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    1株木質(zhì)素降解菌的篩選、鑒定及液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

    2021-12-27 04:22:58李雅琳李素艷孫向陽蔡琳琳常曉彤
    關(guān)鍵詞:苯胺藍過氧化物氮源

    李雅琳,李素艷,孫向陽,郝 丹,蔡琳琳,常曉彤

    (北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,北京 100083)

    園林綠化廢棄物包括樹木、花草等植物在生長過程中的自然凋落物或者人為修剪的植物殘體[1],主要成分有木質(zhì)素、纖維素和多糖等[2]。其中,木質(zhì)素由于組分種類多樣,結(jié)構(gòu)復(fù)雜且無規(guī)則,降解比較困難[3-5]。堆肥是一種較好的降解園林綠化廢棄物的方式[6],堆肥過程中多個微生物群體共同作用,分泌木質(zhì)素降解相關(guān)酶系而使園林綠化廢棄物中的木質(zhì)素降解[7]。因此,通過研制微生物菌劑,使分泌木質(zhì)素降解酶酶系的菌株迅速構(gòu)建優(yōu)勢群落,能有針對性地加快園林綠化廢棄物中木質(zhì)素的降解,提高堆肥效率和質(zhì)量[8-9]。但是,新菌劑的制備需要在選定目標(biāo)菌株的條件下,對菌劑制作涉及的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進行優(yōu)化。優(yōu)化過程主要包括試驗設(shè)計、數(shù)學(xué)建模和優(yōu)化設(shè)計3個部分[10]。合理的試驗設(shè)計能用較少的試驗數(shù)據(jù)進行建模,從而獲取各因素范圍內(nèi)的最優(yōu)解。用于發(fā)酵條件優(yōu)化的方法多為響應(yīng)面法[11-12],但胡欣穎等[13]研究發(fā)現(xiàn):人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法比響應(yīng)面法在預(yù)測實驗結(jié)果方面更準(zhǔn)確,誤差更小。目前,運用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對木質(zhì)素降解菌發(fā)酵條件進行優(yōu)化的研究鮮有報道。因此,本研究擬從北京市植物園的腐葉土和朽木中篩選木質(zhì)素降解菌,對其進行鑒定,并通過單因素試驗對菌株的培養(yǎng)時間、接種量和培養(yǎng)基配方(碳源和氮源)進行優(yōu)化;采用均勻試驗結(jié)合Python實現(xiàn)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模與優(yōu)化,尋找菌株最佳發(fā)酵條件,為園林綠化廢棄物中木質(zhì)素的降解提供高效菌劑。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    腐葉土和朽木采集于北京市植物園。PDA培養(yǎng)基:稱取200.00 g土豆,去皮去芽切成小塊后加蒸餾水微沸30 min,保留濾液并用蒸餾水補足1 L,制成馬鈴薯浸汁;葡萄糖 20.00 g,蛋白胨15.00 g,瓊脂20.00 g,pH自然[14]。PDA-苯胺藍培養(yǎng)基:稱取0.10 g苯胺藍溶于1 L PDA培養(yǎng)基中,pH自然。PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基:量取0.1 mL愈創(chuàng)木酚溶于1 L PDA培養(yǎng)基中,pH自然。PDB液體培養(yǎng)基:馬鈴薯浸汁(同PDA培養(yǎng)基),葡萄糖 20.00 g,蛋白胨15.00 g,pH自然?;景l(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10.00 g·L-1、蛋白胨 5.00 g·L-1,酵母粉 3.00 g·L-1、酒石酸銨 10.00 g·L-1、五水合硫酸銅 0.25 g·L-1、氯化鈉 1.00 g·L-1、pH自然[15]。所有培養(yǎng)基均121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

    1.2 方法

    1.2.1 菌株的分離與篩選 將采集的樣品搗碎[16],稱取10.00 g加入裝有90 mL無菌水的三角瓶中,在28 ℃、200 r·min-1下震蕩搖勻后靜置1 h。取上清液1.0 mL稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度(10-3~10-7g·L-1)的溶液,取不同質(zhì)量濃度稀釋液0.1 mL,加入PDA培養(yǎng)基中涂布均勻,28 ℃下培養(yǎng)5~7 d,觀察菌落形態(tài),用平板劃線分離法純化菌株。將得到的純菌株以點接法接到PDA-苯胺藍平板和PDA-愈創(chuàng)木酚平板中,用苯胺藍平板褪色圈法和愈創(chuàng)木酚平板變色圈法確定該菌株是否具有降解木質(zhì)素的能力。

    1.2.2 菌株的鑒定 觀察PDA-苯胺藍平板上菌體形態(tài)特征,并挑取少量菌絲于顯微鏡下拍照記錄。菌株送往北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)測序,測序結(jié)果與Genebank數(shù)據(jù)庫中已知的真菌序列BLAST檢索對比,采用 Mega 5.0 軟件與相近種菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

    1.2.3 種子液的制備 將菌株接種至裝有100.0 mL PDB液體培養(yǎng)基的三角瓶中,在IS-RDD3臺式恒溫振蕩器中以30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)3 d,制得種子液。

    1.2.4 測定指標(biāo) 木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶活性的測定參照田林雙[18]的方法。3種木質(zhì)素降解相關(guān)酶酶活性總和標(biāo)記為總酶活。生物量的測定用稱干質(zhì)量法[19]。

    1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 22.0進行處理。發(fā)酵條件優(yōu)化用單因素方差分析法,平均值多重比較用LSD最小顯著性差異法(P<0.05)。均勻試驗利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[20]建模與優(yōu)化(基于深度學(xué)習(xí)框架Pytorch[21])。將本實驗?zāi)繕?biāo)建模為回歸任務(wù),并采用SmoothL1損失函數(shù)[22]以平滑訓(xùn)練過程。訓(xùn)練過程中,采用k-折交叉驗證(k-fold cross-validation)和自適應(yīng)矩估計(Adam)算法[23]優(yōu)化神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 木質(zhì)素降解菌的篩選

    PDA-苯胺藍平板上褪色圈的出現(xiàn)表示該菌株具有分泌錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶的能力,PDA-愈創(chuàng)木酚平板上顯色圈的出現(xiàn)表示該菌株具有分泌漆酶的能力[24]。由表1可知:篩選得到的22株菌(分別命名為Q01~Q22)中,共有10株菌出現(xiàn)褪色圈或/和顯色圈。其中:Q01、Q02、Q09和Q11既能出現(xiàn)褪色圈又能出現(xiàn)顯色圈,說明這些菌株具備分泌3種木質(zhì)素降解酶的能力。根據(jù)褪色圈和顯色圈的出現(xiàn)時間及直徑可知(表1),Q01于48 h時在PDA-苯胺藍平板上出現(xiàn)褪色圈,12 h時在PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上出現(xiàn)顯色圈,在72 h時顯色圈最大,因此,選定菌株Q01為目標(biāo)菌株。

    表1 不同菌株選擇培養(yǎng)基的顯色和褪色結(jié)果Table 1 Coloring and decoloring results of different strains on selective mediums

    2.2 菌株的鑒定

    2.2.1 菌株 Q01的形態(tài)特征及顯微觀察 菌株Q01在PDA-苯胺藍平板上的菌落形態(tài)為白色圓形,菌絲為致密的短絨狀,向四周擴展,緊貼平板生長(圖1A、圖1B);前期生長較慢,1~2 d有菌絲長出,此后生長較快,3~5 d鋪滿整個平板。顯微形態(tài)可見,菌絲較細長,有分支(圖1C),孢子呈球狀或柱狀(圖1D),菌絲可觀察到隔膜和鎖狀聯(lián)合(圖1E,如箭頭所示)。

    圖1 菌株Q01在選擇培養(yǎng)基中顯色和褪色表現(xiàn)及顯微鏡觀察Figure 1 Color development and fading performance of strain Q01 in selective medium and microscopic observation

    2.2.2 菌株Q01的ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹 構(gòu)建菌株Q01系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)可知:菌株Q01與栓菌屬Trametes真菌的同源性相似度最高,達到100%。結(jié)合形態(tài)特征可確定菌株Q01為栓菌屬真菌。

    圖2 基于ITS 序列構(gòu)建的菌株Q01系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree of strain Q01 constructed based on ITS sequence

    2.3 液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

    2.3.1 培養(yǎng)時間的優(yōu)化 分別在12瓶100 mL基本發(fā)酵培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)為12.5%的菌株Q01種子液,于30 ℃、200 r·min-1下培養(yǎng),每24 h取出1瓶,測量菌株木質(zhì)素降解相關(guān)酶活性和1 mL菌液中生物量的干質(zhì)量。由圖3可知:3種木質(zhì)素降解相關(guān)酶的酶活性達到最高值時間不同,其中漆酶活性在培養(yǎng)5 d時達最高(3 835.25×16.67 nkat·L-1),錳過氧化物酶活性在培養(yǎng)2 d時達最高(1 690.60×16.67 nkat·L-1),木質(zhì)素過氧化物酶活性在培養(yǎng)8 d時達到最高(1 096.88×16.67 nkat·L-1)。3種木質(zhì)素降解相關(guān)酶在木質(zhì)素降解中具有同樣重要的作用[25],但不同木質(zhì)素降解酶活性最高值時間不同,因此以3種木質(zhì)素降解相關(guān)酶的總酶活性作為確定培養(yǎng)時間的依據(jù)。隨著木質(zhì)素降解,真菌生物量逐漸增多[26]。圖3可知:菌株Q01的總酶活性與生物量均在培養(yǎng)5 d時最高,因此選擇培養(yǎng)時間為5 d進行后續(xù)研究。

    圖3 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)生木質(zhì)素降解相關(guān)酶及生物量的影響Figure 3 Changes in culture time to the enzymes and biomass related to lignin degradation produced by the strain

    2.3.2 接種量的優(yōu)化 分別在100 mL 基本發(fā)酵培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)為5.0%、7.5%、10.0%、12.5%和15.0%的種子液,于30 ℃、200 r·min-1下培養(yǎng)5 d,測定菌株木質(zhì)素降解相關(guān)酶活性和菌株生物量。由圖4可知:總酶活性在菌液體積分?jǐn)?shù)為12.5%時最高,達到5 129.80×16.67 nkat·L-1。隨菌液體積分?jǐn)?shù)增加,菌株生物量呈先上升后下降趨勢,體積分?jǐn)?shù)為12.5%時達到最高。與繆曉磊[19]對竹林毛栓菌Trametessp. 接種量優(yōu)化的結(jié)果一致。可見菌株的繁殖速度受接種量影響,當(dāng)接種量較少時,菌株需要更多時間適應(yīng)環(huán)境后繁殖生長;而接種量較多時,大量菌株接觸新環(huán)境,迅速繁殖,使液體培養(yǎng)基黏稠不透氣,溶解氧下降,影響菌株的后續(xù)生長[19]。因此,綜合總酶活性和生物量的變化,選取體積分?jǐn)?shù)12.5%為最適接種量。

    圖4 接種量對菌株產(chǎn)生木質(zhì)素降解相關(guān)酶及生物量的影響Figure 4 Changes in the amount of inoculum to produce lignin degradation related enzymes and biomass

    2.3.3 培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化 以基本發(fā)酵培養(yǎng)基為對照,分別用 10.00 g·L-1蔗糖、麥芽糖、木質(zhì)素磺酸鈉和可溶性淀粉替代對照中10.00 g·L-1的葡萄糖,接種體積分?jǐn)?shù)為12.5%,于30 ℃、200 r·min-1下培養(yǎng)5 d。由圖5可知:以葡萄糖為碳源時,菌株Q01漆酶活性達3 675.23×16.67 nkat·L-1,顯著高于其他碳源(P<0.05);認(rèn)為簡單的糖有利于菌體生長[27],可以縮短漆酶的生產(chǎn)時間,與劉宇等[15]結(jié)果相似。但就總酶活性和生物量而言,以木質(zhì)素磺酸鈉為碳源對菌株Q01生長和木質(zhì)素降解相關(guān)酶分泌效果最好,最顯著(P<0.05),其中總酶活性為6 474.16×16.67 nkat·L-1,總生物量為0.065 g??赡茉蚴莵碓从谀举|(zhì)素的木質(zhì)素磺酸鈉能刺激菌株Q01分泌木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶,并促進細胞快速生長,使生物量最高,與熊乙[28]研究結(jié)果相似。綜合考慮各碳源生產(chǎn)成本及對菌株Q01生長的促進效果,選擇木質(zhì)素磺酸鈉為菌株Q01的液體培養(yǎng)基碳源。

    圖5 碳源對菌株產(chǎn)生木質(zhì)素降解相關(guān)酶及生物量的影響Figure 5 Effect of carbon source on lignin degradation related enzymes and biomass produced by the strain

    2.3.4 培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化 以基本發(fā)酵培養(yǎng)基為對照,有效含氮量按1.52 g·L-1進行換算,分別用7.00 g·L-1的豆餅粉、6.50 g·L-1尿素、14.30 g·L-1硫酸銨、11.00 g·L-1硝酸鉀替代對照組中的酒石酸銨,發(fā)酵培養(yǎng)條件為30 ℃、200 r·min-1,培養(yǎng)5 d。由圖6可知:以豆餅粉為有機氮源發(fā)酵時,菌株Q01總酶活性最高、生物量最大,與其他無機氮源差異顯著(P<0.05)。豆餅粉營養(yǎng)豐富,含大量碳水化合物、蛋白質(zhì)及少量異黃酮類物質(zhì)和可溶性多糖,可作為發(fā)酵氮源及生長因子。有研究表明[29]:在培養(yǎng)某些真菌時,培養(yǎng)基中添加豆餅粉有利于生物量的積累。綜合考慮各氮源生產(chǎn)成本及對菌株Q01生長的促進效果,選擇豆餅粉作為菌株Q01的液體培養(yǎng)基氮源。

    圖6 氮源對菌株產(chǎn)生木質(zhì)素降解相關(guān)酶及生物量的影響Figure 6 Effect of nitrogen source on lignin degradation related enzymes produced by the strain and biomass

    2.3.5 均勻試驗結(jié)合Python實現(xiàn)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模與優(yōu)化 均勻試驗設(shè)計6因素5水平的10組試驗,獲取實測值,再通過基于SmoothL1損失函數(shù)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練及自適應(yīng)矩估計(Adam)算法尋優(yōu),得到仿真值。對比實測值和仿真值(表2)可知:3種酶活性誤差均小于10.0%,生物量的仿真值基本與觀察值相同,可知該模型預(yù)測值可信賴。

    表2 均勻試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Uniform test design and results

    2.3.6 優(yōu)化后菌株木質(zhì)素降解相關(guān)酶活性及生物量 根據(jù)模型預(yù)測得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成并進行實驗驗證。由表3可知:優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基酶活性和生物量,實測值與預(yù)測值誤差約為3.0%;結(jié)合圖3可知:優(yōu)化前錳過氧化物酶活性為357.29×16.67 nkat·L-1、木質(zhì)素過氧化物酶活性為445.27×16.67 nkat·L-1、總酶活性為4 637.81×16.67 nkat·L-1、生物量為0.071 g;即在優(yōu)化培養(yǎng)基上生長的菌株Q01,其生物量比優(yōu)化前提高1.27倍,錳過氧化物酶活性提高31.71倍,木質(zhì)素過氧化物酶活性提高19.12倍,總木質(zhì)素酶酶活性提高4.38倍。

    表3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)尋優(yōu)結(jié)果Table 3 Optimization results of artificial neural network

    3 結(jié)論

    通過苯胺藍平板褪色圈法和愈創(chuàng)木酚平板變色圈法篩選出目標(biāo)菌株Q01。經(jīng)鑒定,菌株Q01為栓菌屬Trametes真菌。實驗證明人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測結(jié)果可值得信賴。根據(jù)單因素試驗和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法結(jié)果,確定菌株Q01的最優(yōu)發(fā)酵條件:培養(yǎng)時間5 d,溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速200 r·min-1,接種菌液體積分?jǐn)?shù)為12.5%,培養(yǎng)基配方為木質(zhì)素磺酸鈉14.00 g·L-1、蛋白胨12.30 g·L-1、酵母粉5.00 g·L-1、豆餅粉3.00 g·L-1、五水合硫酸銅 0.12 g·L-1、氯化鈉 0.53 g·L-1、pH 自然。

    菌株Q01在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下制得的液體菌劑具有高酶活性和高生物量的特點,可促進園林綠化廢棄物堆體初始微生物的數(shù)量增長,提高木質(zhì)素降解相關(guān)酶的酶活性,加快木質(zhì)素的降解。

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