3株釀酒酵母發(fā)酵過程中游離氨基酸含量變化分析

裴芳藝 薛迪 馬巖石 劉宇超 劉得水 李慧 劉韓

摘要：為了進一步研究釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）游離氨基酸豐富的生物學功能，以適應對新型S. cerevisiae食品資源的開發(fā)應用。本研究以3株S. cerevisiae為出發(fā)菌株，利用全自動氨基酸分析儀對S. cerevisiae發(fā)酵過程中游離氨基酸的組成及含量進行了測定與分析。結果表明：3株S. cerevisiae發(fā)酵液中均含有17種游離氨基酸，但游離氨基酸組成和含量存在明顯差異。發(fā)酵末期，S. cerevisiae P1發(fā)酵液中的游離氨基酸總量最高，而S. cerevisiae 32788發(fā)酵液中必需氨基酸含量最高。S. cerevisiae 1946發(fā)酵體系中，游離氨基酸的含量先增加后減少，在發(fā)酵末期，游離氨基酸總量和必需氨基酸含量均低于另外2種S. cerevisiae。本研究結果為S. cerevisiae的營養(yǎng)價值評價以及為S. cerevisiae功能食品的研究提供一定的科學依據。

關鍵詞：釀酒酵母；發(fā)酵培養(yǎng)；游離氨基酸；必需氨基酸；含量

中圖分類號：S182文獻標志碼：A論文編號：cjas20191200319

Free Amino Acids in 3 Saccharomyces cerevisiae During Fermentation Culture： Content Analysis

Pei Fangyi， Xue Di， Ma Yanshi， Liu Yuchao， Liu Deshui， Li Hui， Liu Han

（Qiqihar Medical University， Qiqihar 161000， Heilongjiang， China）

Abstract： To further study the biological function of free amino acids of Saccharomyces cerevisiae and adapt to the development and application of new S. cerevisiae food resources， the composition and contents of free amino acids produced by three S. cerevisiae were analyzed with a fully automated amino acid analyzer. The results showed that， 17 kinds of free amino acids were found in the three S. cerevisiae fermentation broths， but there were significant differences in the composition and content of free amino acids. At the end of the fermentation， the total amount of free amino acids in the S. cerevisiae P1 fermentation broth was the highest. The S. cerevisiae 32788 fermentation broth had the highest essential amino acid content. The content of free amino acid increased first and then decreased with the fermentation time in the S. cerevisiae 1946. At the end of fermentation， the total amount of free amino acids and essential amino acids were lower than the other two S. cerevisiae. This study provides a basis for nutritional value evaluation of S. cerevisia and further study on S. cerevisia functional foods.

Keywords： Saccharomyces cerevisiae； Fermentation Culture； Free Amino Acids； Essential Amino Acid； Content

0引言

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種單細胞生物，安全無致病性，培養(yǎng)條件簡單[1]，能夠在基本培養(yǎng)基上生長，且生長繁殖迅速，代謝旺盛，碳源消耗速率快，能夠耐受較低的pH環(huán)境[2]，可以在嚴格的厭氧條件和較低的pH環(huán)境下生長[3]，同時，它對底物和產物耐受性較強，對環(huán)境壓力抗性較高，不易受到細菌等雜菌的污染[4]。作為傳統和現代生物技術領域非常重要的工業(yè)微生物，S. cerevisiae在醫(yī)藥、精細化工、生物能源、工業(yè)酶制劑、飼料添加劑以及發(fā)酵食品等生物質產品的生產中得到廣泛應用[5-6]。

氨基酸是人類醫(yī)藥、保健品和多種動物飼料添加劑的重要原料，在新陳代謝、生長以及風味形成上具有重要作用[7]。此外，在動植物中氨基酸還可作為信號分子，參與細胞的繁殖、凋亡及信號傳導等[8-10]。酵母發(fā)酵過程中主要可同化的含氮物為游離氨基酸（free amino acid， FAA），它在酵母菌的生長、碳源消耗和防止發(fā)酵停滯等方面起著重要作用[11]，它不僅是合成風味化合物的重要前體物，也作為酵母菌的重要氮源物質，發(fā)揮著重要的生物學功能[12]。FAA在臨床醫(yī)療和藥用上也超過蛋白質氨基酸[13]，具有重要的生物功效和藥用價值。有部分氨基酸在動物體內不能合成或合成速度遠不能達到機體的需要，必需由食物蛋白供給，這些氨基酸稱為必需氨基酸，但微生物和植物能在體內合成所有的氨基酸[14-15]。因此，探究S. cerevisiae發(fā)酵過程中的游離氨基酸種類和含量變化，對利用S. cerevisiae作為食品添加劑和飼料補充劑具有重要的意義。

目前主要采用光譜法、液相色譜法和全自動氨基酸分析儀進行氨基酸含量檢測[16]，相對于液相色譜檢測法來說，采用全自動氨基酸分析儀檢測氨基酸含量不僅具有較高的靈敏度，而且具有較低的檢出限和較好的重現性[17]。因此，本研究對3株不同的S. cerevisiae發(fā)酵液進行酸處理，利用全自動氨基酸分析儀測定菌株發(fā)酵過程中游離氨基酸種類和含量的變化，為S. cerevisiae食品的制備與開發(fā)奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株S.cerevisiae P1：自行分離鑒定；S. cerevisiae 32788（CICC 32788）、S.cerevisiae 1946（CICC 1946）：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

1.1.2試劑氨基酸分析試劑BUFFER A-1、BUFFER B-1、鈉鉀緩沖液、再生液D、還原劑、茚三酮、樣品稀釋液、混合酸分析標樣：分析純，賽卡姆（北京）科學儀器有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基YPD液體培養(yǎng)基（HB5193-1）、YPD固體培養(yǎng)基（HB5193）均購自青島海博生物技術有限公司。

單碳源發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，葡萄糖80 g，KH2PO4 2.5 g，（NH4）2SO4 2.5 g，CaCl2 0.25 g，MgSO4· 7H2O 0.25 g，pH 5.0，用于S. cerevisiae發(fā)酵培養(yǎng)。

1.1.4主要儀器設備S-433D型全自動氨基酸分析儀，德國SYKAM（賽卡姆）公司；V-5000型可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；FE28型pH計：梅特勒-托利多集團。

1.2方法

1.2.1菌株活化將菌株S. cerevisiae P1、32788和1946分別三區(qū)劃線于YPD固體培養(yǎng)基上，30℃、倒置培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，制備種子液。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)以5% （v/v）的接種量將種子液接種于單碳源發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)60 h，每隔6 h取樣，測定發(fā)酵液的pH及OD600值。

1.2.3氨基酸的測定氨基酸測定方法依據GB/T 5009.124—2016。

2結果

2.1 S. cerevisiae生長變化

3株S. cerevisiae發(fā)酵過程OD600值變化如圖1所示，隨著發(fā)酵的進行，OD600值先急速增加后保持平穩(wěn)，其中S. cerevisiae 32788生長速度較為緩慢。在發(fā)酵0～18 h期間，S. cerevisiae P1的生長速度顯著高于S. cerevisiae 1946和S. cerevisiae 32788 （P<0.05）。在發(fā)酵24 h時，3株S. cerevisiae的OD600值分別為1.158±0.001 （S. cerevisiae P1）、1.237±0.002 （S. cerevisiae 1946）和0.585±0.002 （S. cerevisiae 32788），之后，3株S. cerevisiae的生長趨于穩(wěn)定。相同的培養(yǎng)條件下，在發(fā)酵初期，S. cerevisiae P1生長迅速，在發(fā)酵末期，S. cerevisiae P1與S. cerevisiae 1946的OD600值無顯著差異（P>0.05），但均顯著高于S. cerevisiae 32788（P< 0.05）。

2.2 S. cerevisiae發(fā)酵過程中pH變化

3種S. cerevisiae發(fā)酵過程pH變化如圖2所示，隨著發(fā)酵時間的延長，pH呈現先急速下降后保持穩(wěn)定的趨勢。在發(fā)酵18 h時，3株S. cerevisiae的酸堿度分別為pH 3.23±0.03 （S. cerevisiae P1）、pH 3.25±0.01（S. cerevisiae 1946）和pH 3.16±0.02 （S. cerevisiae 32788），彼此之間無顯著差異（P>0.05）。雖然3株S. cerevisiae的生長狀態(tài)存在差異，但有機酸的產生速度和含量相似。由此可見，S. cerevisiae 32788在低生長狀態(tài)下依然能夠產生大量的有機酸，促使發(fā)酵體系正常進行。

2.3 S. cerevisiae發(fā)酵過程中游離氨基酸變化

圖3為3株S. cerevisiae發(fā)酵60 h時氨基酸分析色譜圖，每個樣品均檢測到17種氨基酸的高度峰，可以看出氨基酸峰分離效果良好。3株S. cerevisiae發(fā)酵過程游離氨基酸含量變化如圖4所示，隨著發(fā)酵時間的延長，S. cerevisiae P1和S. cerevisiae 32788游離氨基酸含量呈現先升高后保持穩(wěn)定的趨勢，在發(fā)酵24 h時，游離氨基酸含量分別為4.52±0.12mg/L和4.37±0.24mg/L，之后趨于穩(wěn)定。S. cerevisiae 1946中游離氨基酸含量則呈現先升高后降低的趨勢，在發(fā)酵18 h時，達到最高值，為5.79±0.17 mg/L，在發(fā)酵末期為4.13±0.16 mg/L，顯著低于另外兩株S. cerevisiae （P<0.05）。

2.4 S. cerevisiae發(fā)酵末期游離氨基酸含量

發(fā)酵60 h時，3株S. cerevisiae中17種游離氨基酸含量如表1所示，在S. cerevisiae 1946中，除丙氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸的含量稍高于其余2種S. cerevisiae外，其余14種游離氨基酸的含量均低于其余2種S. cerevisiae。對比S. cerevisiae P1和S. cerevisiae 32788，發(fā)現在S. cerevisiae P1中，除了酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和脯氨酸外，其余12種游離氨基酸的含量均低于S. cerevisiae 32788。3株S. cerevisiae發(fā)酵液中含有8種人體所需的必需氨基酸，其含量從高到低依次為S. cerevisiae 32788 （1.73186 mg/L）、S. cerevisiae P1 （1.70335 mg/L）、S. cerevisiae 1946（1.52058 mg/L）。雖然S. cerevisiae P1中，17種游離氨基酸的總量最高，但8種必須氨基酸的含量要少于S. cerevisiae 32788。

3討論

本研究對3株S. cerevisiae發(fā)酵過程中OD600、pH以及游離氨基酸進行監(jiān)控和分析。然而關于S. cerevisiae發(fā)酵過程中的氨基酸分析報道較少。S. cerevisiae與S. cerevisiae ZLYRHZ7的生長趨勢相一致[18]。S. cerevisiae P1能夠很快適應生長環(huán)境，而S. cerevisiae 32788在此環(huán)境下生長緩慢。在相同的發(fā)酵條件下，S. cerevisiae 1946中游離氨基酸含量變化較大，可能是發(fā)酵過程中消耗了氨基酸[19]。雖然S. cerevisiae P1的生長狀態(tài)好于S. cerevisiae 32788，但在游離氨基酸含量上無顯著差異，說明游離氨基酸含量與生長狀態(tài)無相關性。無論是在哪種S. cerevisiae發(fā)酵液中，谷氨酸的含量最高，其次為天冬氨酸和甘氨酸，最少的為蛋氨酸。研究表明，酸水解處理能夠迫害樣品中的蛋氨酸，降低其含量[20]。作為營養(yǎng)價值評價指標，氨基酸不僅提供能量，還能調節(jié)血糖、促進機體正常生長、修復組織，影響人體的健康[21-22]。還參與風味物質的合成，自身也具有呈味作用，其中賴氨酸帶來鮮味，蘇氨酸帶來甜味，苯丙氨酸帶來芳香味，其余5種必須氨基酸均呈現苦味[23- 24]。因此可以看出，S. cerevisiae 32788能夠產生較高含量的必需氨基酸。

4結論

隨著發(fā)酵時間的進行，3株S. cerevisiae發(fā)酵液的 pH不斷下降最終保持穩(wěn)定，OD600則不斷增加后保持平穩(wěn)。在S. cerevisiae P1和S. cerevisiae 32788發(fā)酵體系中游離氨基酸含量呈現先升高后保持穩(wěn)定的趨勢，而S. cerevisiae 1946中游離氨基酸含量則呈現先升高后降低的趨勢。發(fā)酵末期，S. cerevisiae P1中17種游離氨基酸的總量最高，S. cerevisiae 32788中8種必須氨基酸的含量最高。S. cerevisiae發(fā)酵過程中的游離氨基酸的研究和分析對功能性食品的開發(fā)和應用提供了一類新的生物資源，具有一定的新穎性。

參考文獻

[1]劉擎，余龍.酵母：一種模式生物[J].生命的化學，2000（2）：61-65.

[2]汪兆峰，石貴陽，張梁.釀酒酵母產D-乳酸重組菌的構建與發(fā)酵[J].生物加工過程，2015，13（6）：6-12.

[3]紀曉俊，朱建國，高振，等.微生物發(fā)酵法生產2，3-丁二醇的研究進展[J].現代化工，2006，26（8）：23-27.

[4]姜旭.基因工程菌發(fā)酵生產L-乳酸研究進展[J].生物工程學報， 2013，29（10）：1398-1410.

[5]Xie W P， Liu M， Lv X M， et al. Construction of a controllable betacarotene biosynthetic pathway by decentralized assembly strategy in Saccharomyces cerevisiae[J]. Biotechnol Bioeng， 2014，111（1）： 125-133.

[6]Grotkj？r T， Christakopoulos P， Nielsen J， et al. Comparative metabolic network analysis of two xylose fermenting recombinant Saccharomysescerevisiae strains[J]. Metab Eng， 2005，7（5）：437-444.

[7]沈月，韓海林，陸若輝.沼肥中游離氨基酸含量分析[J].浙江農業(yè)科學，2018，59（5）：185-189.

[8]Benstein R M， Ludewig K， Wulfert S， et al. Arabidopsis phosphoglycerate dehydrogenase1 of the phosphoserine pathway Is essential for development and required for ammonium assimilation and tryptophan biosynthesis[J]. The Plant Cell， 2013， 25（12）：5011-5929.

[9]Locasale J W. Serine， glycine and one- carbon units： cancer metabolism in full circle[J]. Nat Rev Cancer， 2013，13（8）：572-583.

[10]Possemato R， Marks K M， Shaul Y D， et al. Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer[J]. Nature， 2011，476（7360）：346.

[11]Procopio S， krause D， Hofmann T， et al. Significant amino acids in aroma compound profiling during yeast fermentation analyzed by PLS regression[J]. LWT， 2013，51（2）：423-432.

[12]劉茜，吳祖芳，翁佩芳，等.酵母菌混合培養(yǎng)氨基酸代謝差異性及對菌株生長的影響[J].中國食品學報，2018（6）：76-82.

[13]徐軍，汪家春，李兆蘭，等.3種蟲生真菌菌絲的游離氨基酸分析[J].中國釀造，2018，37（5）：189-192.

[14]王彬，蔡永強，鄭偉.火龍果果實氨基酸含量及組成分析[J].中國農學通報，2009，25（8）：210-214.

[15]韓加敏，陳夢迪，董霞，等.云南維西縣百花蜜17種游離氨基酸的測定[J].中國蜂業(yè)，2018，69（8）：69-72.

[16]牛之瑞，馮雷，魯燕驊，等.蜂蜜中17種水解氨基酸的測定[J].食品安全質量檢測學報，2016，7（10）：4033-4037.

[17]黃永連，黃柳霞，陳曉嘉.氨基酸自動分析儀測定不同藻類的氨基酸組成[J].現代食品，2016，11（41）：100-104.

[18]杜仁鵬，趙丹，宋剛，等.高產乙醇酵母菌株的篩選及產醇發(fā)酵條件研究[J].黑龍江大學自然科學學報，2017，34（5）：575-583.

[19]蔣成，付云云，楊云潔，等.不同酵母對無花果酒高級醇、氨基酸的影響研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2018，4（11）：147-153.

[20]李煜，鄭德勇，吳亮亮，等.茶渣中蛋白質和氨基酸分析及其營養(yǎng)價值評價[J].福建茶葉，2015，37（1）：15-19.

[21]楊喆，陳秋生，張強，等.不同品種桑葚與桑葉中氨基酸含量差異研究[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（17）：60-64.

[22]盧偉，陸寧.大麥苗粉中氨基酸組成及含量[J].食品與機械，2018， 34（10）：41-91.

[23]趙鳳敏，李樹君，張小燕，等.不同品種馬鈴薯的氨基酸營養(yǎng)價值評價[J].中國糧油學報，2014，29（9）：13-18.

[24]Zhao D， Du R P， Ge J P， et al. Impact of Lactobacillus paracasei HD1. 7 as a starter culture on characteristics of fermented Chinese cabbage （Brassica Rapa var. Pekinensis）[J]. Food Sci Technol Res， 2016，22（3）：325-330.