circRNA在急性髓系細(xì)胞白血病中的應(yīng)用進(jìn)展*

呂定豐，應(yīng)琪明，牧啟田(1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生部，浙江寧波 315211；2.寧波市第一醫(yī)院 a.輸血科，b.干細(xì)胞移植實驗室，浙江寧波 315010)

急性髓系細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是以未成熟的髓系細(xì)胞異常增殖和分化受阻為特征的侵襲性血液腫瘤，約占急性白血病的70%～80%。依據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫標(biāo)記、遺傳學(xué)等特點(diǎn)，AML可分為不同亞型，具有高異質(zhì)性。盡管近些年AML治療已經(jīng)取得驚人的進(jìn)展，然而仍有相當(dāng)部分患者容易復(fù)發(fā)、總體無病生存率較低[1]。AML的發(fā)病機(jī)制尚未明確，近年來，隨著基因分析技術(shù)及測序技術(shù)的發(fā)展，人類相繼發(fā)現(xiàn)了大量在AML發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用的非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)，這些ncRNA特異性作用于轉(zhuǎn)錄因子或作為影響表觀遺傳機(jī)制的關(guān)鍵組分，為診斷和預(yù)后標(biāo)記AML提供了新的思路。環(huán)狀RNA(circRNA)是近年來表觀遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)，大部分circRNA參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控，現(xiàn)有證據(jù)證實，circRNA在各種血液惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療中均具有重要作用[2]。本文重點(diǎn)闡述circRNA在AML發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后中的作用，為AML的診斷和治療提供新的思路和認(rèn)知。

1 circRNA的形成與特點(diǎn)

circRNA是一類特殊的ncRNA，通過非經(jīng)典反式剪切形成3′端和5′端首尾相連的環(huán)狀單鏈RNA。circRNA不僅是mRNA剪接的副產(chǎn)物，而且是一種新型調(diào)控選擇性剪接的產(chǎn)物，在正常細(xì)胞分化和組織穩(wěn)態(tài)以及疾病發(fā)展過程中均具有重要作用。

依照組成形式的不同，circRNA可分為外顯子circRNA(ecircRNA)、內(nèi)含子circRNA、同時含有外顯子和內(nèi)含子circRNA(exonintron circRNA,EIcirNA)及基因內(nèi)circRNA(intragenic circRNA)。circRNA大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中，少部分存在于核酸中。目前已知的circRNA具有以下特點(diǎn)：(1)相對于線性RNA，其表達(dá)具有多樣性，在人類基因中存在表達(dá)尤為普遍；(2)半衰期長，具有高度的穩(wěn)定性；(3)具有物種特異性、組織特異性、進(jìn)化保守性；(4)表達(dá)豐度與發(fā)育階段、年齡和疾病類型密切相關(guān)。circRNA的存在形式和特點(diǎn)，使其成為疾病診斷和治療過程中潛在的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[3]。

2 circRNA的功能

2.1作為microRNA(miRNA)海綿體，競爭抑制miRNA的功能 人們最先在斑馬魚實驗中發(fā)現(xiàn)，小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense,CDR1as)具有超過70個miR-7結(jié)合位點(diǎn)，CDR1as表達(dá)過高或敲除miR-7均會造成中腦體積縮小，從而導(dǎo)致中腦發(fā)育障礙[4]。后經(jīng)研究證實，circRNA可通過阻斷miRNA與特定基因3′UTR的結(jié)合，間接調(diào)控基因表達(dá)，發(fā)揮海綿樣作用[5]。

2.2調(diào)節(jié)選擇性剪接 circRNA可以通過隔離翻譯起始位點(diǎn)以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)，從而起到mRNA“陷阱”的作用。Ashwal-Fluss等[6]研究發(fā)現(xiàn)，甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)等剪接因子可調(diào)節(jié)circRNA的發(fā)生，并調(diào)節(jié)典型剪接與選擇性剪接之間平衡。

2.3調(diào)節(jié)RNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用 在某些條件下，RNA結(jié)合蛋白(RBP)可以作為circRNA形成的激活劑或抑制劑。QKI蛋白和ADAR蛋白屬于RBP的STAR家族，QKI通過與circRNA側(cè)翼的內(nèi)含子結(jié)合，促進(jìn)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成以調(diào)節(jié)circRNA產(chǎn)生，ADAR則通過降低環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成，減少circRNA的產(chǎn)生[7]。

2.4部分翻譯為蛋白質(zhì)發(fā)揮功能 Abe等[8]報道大腸埃希菌無細(xì)胞系統(tǒng)中的circRNA可以通過滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification,RCA)機(jī)制進(jìn)行高效翻譯。Legnini等[9]報道circ-ZNF609可以直接編碼蛋白質(zhì)，參與肌肉發(fā)育過程。隨后，又陸續(xù)有多種circRNA被證實具有翻譯成蛋白質(zhì)的功能。上述發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步擴(kuò)展了人類對于circRNA功能的認(rèn)知。

3 circRNA在AML中的應(yīng)用

circRNA在造血細(xì)胞中廣泛表達(dá)，且其表達(dá)水平可隨分化而改變，并具有細(xì)胞類型特異性，是造血細(xì)胞分化、成熟和功能的調(diào)節(jié)因子。circRNA不僅參與AML等血液腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后過程，而且在血液腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)譜相比正常細(xì)胞更為多樣，在發(fā)展不同階段影響造血細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

3.1circRNA參與AML發(fā)病機(jī)制

3.1.1通過circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)參與AML發(fā)病 Chen等[10]對新發(fā)AML和缺鐵性貧血(IDA)患者進(jìn)行circRNA微陣列分析，發(fā)現(xiàn)AML患者中有282個circRNA上調(diào)，416個circRNA下調(diào)。其進(jìn)一步通過實時熒光定量PCR(real time-quantitative PCR，RT-qPCR)對87例AML和45例IDA患者的隊列進(jìn)行分析，證實AML患者中circ-ANAPC7顯著上調(diào)。circ-ANAPC7富含hsa-miR-181家族miRNA應(yīng)答元件，利用KEGG富集分析預(yù)測顯示，circ-ANAPC7可能與hsa-miR-181家族結(jié)合參與AML的發(fā)病。也有學(xué)者對AML和IDA患者的樣本進(jìn)行了RNA測序技術(shù)(RNA sequencing,RNA-seq)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circ_0009910在AML患者骨髓中明顯上調(diào)，高表達(dá)的circ_0009910通過“吸附”miR-20a-5p促進(jìn)了細(xì)胞增殖，加速AML發(fā)生和進(jìn)展[11]。

有學(xué)者[12]用生物信息學(xué)和熒光素酶分析證實，miR-203可結(jié)合circ_100290和Rab10，敲除circ_100290后能夠顯著阻滯G1期細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并增加了細(xì)胞周期蛋白D1、CDK4、BCl-2和caspase-3的表達(dá)水平，提示circ_100290通過“吸附”miR-203調(diào)控AML細(xì)胞增殖和凋亡。

3.1.2f-circRNA與AML 腫瘤細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性會引起染色體易位，導(dǎo)致非同源染色體重排，形成融合基因組。融合基因經(jīng)常發(fā)生在白血病和實體腫瘤中，是重要的腫瘤標(biāo)志物。在AML中，t(15;17)易位形成PML-RARa，而t(9;11)易位形成MLL/AF9，在PML/RARα和MLL/AF9融合基因形成過程中分別會形成衍生物f-circPR和f-circM9，這些f-circRNA與線性融合基因共同在急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)或其他亞型AML發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[13]。Greene等[14]發(fā)現(xiàn)敲除f-circM9和f-circPR可逆轉(zhuǎn)t(9;11)和APL的細(xì)胞表型，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提高對砷劑或阿糖胞苷藥物敏感性。以上研究結(jié)果提示，f-circRNA參與了AML發(fā)生和進(jìn)展。

3.2circRNA表達(dá)譜與AML亞型密切相關(guān) 核磷蛋白基因(NPM1)是AML最常見的突變基因之一。NPM1具有原癌基因和抑瘤特性，通過編碼多功能伴侶蛋白參與核糖體的生物合成、凋亡和細(xì)胞增殖。在AML中，NPM1基因第12外顯子突變導(dǎo)致HOX基因家族異常表達(dá)，從而促進(jìn)白血病的發(fā)生[15]。Hirsch等[16]檢測了NPM1野生型和突變型AML患者中的circRNA，并對健康人對照組和AML患者中circRNA的表達(dá)進(jìn)行了整體評估，結(jié)果顯示47.9%的高表達(dá)基因存在circRNA轉(zhuǎn)錄。其通過RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)，circ_0075001表達(dá)與NPM1表達(dá)呈正相關(guān)，分化成熟較差的M0和M1亞型circ_0075001的表達(dá)水平明顯高于分化成熟較好的M2、M4和M5。由此可見，circ_0075001表達(dá)水平與分子亞型和細(xì)胞分化成熟階段密切相關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，circ_0075001的高表達(dá)與Toll樣受體(TLR)信號通路相關(guān)基因呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。TLR不僅是先天免疫應(yīng)答的重要組成部分，也與AML患者白血病干細(xì)胞的存活分化中TLR1/TLR2通路的激活有關(guān)。而Marcucci等[17]研究表明，TLR信號通路基因的表達(dá)與AML中miRNA-181家族成員的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。由于NPM1基因包含miR-181的結(jié)合位點(diǎn)，因此可以推斷，NPM1可與miR-181家族成員相互作用，從而影響TLR信號通路相關(guān)基因的表達(dá)。

為了診斷和區(qū)分APL患者和正常核型AML患者，有學(xué)者[18]使用Acfs工具(accurate circRNA finder suite)分析了AML circRNA譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同分子亞型AML呈現(xiàn)特異性circRNA表達(dá)譜，表明運(yùn)用circRNA表達(dá)譜可以鑒別AML特殊亞型。HIPK2是核內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活因子，在AML的形成和發(fā)展過程中具有重要作用，而circ-HIPK2與APL細(xì)胞分化密切相關(guān)。Li等[19]研究表明，與正常對照及其他亞型AML相比，APL細(xì)胞中circ-HIPK2的表達(dá)水平明顯減低，但經(jīng)全反式維甲酸誘導(dǎo)分化后，circ-HIPK2表達(dá)水平又迅速升高，因此circ-HIPK2可以作為APL亞型標(biāo)志物。

3.3circRNA與AML的診斷 Yi等[20]研究發(fā)現(xiàn)，circ-VIM在AML中的表達(dá)水平較健康人對照組明顯升高，且與白細(xì)胞計數(shù)呈正相關(guān)；ROC曲線分析顯示，circ-VIM可作為AML患者與健康人鑒別診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。該circ-VIM表達(dá)不僅可以準(zhǔn)確區(qū)分AML、非APL AML和正常核型AML，而且其高表達(dá)能預(yù)示患者無病生存期和總生存期較短，也是1個獨(dú)立的預(yù)后不良因素。

Li等[21]對有髓外浸潤(EMI)和無髓外浸潤的AML患者以及健康志愿者同時進(jìn)行了circRNA微陣列分析，結(jié)果顯示，與非EMI患者相比，EMI-AML患者有253個circRNA和663個基因明顯上調(diào)，259個circRNA和838個基因明顯下調(diào)。其進(jìn)一步與健康對照者的circRNA表達(dá)譜比較發(fā)現(xiàn)，circ_0004277是AML患者最顯著下調(diào)的circRNA之一，可以將AML患者與健康個體進(jìn)行區(qū)分。因此，circRNA在AML中具有豐富的特異性，也可作為AML潛在診斷標(biāo)志物。

3.4circRNA可預(yù)測AML的耐藥和預(yù)后 Li等[21]研究結(jié)果顯示circ_0004277在正常核型AML患者中的表達(dá)顯著減低，化療緩解后其表達(dá)水平恢復(fù)正常，而復(fù)發(fā)時其表達(dá)水平又迅速減低，提示circ_0004277也可作為監(jiān)測AML病情檢測的重要指標(biāo)。

化療耐藥性是影響AML患者生存的重要原因之一。Shang等[22]利用高通量芯片比較了THP-1和阿霉素耐藥THP-1(THP-1/ADM)細(xì)胞系的circRNA表達(dá)譜，結(jié)果顯示49個circRNA在THP-1/ADM細(xì)胞系中呈異常表達(dá)，circ-PAN3在難治性/復(fù)發(fā)性AML患者中明顯上調(diào)，并證實該circRNA通過circ-PAN3-miR-153-5P/miR183-5P XIAP軸驅(qū)動AML耐藥。

FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase-3,FLT3)基因已被證實與AML預(yù)后密切相關(guān)，無FLT3-ITD或伴有FLT3-ITD低頻率突變預(yù)后良好，而伴有FLT3-ITD高頻率突變預(yù)后不良[23]。近期，有學(xué)者采用qPCR檢測證實，與非FLT3-ITD-AML患者相比，F(xiàn)TL3-ITD-AML 患者circMYBL2表達(dá)明顯上調(diào)。其進(jìn)一步研究證實，cirMYBL2可與RNA結(jié)合蛋白PTBP1結(jié)合，協(xié)助后者與FLT3/FLT3-ITD的相互作用，增強(qiáng)FLT3/FLT3-ITD的翻譯，從而促進(jìn)AML的進(jìn)展。相反，circMYBL2敲除后可抑制FLT3-ITD-AML的進(jìn)展，并降低FLT3-ITD-AML患者的化療耐藥[24]。

4 circRNA的檢測方法

自circRNA發(fā)現(xiàn)以來，人們已經(jīng)開發(fā)出各種工具驗證特定circRNA的存在，每種技術(shù)都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

4.1Northern blot Northern blot是檢測circRNA存在、大小和豐度最有說服力的方法，是檢測circRNA的金標(biāo)準(zhǔn)[25]。特異性circRNA的檢測可以通過跨越環(huán)狀剪切區(qū)域的短探針或者覆蓋整個環(huán)狀外顯子的長探針來完成，利用核糖核酸酶R(RNase R)降解線性RNA，探針與未被降解的circRNA結(jié)合。但是核小RNA(small nuclear RNA,snRNA)和組蛋白mRNA對RNase R具有天然抗性，有20%以上高表達(dá)的線性RNA不能被降解。因此，Xiao等[26]改良了RNase R純化circRNA的方法，在RNA末端添加poly(A)尾及使用Li+取代緩沖液中的K+，使mRNA被降解，從而能更有效地檢測circRNA。然而，Northern blot操作費(fèi)時費(fèi)力，并且使用放射性標(biāo)記的探針，不適用于中高通量篩選工作，不過，對于1個或幾個確定的circRNA的綜合分析，它提供了一種非常有價值的方法。

4.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 以RT-PCR為基礎(chǔ)，利用引物反向剪接位點(diǎn)(backsplice junction，BSJ)兩側(cè)上、下游的引物檢測circRNA，通常是驗證circRNA的首選方法。RT-qPCR可用于鑒定差異表達(dá)的circRNA的定量研究。微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是通過陽性液滴和陰性液滴的比率來決定circRNA的絕對濃度，不受滾環(huán)效應(yīng)影響，ddPCR可對circRNA進(jìn)行真正意義上的絕對定量分析[27]。ddPCR在circRNA定量方面比RT-qPCR更為準(zhǔn)確，特別在血漿等circRNA含量較少的樣本檢測方面，優(yōu)勢更為明顯。但是，ddPCR需要專門的設(shè)備且成本不菲。

4.3NanoString數(shù)字化基因檢測技術(shù)(NanoString technologies nCounter Analysis) 該技術(shù)基于單分子熒光顯微鏡計數(shù)的原理，適用于大量circRNA的篩選。針對所檢測circRNA的BSJ，分別設(shè)計特定生物素標(biāo)記的捕獲探針和報告探針，每個探針的靶序列正好是50個核苷酸。該技術(shù)不需要使用酶，不存在與PCR擴(kuò)增或cDNA合成相關(guān)的人為錯誤，且可同時篩選多達(dá)800個circRNA，隔夜雜交后，結(jié)果可在大約6 h完成。NanoString technologies nCounter有望成為circRNA檢測新的金標(biāo)準(zhǔn)[28]，但和ddPCR類似，該技術(shù)需要特定設(shè)備，檢測成本較高。

4.4RNA測序(RNA-seq) RNA-seq是發(fā)現(xiàn)新circRNA的首選方法[29],該方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過對其建庫、測序，獲得相應(yīng)circRNA的結(jié)構(gòu)、序列及表達(dá)量。其優(yōu)點(diǎn)是有較高的敏感性、準(zhǔn)確性及相當(dāng)高的通量，并可以發(fā)現(xiàn)新的circRNA，但它的成本很高，分析需要足夠的計算能力和生物信息學(xué)專業(yè)知識。

4.5基因芯片 基因芯片技術(shù)對生物信息學(xué)專業(yè)知識需求較少，是檢測circRNA的另一種可行方法[30]。該技術(shù)將大量探針分子固定在支持物上，與目標(biāo)circRNA進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號強(qiáng)度獲取數(shù)據(jù)，它可以一次性對大量circRNA進(jìn)行檢測和分析，從而解決傳統(tǒng)Northern blot費(fèi)時費(fèi)力、通量小等不足。但該方法同樣成本不菲，且只能檢測已知circRNA。

5 小結(jié)及展望

circRNA具有普遍、穩(wěn)定、特異等特點(diǎn)，并在AML等白血病形成和發(fā)展過程中具有重要作用，circRNA在血液、體液中可穩(wěn)定檢測，對于AML等血液腫瘤來說，具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢，不僅可運(yùn)用于AML診斷和分型診斷，還可用于監(jiān)測AML的療效和預(yù)測風(fēng)險。新circRNA的不斷發(fā)現(xiàn)，circRNA新的生物學(xué)作用的不斷揭示，為人類認(rèn)識和攻克AML提供了新的思路和可能。當(dāng)然，人們對于circRNA的真正認(rèn)知才剛剛起步，circRNA在AML中如何進(jìn)行調(diào)控，哪些circRNA能為哪些亞型AML提供精確診斷、準(zhǔn)確預(yù)測預(yù)后以及有效治療靶點(diǎn)，解決這些問題，仍需要將來廣泛而深入地探索。