藤黃莖皮中莽吉柿素對(duì)人胃癌HGC-27細(xì)胞的作用研究△

常安琪，張?jiān)品?，李軍，付冬君，宋月?/p>

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100020

胃癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人民的健康，2015 年我國(guó)胃癌發(fā)病率和病死率分別為0.029%和0.021%，病死率較高[1-2]。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)中藥具有一定的抗腫瘤作用，并且在中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤方面顯示出增效減毒的作用[3-4]。藤黃是藤黃科藤黃屬植物藤黃樹的樹脂，具有消腫攻毒、祛腐斂瘡之功效，現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為其具有抗腫瘤的功效[5-7]。莽吉柿素來源于藤黃樹的莖皮，研究表明其具有廣泛的抗腫瘤藥理活性，可有效抑制膀胱癌、人膠質(zhì)瘤等疾病[8-9]，并可通過抑制神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)蛋白8活化酶（NAE）復(fù)合物的調(diào)節(jié)亞基活性，從而抑制相關(guān)蛋白的Neddylation 修飾，發(fā)揮抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的作用[10]。Luo 等[9]發(fā)現(xiàn)莽吉柿素處理人膠質(zhì)瘤T98G 細(xì)胞后，其基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9 的分泌和活性被顯著抑制，推測(cè)是由于莽吉柿素對(duì)T98G 細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路的調(diào)控作用所致。目前，莽吉柿素對(duì)于胃癌細(xì)胞的體內(nèi)、外作用效果及機(jī)制尚不完全明確，因此，本研究采用噻唑藍(lán)（MTT）染色法、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Hoechst 染色實(shí)驗(yàn)、蛋白免疫印跡法（Western blot）、裸鼠移植瘤等技術(shù)，探究莽吉柿素對(duì)人胃癌HGC-27 細(xì)胞和人胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響及作用機(jī)制，為莽吉柿素臨床用藥及莽吉柿素抗腫瘤作用機(jī)制的深入研究提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

HGC-27細(xì)胞購于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；雄性BALB/c 裸鼠，4～5 周齡，購自北京維通利華公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)：BUCM-4-2019120304-4109）。

1.2 試藥

莽吉柿素（批號(hào)：PRF10102823，純度≥98%，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；5-氟尿嘧啶（5-FU，批號(hào)：B25419，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；RPMI 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（批號(hào)：10-040-CVR）、青霉素-鏈霉素混合液（批號(hào)：30-002-CI）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA，批號(hào)：25-053-CI）均購于美國(guó)Corning 公司；胎牛血清（FBS，批號(hào)：04-001-1A，以色列BI 公司）；MTT 細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：0793，美國(guó)Amresco公司）；放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液（批號(hào)：G2002）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒（批號(hào)：G2003）、ECL 發(fā)光液（批號(hào)：G2014）、肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號(hào)：GB12001）、Ki67 抗體（批號(hào)：ZM-0166）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔抗體（批號(hào)：GB23303）、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠抗體（批號(hào)：GB23302）、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（批號(hào)：G1507-50T）均購于武漢Servicebio生物公司；磷酸脫氫酶（GAPDH，批號(hào)：60004-1-lg）、β淀粉樣蛋白前體蛋白結(jié)合蛋白1（APPBP1，批號(hào)：14863-1-AP）、泛素結(jié)合酶E2M（UBC12，批號(hào)：14520-1-AP）、Bax（批號(hào)：60267-1-lg）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2，批號(hào)：12789-1-AP）、多聚二磷酸腺苷（ADP）核糖聚合酶1（PARP1，批號(hào)：13371-1-AP）、磷酸化的c-Jun（p-c-JUN，批號(hào)：28891-1-AP）、磷酸化的c-Jun氨基端激酶（p-JNK，批號(hào)：80024-1-RR）抗體均購于美國(guó)Proteintech 公司；泛素樣修飾激活酶3（UBA3，批號(hào)：ab124728）、磷酸化的p38（p-p38，批號(hào)：ab195049）抗體均購于英國(guó)Abcam公司。

1.3 儀器

MCO-18AIC 型細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；DM500 型倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；EnSpire 型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)PerkinElmer 公司）；5424R 型冷凍離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf 公司）；QT-1型渦旋混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；TDL-40B 型低速臺(tái)式大型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；PL4002 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；TDL-40B型水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；XS-500 型高壓蒸汽滅菌器（日本Tomy公司）；DYY-6D 型電泳儀（北京六一儀器廠）；788BR04036型電泳槽及電轉(zhuǎn)槽（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HGC-27 細(xì)胞在RPMI 1640 完全培養(yǎng)基（含10%FBS和1%雙抗體）中于37 ℃、飽和濕度和5%CO2下培養(yǎng)。

2.2 MTT染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒性

培養(yǎng)HGC-27 細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL 的單細(xì)胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后使其完全貼壁，將莽吉柿素母液用完全培養(yǎng)基稀釋成終濃度為2、4、6、8、12 μmol·L-1的工作液，每個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h。將MTT 粉末用磷酸鹽緩沖液（PBS）制備成質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的初始溶液，然后用DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋10 倍，棄去原培養(yǎng)基，96 孔板中每孔添加100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，棄去含MTT的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液150 μL。將96孔板用箔紙包裹，置于搖床上水平搖動(dòng)10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm 處檢測(cè)吸光度（A）值，并依照公式（1）計(jì)算細(xì)胞活力。

2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)考察莽吉柿素對(duì)HGC-27 細(xì)胞克隆形成的影響

將HGC-27 細(xì)胞分為4 組，接種在6 mm 培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿500 個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞接種后24 h，培養(yǎng)基分別替換為0、4、8、12 μmol·L-1的莽吉柿素含藥培養(yǎng)基。藥物處理后9 d 后，將培養(yǎng)的細(xì)胞固定、結(jié)晶紫染色、風(fēng)干并拍照，觀察細(xì)胞集落數(shù)目。

2.4 Hoechst染色觀察細(xì)胞形態(tài)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC-27細(xì)胞接種于6孔板（細(xì)胞密度為50×104個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h，使其完全附著在板上。棄去培養(yǎng)基，用完全培養(yǎng)基配制終濃度分別為0、4、8、12 μmol·L-1的莽吉柿素溶液，加入不同孔中。37 ℃培養(yǎng)箱放置48 h 后，用PBS 洗滌3 次，用4%多聚甲醛固定15 min，并在黑暗中用Hoechst 33258 染色溶液染色30 min，將細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC-27細(xì)胞接種于6孔板（細(xì)胞密度為50×104個(gè)/孔），細(xì)胞貼壁后，加入完全培養(yǎng)基配制的終濃度為0、4、8、12 μmol·L-1的莽吉柿素溶液，培養(yǎng)箱中孵育48 h。棄去細(xì)胞上清液后，用PBS 洗滌3 次，然后用適量的裂解緩沖液裂解，將其收集到1.5 mL 離心管中。在99 ℃下加熱10 min 后，通過SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)樣品。然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，電轉(zhuǎn)完成后，將轉(zhuǎn)好的膜放入含有5%的脫脂奶粉封閉液中，室溫下封閉1.0～1.5 h，加入相關(guān)蛋白的一抗，4 ℃孵育過夜。條帶用1×TBST清洗3次，每次10 min，之后加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫?fù)u床慢搖，孵育2 h。取出PVDF膜，條帶用1×TBST清洗3次，每次10 min。將電化學(xué)發(fā)光（ECL）發(fā)光液均勻地加到剪切的條帶上，室溫避光反應(yīng)1 min、顯影、定影、掃描膠片。使用Photoshop CS6軟件處理結(jié)果圖，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)

2.6.1 模型制備 BALB/c 裸鼠飼養(yǎng)在SPF 級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，給予滅菌飼料和雙蒸水。室溫維持在23～27 ℃，相對(duì)濕度維持在49%～51%，采用12 h循環(huán)照明方式。

將密度為1×107個(gè)/mL 的HGC-27 細(xì)胞懸液在無菌條件下注入BALB/c 裸鼠右前肢的腋窩0.2 mL。整個(gè)移植瘤實(shí)驗(yàn)必須在30 min 內(nèi)完成，以確保良好的細(xì)胞活力。每天觀察注射裸鼠的腫瘤狀態(tài)。接種11 d 后，裸鼠出現(xiàn)圓形或橢圓形的直徑>5 mm 的皮下硬結(jié)節(jié)，表明該模型制備成功。

2.6.2 分組與給藥 裸鼠腫瘤體積達(dá)到100～200 mm3時(shí)，進(jìn)行分組和給藥。裸鼠分為對(duì)照組、5-FU 陽性對(duì)照組和莽吉柿素組，每組各7 只。莽吉柿素給藥組裸鼠按55 mg·kg-1的給藥劑量每天腹膜內(nèi)注射莽吉柿素。對(duì)照組裸鼠每天注射相同體積的空白溶劑（含有5% DMSO 和2.5%聚山梨酯-80 的PBS）。參考相關(guān)文獻(xiàn)，陽性藥物組按30 mg·kg-1每2 d向裸鼠腹膜內(nèi)注射5-FU溶液，連續(xù)給藥24 d[11]。

2.6.3 腫瘤抑制率計(jì)算 給藥后每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，稱量裸鼠體質(zhì)量，以評(píng)估莽吉柿素對(duì)裸鼠體質(zhì)量的影響。用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下移植腫瘤的最大直徑（a）和橫向直徑（b），并詳細(xì)記錄。根據(jù)公式（2）～（3）計(jì)算腫瘤體積（V）和腫瘤抑制率（IR）。

2.6.4 移植腫瘤的組織學(xué)評(píng)估 對(duì)裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中Ki67 蛋白表達(dá)情況。TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 莽吉柿素對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的莽吉柿素作用不同時(shí)間對(duì)HGC-27細(xì)胞活力的影響見表1。結(jié)果表明，莽吉柿素能夠顯著抑制HGC-27 細(xì)胞的增殖并且呈時(shí)間和濃度依賴性，其作用于HGC-27 細(xì)胞24、48、72 h 的半數(shù)抑 制 濃 度（IC50）分別 為（9.74±0.97）、（6.85±0.37）、（4.79±0.07）μmol·L-1。根據(jù)莽吉柿素的IC50結(jié)果，采用4、8、12 μmol·L-1的莽吉柿素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度莽吉柿素作用不同時(shí)間對(duì)HGC-27細(xì)胞活力的影響（,n=3）

表1 不同濃度莽吉柿素作用不同時(shí)間對(duì)HGC-27細(xì)胞活力的影響（,n=3）

結(jié)晶紫染色結(jié)果（圖1）顯示，與對(duì)照組比較，莽吉柿素12 μmol·L-1給藥后HGC-27 細(xì)胞集落數(shù)目明顯減少，莽吉柿素能夠明顯抑制HGC-27 細(xì)胞的集落形成（P<0.01）。

圖1 莽吉柿素對(duì)HGC-27細(xì)胞集落形成的影響（,n=3）

3.2 莽吉柿素對(duì)HGC-27細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33258 可穿透細(xì)胞膜，使細(xì)胞發(fā)出藍(lán)色熒光的低毒性DNA 染料，正常細(xì)胞在染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻彌散的藍(lán)色熒光，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，因此染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)顆粒塊狀的亮藍(lán)色熒光[12]。Hosechst 染色結(jié)果（圖2）顯示，與對(duì)照組比較，莽吉柿素處理HGC-27細(xì)胞48 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞核呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光，并具有濃度依賴性，表明莽吉柿素可促進(jìn)HGC-27細(xì)胞凋亡。

圖2 莽吉柿素對(duì)HGC-27細(xì)胞形態(tài)的影響（標(biāo)尺為50 μm，400×）

如圖3所示，與對(duì)照組比較，莽吉柿素處理48 h后，HGC-27 細(xì)胞中凋亡標(biāo)志物PARP1 的剪切水平升高，細(xì)胞中的凋亡蛋白Bax 的表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平下調(diào)（P<0.001）。

圖3 莽吉柿素對(duì)HGC-27細(xì)胞凋亡的影響（,n=3）

3.3 莽吉柿素對(duì)HGC-27 細(xì)胞中Neddylation 修飾途徑的影響

Western blot 結(jié)果（圖4）顯示，與對(duì)照組比較，莽吉柿素作用48 h 后，除莽吉柿素4 μmol·L-1組APPBP1 蛋白外，各組HGC-27 細(xì)胞中APPBP1、UBA3及UBC12的表達(dá)水平均下調(diào)（P<0.001）。

圖4 莽吉柿素對(duì)HGC-27細(xì)胞Neddylation修飾途徑的影響（,n=3）

3.4 莽吉柿素對(duì)HGC-27 中MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

MAPK 信號(hào)通路蛋白Western blot 結(jié)果（圖5）顯示，與對(duì)照組比較，莽吉柿素作用48 h后，HGC-27細(xì)胞中JUN、JNK 和p38 的磷酸化水平均發(fā)生了下調(diào)（P<0.001）。

圖5 莽吉柿素對(duì)HGC-27細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的影響（,n=3）

3.5 莽吉柿素對(duì)HGC-27 細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

與對(duì)照組比較，莽吉柿素給藥后裸鼠的體質(zhì)量沒有明顯改變，腫瘤體積縮小18.7%，結(jié)果見表2～3。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程未出現(xiàn)荷瘤鼠死亡。莽吉柿素干預(yù)前14 d，各組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)速度趨勢(shì)一致，14 d 后各組別腫瘤生長(zhǎng)呈現(xiàn)出不同趨勢(shì)，其中模型組瘤體體積增長(zhǎng)速度最快，其次是5-FU組，再次為莽吉柿素給藥組。給藥24 d 后，與對(duì)照組比較，5-FU 組和莽吉柿素組裸鼠的瘤體積均呈現(xiàn)出不同程度縮小趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。并且，莽吉柿素組裸鼠的瘤體積小于5-FU 組。

表2 HGC-27細(xì)胞移植瘤裸鼠體質(zhì)量變化（,n=7）

表2 HGC-27細(xì)胞移植瘤裸鼠體質(zhì)量變化（,n=7）

HE 染色結(jié)果顯示（圖6），與對(duì)照組比較，莽吉柿素組裸鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的形態(tài)特征沒有明顯變化。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示（圖7），與對(duì)照組比較，莽吉柿素組與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)的標(biāo)志蛋白Ki67 陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示莽吉柿素可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖。TUNEL 染色結(jié)果（圖7）表明，莽吉柿素組裸鼠腫瘤組織切片中的棕色細(xì)胞數(shù)量明顯增加，表明莽吉柿素可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖6 莽吉柿素給藥后HGC-27細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型各器官組織HE染色（標(biāo)尺為50 μm，400×）

圖7 莽吉柿素給藥后HGC-27細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型的免疫組化染色分析（標(biāo)尺為50 μm，400×）

表3 HGC-27移植瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況（,n=7）

表3 HGC-27移植瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況（,n=7）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可以有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)[13-19]。莽吉柿素具有良好的抗腫瘤作用[20]，然而其對(duì)胃癌的作用效果和相關(guān)作用機(jī)制還不是十分清楚，有待于進(jìn)一步闡明。本研究發(fā)現(xiàn)莽吉柿素能夠明顯抑制HGC-27 細(xì)胞的增殖能力。

目前，很多臨床上使用的抗癌藥物通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來引發(fā)癌細(xì)胞死亡[21-24]。PARP 蛋白是存在于細(xì)胞核中用以重組與修復(fù)DNA 的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，PARP 蛋白被活化的Caspase-3 剪切，是細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，莽吉柿素能夠上調(diào)PARP1 的剪切水平和Bax 蛋白表達(dá)水平，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。因此推測(cè)莽吉柿素誘導(dǎo)HGC-27 細(xì)胞凋亡可能與促進(jìn)Bax 表達(dá)、抑制Bcl-2表達(dá)的途徑相關(guān)。

Neddylation修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，不僅可以造成多種底物蛋白泛素化降解，還可通過修飾底物蛋白，廣泛參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)[25-26]。Neddylation 修飾與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，廣泛的參與調(diào)控腫瘤的細(xì)胞周期、凋亡、衰老、自噬、血管生成以及免疫細(xì)胞等多種過程[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，莽吉柿素作用之后，HGC-27 細(xì)胞中APPBP1、UBA3 及UBC12 的表達(dá)水平均發(fā)生了下調(diào)。因此推測(cè)，抑制人胃癌細(xì)胞HGC-27 中MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的Neddylation 修飾可能是莽吉柿素抑制HGC-27細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制之一。

MAPK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移和黏附等過程中發(fā)揮了重要作用。c-Jun、JNK與p38 的表達(dá)失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究表明，c-Jun、JNK 和p38 抑制劑可以有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)[28]。田穎穎等[11]研究發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK 信號(hào)通路可能是槐耳清膏抑制NCI-H1299 細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，莽吉柿素給藥能夠抑制HGC-27細(xì)胞c-Jun、JNK和p38的磷酸化水平，提示在HGC-27 細(xì)胞中莽吉柿素能夠抑制MAPK 信號(hào)通路。因此，推測(cè)MAPK 信號(hào)通路的下調(diào)可能部分介導(dǎo)了莽吉柿素抗胃癌作用。

體內(nèi)抗腫瘤研究表明，腹腔注射給藥55 mg·kg-1的莽吉柿素后，裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)得到了顯著抑制，而體質(zhì)量、精神狀態(tài)、飲食和飲水未受明顯影響。腫瘤組織HE切片染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，莽吉柿素對(duì)裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等器官組織并沒有表現(xiàn)出明顯毒性。

Ki67 蛋白的表達(dá)水平通常被用來評(píng)估細(xì)胞的增殖水平，Ki67 蛋白含量越高表明細(xì)胞增殖活性越強(qiáng)[26]。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在注射了莽吉柿素的裸鼠體內(nèi)，Ki67 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，提示莽吉柿素使HGC-27細(xì)胞的增殖活性受到抑制。

TUNEL 實(shí)驗(yàn)通常用于分析組織或細(xì)胞的凋亡[29-30]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，莽吉柿素組裸鼠的腫瘤組織細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng)。因此，莽吉柿素可通過阻止腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而明顯抑制裸鼠HGC-27細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)。

綜上所述，體外研究發(fā)現(xiàn)，莽吉柿素能夠抑制HGC-27細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制其類泛素化修飾過程。莽吉柿素還能夠抑制HGC-27 細(xì)胞中MAPK 信號(hào)通路。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，莽吉柿素能夠顯著抑制裸鼠體內(nèi)HGC-27 細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)。因此，推測(cè)莽吉柿素是潛在的天然抗胃癌活性成分，具有一定的臨床開發(fā)價(jià)值。