15株杜氏藻形態(tài)與生理生化特征分析

宋 韡，徐 璐，湯麗群，陳慶彬*

（1.山西體育職業(yè)學(xué)院，山西太原 030006；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006）

0 引言

杜氏藻（Dunaliella）簡(jiǎn)稱鹽藻，屬于綠藻門、綠藻綱、杜氏藻科、杜氏藻屬[1]，是一類單細(xì)胞嗜鹽微藻[2]。屬于光合自養(yǎng)型生物[3]，可合成葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、β-胡蘿卜素等多種色素。

當(dāng)前，杜氏藻在生物醫(yī)藥、食品加工、生物柴油等領(lǐng)域的商業(yè)開發(fā)潛力巨大，可生產(chǎn)天然的、產(chǎn)量可觀的β-胡蘿卜素、甘油、藻多糖、多不飽和脂肪酸、多種活性酶類、維生素等等高附加值產(chǎn)品[4]。此外，杜氏藻還具有固定碳的作用，能夠有效地減緩溫室效應(yīng)[5]，因此，杜氏藻也成為生產(chǎn)生物質(zhì)能的研究熱點(diǎn)[6]。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于杜氏藻屬的研究多僅限于模式藻種或少數(shù)常見(jiàn)藻種的形態(tài)學(xué)鑒定、耐鹽機(jī)制和系統(tǒng)發(fā)育或分類學(xué)研究[7]，對(duì)于不同來(lái)源、不同品系的杜氏藻生理生化特征的研究卻很少。本研究對(duì)15株杜氏藻株進(jìn)行5個(gè)典型的生理生化指標(biāo)測(cè)定，研究結(jié)果將為特色藻株的篩選、功能的開發(fā)、特色資源的定向選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種的培養(yǎng)

通過(guò)在國(guó)內(nèi)鹽水水域采樣及國(guó)外藻種庫(kù)的購(gòu)置，共獲得15株杜氏藻，即D.primolecta編號(hào)Ds-1（英國(guó)，CCAP，藻種庫(kù)），D.maritima編號(hào)Ds-2，D.peircei編號(hào)Ds-3，D.viridis編號(hào)Ds-4，D.bioculata編號(hào)Ds-5，D.quartolecta編號(hào)Ds-6，D.parva編號(hào)Ds-7，D.salina編號(hào)Ds-8，D.polymorpha編號(hào)Ds-9，D.tertiolecta編號(hào)Ds-10，D.acidophila編號(hào)Ds-11，D.bioculata_C33編號(hào)Ds-12（美國(guó)，UTEX，藻種保藏中心），D.salina_42編號(hào)Ds-13美國(guó)，UTEX，藻種保藏中心，Dunaliella sp編號(hào)Ds-14（英國(guó)，CCAP，藻種庫(kù)），D.apiculata編號(hào)Ds-15（美國(guó)，UTEX，藻種保藏中心）。將15株杜氏藻用Dunaliella medium（D.m）培養(yǎng)基進(jìn)行室內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)[8-9]。

1.2 吸光值的測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)的觀察

利用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（TU-1810，北京普析通用有限責(zé)任公司，中國(guó)）測(cè)定686 nm處的吸光值[10]，間隔兩天測(cè)定一次。

1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

參考Markou和Muylaert[11]對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定方法，采用攜式PAM葉綠素?zé)晒鈨x（AquaPen-CAP-C 100，北京易科泰科技有限公司，中國(guó)）進(jìn)行測(cè)定。

1.4 葉綠素及類胡蘿卜素含量的測(cè)定

參考Mera[12]的方法測(cè)定665 nm、649 nm、470 nm的吸光值，通過(guò)公式可計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的含量。

1.5 藻多糖的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[13-14]測(cè)定藻多糖含量，480 nm處測(cè)定溶液的吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算藻多糖濃度。

1.6 β-胡蘿卜素含量的測(cè)定

在452 nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算β-胡蘿卜素含量[15]。

1.7 牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPS）酶活的測(cè)定

在450 nm處測(cè)定其吸光值，按照GGPS酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算藻細(xì)胞GGPS總酶活和單細(xì)胞酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)值測(cè)定

15株杜氏藻的Fv/Fo和Fv/Fm數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)相似，即Fv/Fo和Fv/Fm數(shù)值變化曲線均為先增加后降低，D2、D6、D8、D14的Fv/Fo和Fv/Fm在第8天達(dá)到最大，D1、D7、D9、D10、D13的Fv/Fo和Fv/Fm在第11天達(dá)到最大，D3、D5、D6、D11、D12、D15的Fv/Fo和Fv/Fm在第15天達(dá)到最大。這表明15株杜氏藻的光合效率整體變化趨勢(shì)較為一致，但部分藻株的某個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)的光合效率略有差異性。

2.2 葉綠素及類胡蘿卜素含量測(cè)定

整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，15株杜氏藻的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量的整體變化趨勢(shì)為逐漸上升。其中，Ds-6和Ds-8的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的累積量最大（葉綠素a含量為16~17 mg/L，葉綠素b含量為9.1~10.2 mg/L，類胡蘿卜素含量為6.3~6.4 mg/L），Ds-15的葉綠素a和類胡蘿卜素的累積量最?。ㄈ~綠素a含量為7.30 mg/L，類胡蘿卜素含量為1.881 mg/L）。這表明15株杜氏藻中葉綠素和類胡蘿卜素合成含量具有差異性，但整體變化趨勢(shì)相同，都隨時(shí)間逐漸積累，其中Ds-6和Ds-8可作為研究杜氏藻中葉綠素和類胡蘿卜素代謝機(jī)制的供試藻種。

2.3 藻多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量

葡萄糖濃度與480 nm吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.0034x-0.0094，相關(guān)系數(shù)為0.9957。分別測(cè)定15株杜氏藻在生長(zhǎng)成熟期的藻多糖含量。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，Ds-4的胞內(nèi)多糖含量最高，可選育作為研究藻多糖對(duì)抗腫瘤研究的原材料，Ds-15的胞內(nèi)多糖含量最低。

2.4 β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量

β-胡蘿卜素濃度與470 nm吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=0.2687x-0.0051，相關(guān)系數(shù)為0.9945。分別測(cè)定處于對(duì)數(shù)期和成熟期的15株杜氏藻的β-胡蘿卜素含量。結(jié)果，成熟期的杜氏藻β-胡蘿卜素含量高于對(duì)數(shù)期。對(duì)數(shù)期時(shí)Ds-1的β-胡蘿卜素含量最高，為5.13×10-2mg/ml；Ds-13的β-胡蘿卜素含量最低，為1.27×10-2mg/ml；成熟期時(shí)Ds-4的β-胡蘿卜素含量最高為11.37×10-2mg/ml，Ds-15的β-胡蘿卜素含量最低為4.3×10-2mg/ml。

2.5 牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPS）酶活的測(cè)定

D14的GGPS單細(xì)胞酶活力最高，表明GGPS基因的表達(dá)量較高，適合用來(lái)進(jìn)行杜氏藻GGPS基因的深入研究。

15株杜氏藻的總酶活在對(duì)數(shù)期均高于成熟期。采用SPSS軟件對(duì)GGPS總酶活與β-胡蘿卜素含量進(jìn)行逐步回歸分析，結(jié)果顯示：對(duì)數(shù)期和成熟期的顯著性相關(guān)值分別為0.981和0.961，表明二者關(guān)系為正相關(guān)。

3 結(jié)語(yǔ)

藻株葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素及β-胡蘿卜素含量均隨時(shí)間而逐漸累積，其葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化均為先上升后下降。15株杜氏藻中篩選獲得的Ds-1，其β-胡蘿卜素含量最高，可用于工業(yè)生產(chǎn)β-胡蘿卜素；篩選獲得的Ds-4成熟期多糖含量最高，可用于杜氏藻多糖對(duì)的生物醫(yī)藥研究；Ds-14中GGPS酶活力最強(qiáng)，可用于杜氏藻類胡蘿卜素代謝機(jī)制的研究。盡管15株杜氏藻胞內(nèi)GGPS酶活隨時(shí)期的增長(zhǎng)而降低，但其總酶活與β-胡蘿卜素含量呈正相關(guān)，推測(cè)杜氏藻胞內(nèi)除GGPS外，其β-胡蘿卜素的合成代謝還受其它多種酶類，如GGPP合成酶、八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素脫氫酶、ζ-胡蘿卜素脫氫酶、類胡蘿卜素異構(gòu)酶、15-順式-ζ-異構(gòu)酶、番茄紅素β-環(huán)化酶的協(xié)同調(diào)控。本研究深入分析了不同類型杜氏藻株的生理和生化特征，篩選獲得了特色的杜氏藻資源，研究結(jié)果將為該類藻資源的功能開發(fā)與利用奠定理論基礎(chǔ)。