FAM83D 在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義

繆宇鋒 張有為 焦南林

1.浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江溫嶺 317500；2.江蘇省徐州市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇徐州 221009；3.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院病理科，安徽蕪湖 241001

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤，主要病理類型為胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD），5 年生存率約為5%[1-2]。由于胰腺癌起病隱匿，早期癥狀不典型，大多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期；并且，進(jìn)展到晚期的胰腺癌缺乏有效治療手段，導(dǎo)致其發(fā)病率與病死率相近，預(yù)后極差[3]。PAAD 發(fā)病機(jī)制尚未明確，家族遺傳性、吸煙、慢性胰腺炎及糖尿病等因素均被證實(shí)與之相關(guān)[4]。因此，深入探索PAAD 發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵基因，對(duì)于進(jìn)一步明確其發(fā)病機(jī)制，提高早期診斷及評(píng)估預(yù)后具有重要意義。

FAM83D 是FAM83 家族成員，定位于人類20q 染色體，編碼紡錘體相關(guān)的蛋白，被認(rèn)為與有絲分裂密切相關(guān)[5-6]。既往研究[7-10]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83D 在多種癌癥如卵巢癌、肝癌及肺癌中表達(dá)上調(diào)，并參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，可能成為新型腫瘤分子標(biāo)志物。然而，F(xiàn)AM83D 在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未明確，本研究基于在線數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)性分析FAM83D 基因在PAAD 的表達(dá)及預(yù)后意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

60 對(duì)PAAD 術(shù)后組織標(biāo)本來(lái)自2018 年1 月至2019 年12 月皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院病理科的存檔蠟塊，包括癌組織與癌旁組織（距離腫瘤>2 cm 的胰腺組織），所有患者病理學(xué)診斷明確，術(shù)前均未接受放化療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得所有患者知情同意。

1.2 生物信息學(xué)分析

基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）工具（http://gepia2.cancerpku.cn）在線分析FAM83D 基因在PAAD 的表達(dá)及預(yù)后，參數(shù)設(shè)定：Log2FC Cutoff=1，p-value Cutoff=0.01。其中腫瘤組織（n=179）信息來(lái)源于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，正常組織（n=171）信息源于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)。驗(yàn)證數(shù)據(jù)集來(lái)自KMplot 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmplot.com/analysis/）。

1.3 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

采用GSEA 將RNAseq Gene 數(shù)據(jù)中胰腺癌組織樣本分為FAM83D mRNA 高表達(dá)組和低表達(dá)組（基于FAM83D mRNA 表達(dá)的中位數(shù)值作為Cutoff 值），分析預(yù)測(cè)靶基因可能參與的信號(hào)通路。參照基因集為MsigDB 中的c2.all.v5.0.symbols.gmt，將其導(dǎo)入GSEA 4.0.3 軟件中進(jìn)行通路富集分析，軟件設(shè)置按照默認(rèn)參數(shù)，樣本置換檢驗(yàn)1000 次，F(xiàn)DR<0.05 作為差異顯著性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry，IHC）

調(diào)取蠟塊，以4 μm 厚切片，脫蠟水化，3% H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶室溫10 min，PBS 沖洗，高溫高壓抗原修復(fù)，PBS 再?zèng)_洗，滴加Anti-FAM83D 一抗（Abcam 中國(guó)，1∶100 稀釋），4℃過(guò)夜，PBS 沖洗后二抗室溫孵育30 min，PBS 沖洗，DAB 顯色，流水沖洗10 min，蘇木精復(fù)染，脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察。FAM83D 陽(yáng)性染色位于細(xì)胞漿，IHC 評(píng)分根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)來(lái)判定，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[11]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過(guò)對(duì)維生素B1缺乏癥的治療以及預(yù)防，減少了動(dòng)物的死亡率，節(jié)約了養(yǎng)殖成本，降低了因維生素B1缺乏引起的各種神經(jīng)及心血管癥狀，能直接提供動(dòng)物所需的硫胺素，從而達(dá)到預(yù)防和治療的目的。

2 結(jié)果

2.1 FAM83D 在PAAD 中的表達(dá)情況

與FAM83D mRNA 低表達(dá)組比較，F(xiàn)AM83D mRNA高表達(dá)組總生存期、無(wú)進(jìn)展生存期明顯縮短（P<0.01），見(jiàn)圖2A～B；并且在KMplot 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，見(jiàn)圖2C～D。

綜上所述，通過(guò)對(duì)腦卒中偏癱患者進(jìn)行呼吸肌反饋訓(xùn)練，可以有效地改善患者的呼吸功能障礙，呼吸功能的改善促進(jìn)了患者的吞咽，患者吞咽功能的改善又進(jìn)一步改善了患者的呼吸功能，呼吸功能改善與吞咽功能改善就形成了一種良性循環(huán)。并且該訓(xùn)練方法簡(jiǎn)單有效，可以在臨床推廣應(yīng)用呼吸肌反饋訓(xùn)練儀對(duì)腦卒中偏癱患者進(jìn)行呼吸功能的訓(xùn)練。但本研究也存在局限性，比如樣本量小，訓(xùn)練時(shí)間不夠長(zhǎng)，同時(shí)未對(duì)呼吸功能改善與吞咽障礙功能改善的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步探究。以后的研究中會(huì)加大樣本量，延長(zhǎng)訓(xùn)練時(shí)間并進(jìn)一步探究呼吸功能與吞咽功能之間的關(guān)系。

表1 FAM83D 蛋白表達(dá)與PAAD 臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

圖1 FAM83D 在PAAD 中的表達(dá)情況

2.2 FAM83D mRNA 表達(dá)與PAAD 患者預(yù)后的關(guān)系

GEPIA 在線分析顯示，與正常組織比較，腫瘤組織中FAM83D mRNA 表達(dá)明顯升高（P <0.01），見(jiàn)圖1A。組織標(biāo)本分析顯示，65.0%（39/60）癌組織中FAM83D 蛋白水平為高表達(dá)（IHC 評(píng)分≥3 分），而36.7%（22/60）癌旁組織中FAM83D 蛋白水平為高表達(dá)；與癌旁組織比較，癌組織IHC 評(píng)分顯著增高（P <0.01），見(jiàn)圖1B～C。進(jìn)一步分析臨床病理參數(shù)，PAAD 患者FAM83D 蛋白高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P ＜0.05），與性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑、分化程度、TNM 分期無(wú)關(guān)（P >0.05），見(jiàn)表1。

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；FAM83D表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier生存分析，生存期比較采用Log-rank 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

我國(guó)銀行進(jìn)行信貸業(yè)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)分析時(shí)，主要方法還是以客戶自身信用情況分析為主，對(duì)企業(yè)所屬產(chǎn)業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)重視程度不夠，雖然已經(jīng)有一些銀行著手將產(chǎn)業(yè)風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)合到風(fēng)險(xiǎn)管理工作當(dāng)中，但對(duì)其的認(rèn)識(shí)依舊不夠深入，當(dāng)前的產(chǎn)業(yè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)體系還存在著許多問(wèn)題。

中風(fēng)屬于常見(jiàn)的急性腦血管疾病，存在起病突然的特點(diǎn)，且發(fā)生局部灶性神經(jīng)功能發(fā)生缺失，患病之后合并發(fā)生多種并發(fā)癥[1] ，其中吞咽功能障礙較為常見(jiàn)。

圖2 FAM83D mRNA 表達(dá)與PAAD 患者預(yù)后的關(guān)系

2.3 FAM83D 基因潛在作用機(jī)制

FAM83D 上調(diào)與多個(gè)基因集呈正相關(guān)（P <0.05），如BIDUS_METASTASIS_UP、KEGG_CELL_CYCLE、HALLMARK_GLYCOLYSIS、HALLMARK_DNA_REPAIR、REACTOME_SIGNALING_BY_WNT、JAIN_NFKB_SIGNALING。見(jiàn)圖3。

圖3 GSEA 分析FAM83D 基因潛在作用機(jī)制

3 討論

近年來(lái)，伴隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用以及數(shù)據(jù)共享機(jī)制的不斷成熟，以TCGA 和GEO 為代表的國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫(kù)中積累了大規(guī)模的多組學(xué)腫瘤數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)型研究逐漸成為腫瘤生物信息學(xué)研究的重要模式[12]。本研究以腫瘤公共數(shù)據(jù)庫(kù)和相應(yīng)的生物信息學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，與正常組織比較，腫瘤組織中FAM83D mRNA 表達(dá)顯著升高；IHC結(jié)果顯示癌組織中FAM83D 蛋白呈高表達(dá)，且FAM83D蛋白高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示FAM83D 可作為PAAD 診斷與預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。

FAM83 基因家族共享一個(gè)高度保守的N-末端（DUF1669）[13-14]，此結(jié)構(gòu)域不僅具有一定的磷脂酶D 活性以激活表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）[15-16]，還可促進(jìn)c-Raf 激酶的膜轉(zhuǎn)位激活MAPK 信號(hào)通路[17]，參與調(diào)控上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變。目前研究[18-21]顯示，F(xiàn)AM83D在不同類型的腫瘤中均存在擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)，但其作用機(jī)制尚未明確。FAM83D 上調(diào)通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)能力，與胃癌的預(yù)后不良有關(guān)[22]；FAM83D 通過(guò)調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌的AKT/mTOR 途徑促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，侵襲和順鉑耐藥[23]；FAM83D 通過(guò)PI3K/AKT/mTOR 途徑抑制自噬并促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲[24]；敲除FAM83D 通過(guò)抑制FBXW7/Notch-1 信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的增殖，遷移和侵襲[25]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83D 上調(diào)與多個(gè)基因集呈正相關(guān)，如BIDUS_METASTASIS_UP、KEGG_CELL_CYCLE、HALLMARK_GLYCOLYSIS、HALLMARK_DNA_REPAIR、REACTOME_SIGNALING_BY_WNT、JAIN_NFKB_SIGNALING。提示FAM83D 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期、糖酵解、DNA 修復(fù)等生物學(xué)過(guò)程以及WNT、NF-κB 信號(hào)通路，具體尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究基于在線數(shù)據(jù)庫(kù)的深入挖掘，證實(shí)FAM83D 基因在PAAD 發(fā)生發(fā)展中的重要作用，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供了理論依據(jù)。