甘草地上部分寡糖富集純化及其抗衰老活性研究△

于冰莉，方永晟，龐昕昕，郭小趁，王文全，2*，劉永剛*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；

2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

人口老齡化已成為人們最關(guān)注的全球性社會(huì)問(wèn)題之一，衰老及衰老相關(guān)疾病成為日益嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問(wèn)題和社會(huì)難題。氧化應(yīng)激與衰老具有十分緊密的聯(lián)系。關(guān)于衰老的經(jīng)典學(xué)說(shuō)氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)認(rèn)為，衰老的根本原因是氧化性損傷，即自由基積累造成的細(xì)胞損傷[1]。通過(guò)抗氧化活性藥物降低體內(nèi)自由基水平是延緩機(jī)體衰老的重要途徑之一。

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖[2]，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、潤(rùn)肺止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效[3]。我國(guó)有“十方九草”“無(wú)草不成方”之說(shuō)，從古至今，甘草根及根莖廣為藥用，而其地上部分常作為牧草或是焚燒丟棄，造成資源浪費(fèi)。研究發(fā)現(xiàn)，甘草地上部分提取物具有抗氧化[4-9]、抗炎[9-10]、抑菌[11-14]、抗腫瘤[15]等多種藥理活性。甘草地上部分水提物中多糖類(lèi)成分已有報(bào)道，且抗氧化活性良好[6]。從中藥提取出的寡糖活性成分有很多，如巴戟天寡糖可能通過(guò)抗氧化減輕子宮缺血再灌注損傷[16]；人參花寡糖可恢復(fù)D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化損傷，提高氧化酶活力，減少丙二醛（MDA）在體內(nèi)的積累[17]。而甘草地上部分寡糖的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究對(duì)甘草地上部分進(jìn)行提取，運(yùn)用柱色譜技術(shù)分離純化水提物得到寡糖類(lèi)成分，借助凝膠滲透色譜、薄層色譜手段對(duì)其進(jìn)行表征，通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)甘草地上部分寡糖的抗衰老、抗氧化活性，探索其中潛在抗衰老天然活性物質(zhì)，為后續(xù)甘草地上部分資源綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 菌株、線蟲(chóng)品系

大腸桿菌Escherichia coliOP50、野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)株N2由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所惠贈(zèng)。

1.2 試藥

甘草地上部分，2018 年9 月采集于甘肅省酒泉市瓜州縣河?xùn)|鄉(xiāng)，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所王文全教授鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的地上部分，陰干，粉碎，備用。

無(wú)水乙醇、甲醇、乙酸乙酯均為分析純（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；吡啶、苯胺、磷酸、丙酮、硫酸、二苯胺、硝酸鈉、氯化鈉均為分析純（北京化工廠）；5%苯酚水溶液（上海源葉生物科技有限公司）；對(duì)照品D-葡萄糖（純度≥99%，批號(hào)：S21J12I138537）、D-果糖（純度≥99%，批號(hào)：J31M9R62568）、維生素C（純度≥98%，批號(hào)：S19J6G1），均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[DPPH，梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[重均相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）分別為289 000、110 000、60 600、12 600、4320，批號(hào)分別為C10025642、C10025640、C10034456、C10020386、C10020398]，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；DEAE-52 型纖維素樹(shù)脂（北京索萊寶科技有限公司）；Sephadex LH-20型樹(shù)脂[安瑪西亞（中國(guó)）有限公司]；薄層色譜硅膠G板（青島海洋化工有限公司）。

1.3 儀器

CP224C型萬(wàn)分之一分析天平（奧豪斯上海儀器有限公司）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；BKQP-75L 型立式高壓滅菌鍋（濟(jì)南博鑫生物技術(shù)有限公司）；UV-2600 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）；SMZ745 型體視顯微鏡、ECLIPSE Ts2R 型熒光倒置顯微鏡（尼康映像儀器銷(xiāo)售中國(guó)有限公司）；e2695型色譜儀[色譜柱為Ultrahydrogel TM 250（300 mm×7.8 mm，6 μm）與Ultrahydrogel TM Linear（300 mm×7.8 mm，10 μm）串聯(lián)]、2424 RI Detector型示差折光檢測(cè)器均購(gòu)于沃特世科技有限公司。

2 方法

2.1 苯酚-硫酸法測(cè)總糖含量

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱(chēng)取對(duì)照品D-葡萄糖10 mg，加去離子水定容于100 mL量瓶中，混勻，即得葡萄糖對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度為0.10 mg·mL-1。精密移取葡萄糖對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 于10 mL 量瓶中，加入去離子水補(bǔ)至1.0 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻，加入濃硫酸5 mL，振搖混勻，室溫條件下靜置20 min，冰浴15 min，在波長(zhǎng)487 nm 處測(cè)定其吸光度（A）值。以A為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

2.1.2 樣品溶液總糖含量測(cè)定 精密稱(chēng)取受試樣品10 mg，用去離子水定容于10 mL 量瓶中，混勻。精密移取樣品溶液0.1 mL 于10 mL 量瓶中，加入去離子水補(bǔ)至1.0 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻，再加入濃硫酸5 mL，振搖混勻，室溫條件下靜置20 min，冰浴15 min，在波長(zhǎng)487 nm處測(cè)定其A值，將A值代入回歸方程計(jì)算得到其總糖含量。

2.2 甘草地上部分寡糖的制備

取甘草地上部分，加10 倍量去離子水，加熱提取2 次，每次連續(xù)回流2 h，紗布濾過(guò)，合并濾液，旋蒸濃縮，真空干燥后得到水提物。

取水提物，溶于少量水中，過(guò)AB-8型大孔樹(shù)脂柱[18]，徑高比1∶8，吸附過(guò)夜，先以4 倍柱體積（BV）水洗除雜，再以30%乙醇洗脫，洗脫流速為3 BV·h-1，洗脫體積為8 BV，得到粗糖富集物。

取粗糖富集物，上樣DEAE-52 纖維素柱[19]，依次以去離子水及0.1、0.3、0.5 mol·L-1NaCl梯度洗脫，洗脫體積為4 BV，流速為1 mL·min-1，洗脫液每5 mL接1瓶，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，以苯酚-硫酸法測(cè)得總糖含量為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，合并糖含量高的洗脫液，透析、濃縮、干燥，得到粗糖。

取粗糖，溶于少量甲醇中，上樣Sephadex LH-20 凝膠柱[20]，甲醇洗脫，洗脫體積為5 BV，流速為1 mL·min-1，洗脫液每5 mL 接1 瓶，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，以苯酚-硫酸法測(cè)得總糖含量為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，合并糖含量高的洗脫組分，回收溶劑，得到甘草地上部分寡糖樣品。

2.3 甘草地上部分寡糖的表征

2.3.1 凝膠滲透色譜法測(cè)定樣品Mw標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精密稱(chēng)取Mw為289 000、110 000、60 600、12 600、4320 的葡聚糖對(duì)照品，配制成1 mg·mL-1的溶液，用0.22 μm 的濾膜濾過(guò)除雜后進(jìn)樣。分析軟件為Angilent GFC；檢測(cè)流動(dòng)相為0.1 mol·L-1硝酸鈉溶液，流速為0.6 mL·min-1，柱溫箱溫度為35 ℃，示差檢測(cè)器溫度為40 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，時(shí)間為45 min。

甘草地上部分寡糖測(cè)定：精密稱(chēng)量甘草地上部分寡糖樣品，溶于去離子水中，配制成1 mg·mL-1的溶液，用0.22 μm 的濾膜濾過(guò)除雜后進(jìn)樣。用Angilent GFC軟件分析計(jì)算樣品Mw。

2.3.2 薄層色譜法鑒定樣品成分 精密稱(chēng)量甘草地上部分寡糖樣品10 mg，溶于去離子水10 mL中，配制成1 mg·mL-1的供試品溶液。精密稱(chēng)量對(duì)照品D-葡萄糖和D-果糖各2 mg，溶于去離子水10 mL 中，配制成0.2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。展開(kāi)劑為乙酸乙酯-乙醇-吡啶-水（8∶2∶2∶1）。點(diǎn)樣量為5 μL。顯色劑為苯胺-二苯胺溶液（取苯胺1 mL和二苯胺1 g，同溶于100 mL 丙酮中，再加85%磷酸水10 mL，混勻，棕色瓶保存，現(xiàn)用現(xiàn)配），85 ℃加熱10 min。

2.4 甘草地上部分寡糖體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

精確稱(chēng)取DPPH 5 mg，用無(wú)水乙醇溶解并定容于50 mL 量瓶中，質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1，避光保存。取96 孔板，加入不同質(zhì)量濃度（0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg·mL-1）的甘草地上部分寡糖樣品水溶液100 μL，再分別加入新配制的DPPH 溶液100 μL，避光反應(yīng)30 min 后，用酶標(biāo)儀在517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其A值。分別以去離子水和維生素C作為空白和陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)4次。按照公式（1）計(jì)算自由基清除率。

自由基清除率=[1-(Ai-Aj)]/A0× 100%（1）

式中，Ai為DPPH 100 μL 和樣品溶液100 μL 混合液的吸光度；Aj為樣品溶液100 μL 和水100 μL 混合液的吸光度；A0為DPPH 100 μL 和水100 μL 混合液的吸光度。

2.5 甘草地上部分寡糖體內(nèi)抗衰老活性評(píng)價(jià)

2.5.1 溶液配制 M9 緩沖液、NGM 培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、線蟲(chóng)裂解液按照常規(guī)方法配制[21]。

2.5.2 線蟲(chóng)同步化 N2 線蟲(chóng)飼養(yǎng)于涂布有大腸桿菌E.coliOP50 的線蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基NGM 中，20 ℃下培養(yǎng)。挑取50 只左右產(chǎn)卵期成蟲(chóng)至1.5 mL 離心管中，加入線蟲(chóng)裂解液1 mL。渦旋混勻3～5 min，3000 r·min-1離心3 min（離心半徑120 mm）；棄上清液至剩余液體0.1 mL，加入M9 Buffer 1 mL 混勻；重復(fù)此步驟2 次，最后保留液體0.1 mL，將液體滴加至新的線蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基（NGM）中，次日孵化出新的線蟲(chóng)。

2.5.3 氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)過(guò)同步化生長(zhǎng)至L4 期后的N2 線蟲(chóng)置于含或不含藥物的NGM 中，實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組和甘草地上部分寡糖給藥組（質(zhì)量濃度分別為10、20、40 μg·mL-1），每板30 條，48 h 后，把各組線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到含有0.4% H2O2的線蟲(chóng)NGM 中觀察，每0.5 h 記錄線蟲(chóng)存活數(shù)目，直至線蟲(chóng)全部死亡，重復(fù)3次。

2.5.4 熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn) N2線蟲(chóng)分組同2.5.3項(xiàng)下。給藥組線蟲(chóng)經(jīng)不同質(zhì)量濃度的甘草地上部分寡糖處理48 h 后與對(duì)照組線蟲(chóng)同時(shí)置于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行觀察，每2 h 觀察線蟲(chóng)死亡情況，記錄并挑出死亡個(gè)體，直至線蟲(chóng)全部死亡，重復(fù)3次。

2.5.5 壽命實(shí)驗(yàn) N2線蟲(chóng)分組同2.5.3項(xiàng)下，每組50條，給藥后每48 h觀察1次線蟲(chóng)的生存狀態(tài)，記錄死亡線蟲(chóng)數(shù)量并將其挑出，并更換新的含藥或不含藥NGM，直至所有線蟲(chóng)全部死亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用Kaplan-Meier 生存分析不同質(zhì)量濃度組線蟲(chóng)的存活率差異。

2.5.6 脂褐素含量測(cè)定 N2 線蟲(chóng)分組同2.5.3 項(xiàng)下，給藥處理5 d后，挑至滴加M9 1滴的2%瓊脂片上，再滴加疊氮化鈉溶液1 滴，待蟲(chóng)體變直，蓋上蓋玻片，于倒置熒光顯微鏡下觀察不同組線蟲(chóng)體內(nèi)的脂褐素水平，固定曝光時(shí)間和強(qiáng)度，拍攝熒光圖片，拍攝條件為Ex 385 nm、Em 430 nm，使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)圖片中脂褐素自發(fā)熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果

3.1 樣品Mw測(cè)定及薄層色譜鑒別

建立葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=8.526 8C-0.045 6（r=0.996 9），葡萄糖質(zhì)量濃度為0.01～0.07 mg·mL-1有較好的線性關(guān)系。從甘草地上部分4 kg 中得到寡糖樣品410 mg，苯酚-硫酸法測(cè)其總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為81.23%。

采用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定已知相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖，記錄色譜峰保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖1。建立葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-3.464 6X+41.284（r=0.992 7），X為lgMw，Y為洗脫時(shí)間。取Mw為289 000的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，按上述色譜條件測(cè)定，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰時(shí)間的RSD為0.040 6%，說(shuō)明該儀器精密度良好。取供試品溶液6 份，進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，溶液出峰時(shí)間的RSD 為0.081 5%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。取供試品溶液6 份分別放置0、1、2、4、8、10 h，進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，溶液出峰時(shí)間的RSD 為0.112%，說(shuō)明樣品穩(wěn)定性良好。將樣品配制成1 mg·mL-1的供試品溶液，通過(guò)高效凝膠滲透色譜法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。樣品的圖譜不是對(duì)稱(chēng)的色譜峰，左側(cè)可見(jiàn)多個(gè)肩峰，說(shuō)明樣品中含有多種糖類(lèi)組分，將樣品的洗脫時(shí)間最小肩峰值30 min 和峰值33.517 min 分別代入到回歸方程，計(jì)算得到樣品Mw為180～1800，判斷為寡糖類(lèi)成分。

圖1 葡聚糖對(duì)照品的凝膠滲透色譜圖

圖2 甘草地上部分寡糖樣品的凝膠滲透色譜圖

以D-葡萄糖和D-果糖為對(duì)照品，采用薄層色譜法對(duì)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3顯示，樣品中不含葡萄糖和果糖。

圖3 D-葡萄糖、D-果糖、樣品的薄層色譜圖

3.2 甘草地上部分寡糖體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

甘草地上部分寡糖樣品清除DPPH 自由基能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4，不同質(zhì)量濃度樣品溶液對(duì)DPPH 自由基均有清除作用，并且在實(shí)驗(yàn)選取的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.220 2 mg·mL-1，抗氧化活性弱于陽(yáng)性對(duì)照維生素C（0.016 9 mg·mL-1）。表明甘草地上部分寡糖樣品具有一定的抗氧化活性。

圖4 甘草地上部分寡糖樣品與維生素C清除DPPH自由基的作用

3.3 甘草地上部分寡糖體內(nèi)抗氧化應(yīng)激及熱應(yīng)激活性評(píng)價(jià)

各組線蟲(chóng)在H2O2應(yīng)激環(huán)境中培養(yǎng)的生存曲線見(jiàn)圖5。與對(duì)照組比較，甘草地上部分寡糖10、20、40 μg·mL-1組線蟲(chóng)生存曲線均明顯右移。在氧化應(yīng)激條件下，各質(zhì)量濃度樣品組線蟲(chóng)存活率明顯提高，與對(duì)照組比較，甘草地上部分寡糖10、20、40 μg·mL-1組線蟲(chóng)存活率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。甘草地上部分寡糖20 μg·mL-1對(duì)線蟲(chóng)壽命延長(zhǎng)作用最強(qiáng)，抗氧化應(yīng)激能力最強(qiáng)。

圖5 氧化應(yīng)激下甘草地上部分寡糖對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響

線蟲(chóng)在37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)的生存曲線見(jiàn)圖6。與對(duì)照組比較，甘草地上部分寡糖10、20、40 μg·mL-1組線蟲(chóng)生存曲線均明顯右移。在熱應(yīng)激條件下各質(zhì)量濃度樣品組線蟲(chóng)存活率均明顯提高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。甘草地上部分寡糖20 μg·mL-1組線蟲(chóng)壽命延長(zhǎng)作用最強(qiáng)，抗熱應(yīng)激能力最強(qiáng)。

圖6 熱應(yīng)激下甘草地上部分寡糖對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響

3.4 甘草地上部分寡糖對(duì)延緩線蟲(chóng)衰老的影響

如圖7和表1所示，甘草地上部分寡糖各質(zhì)量濃度組線蟲(chóng)生存曲線與對(duì)照組比較沒(méi)有發(fā)生明顯的偏移。甘草地上部分寡糖20、40 μg·mL-1組線蟲(chóng)平均壽命均高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。甘草地上部分寡糖20 μg·mL-1組線蟲(chóng)最長(zhǎng)壽命高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明甘草地上部分寡糖對(duì)線蟲(chóng)壽命沒(méi)有顯著的延長(zhǎng)作用。

表1 甘草地上部分寡糖對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響（,n=150）

表1 甘草地上部分寡糖對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響（,n=150）

圖7 甘草地上部分寡糖對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響

在熒光顯微鏡下可見(jiàn)線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素自發(fā)藍(lán)色熒光。隨著線蟲(chóng)壽命的增加，脂褐素含量逐漸增多。給藥5 d后，甘草地上部分寡糖10、20、40 μg·mL-1組線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度均明顯降低，較對(duì)照組分別降低了23.8%、33.8%、23.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。甘草地上部分寡糖20 μg·mL-1組線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度最低，對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素沉積減緩作用最強(qiáng)，見(jiàn)圖8～9。

圖8 給藥5 d后各組線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素?zé)晒鈭D（40×）

4 討論

現(xiàn)代藥理研究表明，甘草主要的抗氧化活性成分為黃酮類(lèi)，包括甘草總黃酮[22]、查耳酮[23]、甘草苷[24]、異甘草素[25]等，同時(shí)甘草中三萜[26]和多糖[27-29]等成分也有一定的抗氧化作用。甘草水提液對(duì)具有細(xì)胞損傷作用的超氧陰離子自由基和羥基自由基均有明顯的清除作用，并能抑制羥基自由基誘發(fā)的膜脂質(zhì)反應(yīng)，發(fā)揮一定的抗衰老作用[30]。甘草苷可以改善D-半乳糖所致衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減緩衰老引起的氧化損傷，提高腦內(nèi)的抗氧化能力[31]。甘草水提物對(duì)D-半乳糖致衰老的大鼠具有肝保護(hù)、抗氧化和抗衰老作用[32]。

中藥多糖來(lái)源廣泛，具有調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)血脂、降血糖等多種生物活性，尤其在抗衰老方面有明顯的優(yōu)勢(shì)，其抗衰老作用機(jī)制一直是中藥多糖生物活性研究中的熱點(diǎn)之一。當(dāng)歸多糖[33]、枸杞多糖[34]、肉蓯蓉多糖[35]、海帶多糖[36]、黃芪多糖[37]、鎖陽(yáng)多糖[38]、黃精多糖[39]、平貝母多糖[40]、女貞子多糖[41]、馬齒莧多糖[42]等中藥多糖均可通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化和清除自由基，調(diào)節(jié)端粒酶活性和機(jī)體的糖、脂質(zhì)代謝，以及神經(jīng)-內(nèi)分泌功能等多種途徑來(lái)發(fā)揮抗衰老作用。殼寡糖作為殼聚糖降解后的衍生物，能有效清除羥基自由基和超氧陰離子自由基，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[43]。系列褐藻膠寡糖通過(guò)清除活性氧自由基，來(lái)發(fā)揮抗氧化作用[44]。瓊膠寡糖具有較強(qiáng)且廣泛的抗氧化能力，對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均存在較強(qiáng)的清除作用[45]。

本研究通過(guò)提取甘草地上部分，得到的水提物經(jīng)過(guò)AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂、DEAE-52 纖維素、Sephadex LH-20 樹(shù)脂等柱色譜進(jìn)行富集純化，得到甘草地上部分寡糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為81.23%，說(shuō)明該方法可以有效去除水提物中的蛋白質(zhì)和色素，適宜于甘草地上部分寡糖的純化。經(jīng)凝膠滲透色譜法檢測(cè)，樣品Mw為180～1800，且薄層色譜鑒別顯示樣品不含葡萄糖和果糖，可判斷樣品為甘草地上部分寡糖類(lèi)成分。其單糖組成及分子結(jié)構(gòu)信息尚待進(jìn)一步研究。樣品對(duì)DPPH 自由基有較好的清除作用，能顯著延長(zhǎng)氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激下線蟲(chóng)壽命，減少線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素沉積，具有良好的抗氧化損傷及抗衰老活性。說(shuō)明甘草地上部分寡糖對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的氧化損傷和衰老具有一定的保護(hù)作用，在抗衰老方面具有一定的潛在藥用價(jià)值，但其作用機(jī)制有待深入研究。本研究為甘草地上部分寡糖在抗氧化、抗衰老方面的進(jìn)一步研究及相關(guān)食品、藥品、保健食品等產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了一定的理論依據(jù)，為天然產(chǎn)物的體外抗氧化、體內(nèi)抗衰老活性評(píng)價(jià)的探究提供了一定的方法指導(dǎo)。

圖9 給藥5 d后甘草地上部分寡糖對(duì)線蟲(chóng)脂褐素沉積的影響（,n=30）