白、非膠原蛋白和骨誘導(dǎo)生長因子，具有骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)特性，其施加外源性血管內(nèi)皮生長因子后，可顯著加快異體脫鈣骨血管重建，加快骨活化[26]。其在脫細胞凍干骨等提供載體支架后可體現(xiàn)不同程度的機械穩(wěn)定性。

手術(shù)干預(yù)仍然是骨不連和再骨折的主要措施。牛曉輝等[27]對不愈合接觸端通過植自體髂骨移植，均能良好愈合，而進行帶血管蒂骨移植的接觸端，愈合時間明顯更短。對不愈合的四肢骨腫瘤重建患者，則更傾向于自體骨植骨移植。Hu 等[28]的兔模型實驗，通過檢測實驗對象的多項指標(biāo)，表明負壓封閉引流促進兔骨移植血管形成，其中成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）的增加可能是發(fā)生這種情況的機制之一。需要指出的是，清理不愈合的接觸端，包括瘢痕和部分移植骨，但不損傷周圍組織血供，是翻修術(shù)的重點。必要時使用帶血管蒂的自體骨移植，可明顯縮短愈合時間，對接觸端進行加壓固定也是有意義的。

2.3 過度吸收 理想的同種異體骨移植物愈合過程，涉及新宿主骨對壞死移植物的包裹，其中包含由造血細胞和成骨細胞組成的重塑單元。通過破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收以及骨形成，進行爬行替代。于國勝等[29]對同種異體骨在椎體內(nèi)植骨的病例進行了回顧，發(fā)現(xiàn)椎體內(nèi)植骨量越大，后期形成空洞的可能性就越大。研究者歸其主要原因為植骨量過大，而骨折處血循破壞導(dǎo)致爬行替代能力不足；次要原因為異體骨骨誘導(dǎo)能力不足和免疫反應(yīng)。臨床上常常將這類情況歸類為萎縮型骨不連。同種異體骨移植后骨吸收發(fā)生率為10.78%[9]。由于存在骨缺損，再次植骨是基本治療。骨吸收缺損較大時，自體、同種骨混合植骨可能是合適的選擇。

二膦酸鹽及焦磷酸的合成類似物在抑制移植骨吸收上有較大的應(yīng)用前景。二膦酸鹽與骨礦物具有較強的親和力，吸收后可誘導(dǎo)破骨細胞凋亡。通過添加破骨細胞抑制劑-二膦酸鹽，可以在藥理學(xué)上調(diào)節(jié)使用BMP 引起的過量骨吸收，而不減少骨形成[30-31]。Seo 等[32]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，用唑來膦酸鹽溶液進行同種異體骨移植的藥理修飾，可以降低破骨細胞介導(dǎo)的同種異體骨移植的吸收。

2.4 免疫排斥反應(yīng) 免疫排斥是指移植接受者的免疫系統(tǒng)識別移植物抗原，對后者進行免疫攻擊。植入物發(fā)生免疫反應(yīng)意味著細胞不容易貼附及周圍組織長入，不利于植入物周圍血管的生長，從而減慢異體骨植入后早期的爬行替代過程，延緩移植骨與宿主骨愈合。骨愈合不良、大量吸收、感染等都與同種異體移植物的免疫反應(yīng)相關(guān)。同種異體骨移植入宿主后引起的免疫排斥反應(yīng)是以活性淋巴細胞和細胞毒性抗體的產(chǎn)生為特征，主要通過T 淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫。深度冷凍、冷凍干燥等物理方法，主要使同種異體骨細胞表面的蛋白質(zhì)失活，從而達到消除或減弱抗原性的目的。

Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）的表達也與免疫排斥相關(guān)。其中Toll 樣受體4（Toll-like receptors4，TLR4）與多種急性免疫排斥有關(guān)，髓樣分化因子（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）則是TRL 信號通路的重要下游分子。Hsieh 等[33]的動物模型實驗顯示，TLR4 和MyD88 的表達在同種異體骨移植的小鼠中上升，而TLR4 短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）和MyD88 shRNA 則有效抑制了TLR4 和MyD88 表達，表明局部抑制TLR4 和MyD88 可能會降低免疫反應(yīng)并改善同種異體骨的排斥反應(yīng)。

良好的加工技術(shù)可以使同種異體骨的免疫反應(yīng)達到最小化。其中，凍干同種異體骨移植所引發(fā)的免疫反應(yīng)為程度較輕、范圍局限的慢性免疫排斥反應(yīng)，對全身的影響較小，對移植骨的愈合沒有明顯影響。嚴重的同種異體骨免疫反應(yīng)則來源于新鮮冷凍同種異體骨的骨膜細胞和骨髓，以及大段關(guān)節(jié)移植時保留的韌帶、肌腱等組織。傳統(tǒng)的同種異體骨加工方法尚無法同時做到保留骨生成能力、骨誘導(dǎo)性和肌腱、韌帶等組織活力的同時消除免疫原性。但最新的研究也證明很多加工方法的有效性，能在保留同種異體肌腱、韌帶等組織活性的同時降低免疫原性。

環(huán)孢菌素在抑制器官移植免疫反應(yīng)中起重要作用。張大偉等[34-35]的兔子模型實驗表明，復(fù)合環(huán)孢菌素同種異體骨愈合速度優(yōu)于凍干骨，其引發(fā)的免疫反應(yīng)也較弱。FTY720 也可能通過調(diào)控局部免疫反應(yīng)和異物反應(yīng)的機制促進同種異體移植愈合。

免疫排斥相對難以預(yù)防，目前也少有針對性的治療方法，除了環(huán)孢素等應(yīng)用于非腫瘤患者，大多數(shù)大段移植的腫瘤患者并不推薦使用免疫抑制劑。如采取早期引流，維持換藥的方法治療，平均換藥時間可達18 日[36]。采用負壓引流術(shù)則減少換藥次數(shù)，縮短傷口愈合時間，降低感染發(fā)生率[37]。

3 小 結(jié)

同種異體骨移植后仍有較多的并發(fā)癥發(fā)生，影響了療效。發(fā)生免疫排斥反應(yīng)、骨不愈合、骨吸收等并發(fā)癥的機制，在分子生物學(xué)、免疫學(xué)層面上仍有較多不明確的區(qū)域，值得我們進一步開展基礎(chǔ)研究。臨床工作中，應(yīng)嚴格選擇同種異體骨移植的種類、移植方法及其適應(yīng)證，盡量預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生。對并發(fā)癥的傳統(tǒng)處理措施，如沖洗引流、適當(dāng)抗生素和抗排異藥物的應(yīng)用、重新自體骨和同種異體骨復(fù)合植骨、重新內(nèi)固定、局部傷口換藥等，均有不同程度的療效。積極預(yù)防和妥善處理人工骨移植術(shù)后并發(fā)癥，患者的遠期預(yù)后仍可以得到較大的改善。