分子生物學(xué)技術(shù)在污水處理微生物檢測(cè)中的應(yīng)用研究

劉新生 ， 許立成

（德州學(xué)院，山東 德州 253023）

隨著社會(huì)的快速發(fā)展，處理污水的方法越來越多，出現(xiàn)很多先進(jìn)技術(shù)，相對(duì)于傳統(tǒng)污水處理，新技術(shù)能夠高質(zhì)量、高效率地處理生活污水，避免造成水資源浪費(fèi)，并能循環(huán)使用。利用分子生物學(xué)處理技術(shù)，可以有效改善傳統(tǒng)處理方法存在的一些弊端，更準(zhǔn)確地對(duì)生物菌群進(jìn)行科學(xué)合理的培養(yǎng)，滿足國(guó)家對(duì)污水處理的要求。

1 污水當(dāng)中微生物

城市的地下水污染嚴(yán)重，但很多人都沒有認(rèn)識(shí)到這一問題的嚴(yán)重性。人們將大量的生活垃圾和生產(chǎn)廢水投入到地下水，導(dǎo)致水中存在很多有害物質(zhì)和一些微生物。相關(guān)調(diào)查顯示，污水中活性污泥內(nèi)含有大量的微生物，主要包括真菌、細(xì)菌、原生動(dòng)物等，其中菌的種類多樣，多是一些游離細(xì)菌，這些微生物可以將污水中的有機(jī)物快速分解和吸附，來維持正常生長(zhǎng)。此外，污泥中還存在部分原生動(dòng)物，有變形蟲、鐘蟲等。很多研究人員將活性污泥比作一個(gè)小型世界，里面具有各種各樣的微生物，要求在實(shí)際工作中，相關(guān)人員要充分掌握各個(gè)微生物的特點(diǎn)以及形態(tài)，并掌握原生動(dòng)物在處理污水時(shí)的表現(xiàn)。

2 污水處理微生物檢測(cè)流程

開展污水處理微生物檢測(cè)工作，應(yīng)要測(cè)定化學(xué)需氧量，其方法原理為：在強(qiáng)酸性溶液中，投入適當(dāng)?shù)倪€原性物質(zhì)，并以大量的重鉻酸鉀作為指示劑，之后利用硫酸亞鐵銨溶液回滴，檢測(cè)人員根據(jù)其用量來算出水樣中耗氧量。檢測(cè)流程為：先將進(jìn)水樣、出水樣充分搖勻，準(zhǔn)備3 個(gè)磨口的錐形瓶，并對(duì)其按順序編號(hào)，向其中加入6 顆玻璃珠，之后向瓶中分別加入20 mL 的蒸餾水、5 mL 的進(jìn)水樣（再加入15 mL 的蒸餾水）、20 mL 的出水樣，再向里面加入等量的重鉻酸鉀非標(biāo)液，并要用其多次清洗移液管，然后將瓶子放置到電子萬用爐中，并將冷凝管中灌滿自來水，切記自來水水流量不要過大，之后用冷凝管的上半部分別向3 個(gè)瓶子內(nèi)加入30 mL 的硫酸銀，最好用25 mL 的小量筒，保證操作的精準(zhǔn)度。上述步驟結(jié)束后，應(yīng)將電子萬用爐通電，并加熱兩個(gè)小時(shí)，加熱結(jié)束后，將其冷卻適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，之后向3 個(gè)瓶子內(nèi)加入90 mL 的蒸餾水，主要是為了減少實(shí)驗(yàn)誤差以及顯色更加明顯。加入蒸餾水后會(huì)放熱，之后取回錐形瓶冷卻，然后向瓶?jī)?nèi)分別滴入適當(dāng)?shù)膩嗚F靈指示劑，并將其充分混合，再滴入適當(dāng)?shù)牧蛩醽嗚F銨，滴完之后，要及時(shí)記錄相應(yīng)的數(shù)據(jù)，計(jì)算出準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

除此之外，進(jìn)行污水處理微生物檢測(cè)流程，還要進(jìn)行生化需氧量的測(cè)定、懸浮性固體物質(zhì)的測(cè)定、總磷的測(cè)定、總氮的測(cè)定等等，是一項(xiàng)非常繁復(fù)且重要的工作，相關(guān)檢測(cè)人員應(yīng)該充分認(rèn)識(shí)到此項(xiàng)工作的重要性，不斷提高自己的專業(yè)技能。

3 分子生物學(xué)技術(shù)在污水處理微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 DNA重組技術(shù)

相對(duì)于其他分子生物學(xué)技術(shù)，此技術(shù)出現(xiàn)時(shí)間較早，被人們廣泛熟知，應(yīng)用領(lǐng)域較為廣泛，但也存在一些弊端，如沒能緊跟時(shí)代的腳步，沒有被及時(shí)更新。重組技術(shù)主要是將獨(dú)立的DNA全部有序連接到一起，創(chuàng)造一個(gè)獨(dú)特的環(huán)境，進(jìn)行DNA復(fù)制工作，但在進(jìn)行此操作時(shí)，應(yīng)該遵守相應(yīng)的程序。首先，要選擇適當(dāng)?shù)腄NA；其次，再選擇載體處理，處理工作結(jié)束后，將整個(gè)載體連接；最后，把連接物輸入到合理的細(xì)胞中開始重組工作，獲得新的DNA 后需要進(jìn)行篩選工作，從而開展陽性克隆，至此整個(gè)重組流程結(jié)束[1]。

重組DNA 技術(shù)主要包括以下5 個(gè)步驟：1）取得目的基因；2）和克隆載體充分連接，充分生成新的DNA；3）利用新的DNA 分子轉(zhuǎn)變成為受體細(xì)胞，并且具有復(fù)制和遺傳等功能；4）對(duì)轉(zhuǎn)化分子進(jìn)行挑選和鑒定；5）將外源基因的細(xì)胞培養(yǎng)，從而獲得需要的遺傳性狀。目前，獲得充足DNA 片段的方法有：通過采用限制酶獲得需要的平整末端的DNA 片段，或者采用化學(xué)方法合成，能夠通過蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序知道相應(yīng)的遺傳密碼，之后利用密碼通過化學(xué)方法人工合成，從而獲取到所需的基因。

進(jìn)行污水處理微生物檢測(cè)工作時(shí)，指示菌是確保工作順利進(jìn)行的關(guān)鍵之處，具有重要意義，對(duì)生存環(huán)境中相關(guān)物質(zhì)的變化也較為敏感，能夠?yàn)榧夹g(shù)人員提供一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。若想充分熟知污水中組成成分的變化情況，應(yīng)該及時(shí)采用指示菌，不僅可以提高工作效率，還能明確分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，讓技術(shù)人員了解DNA 重組技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，可以將特定的基因重新組合在一起，從而完成微生物檢測(cè)工作。但在進(jìn)行此操作時(shí)，禁止將指示菌放在固定的地方，可以根據(jù)實(shí)際工作情況，將其放在合理的位置，全方位監(jiān)控，并能了解其基因工程菌的特點(diǎn)。在相關(guān)技術(shù)人員不斷處理的情況下，利用冰草氨酸等物質(zhì)，把微生物從環(huán)境樣品中順利提取，之后進(jìn)行靈敏性測(cè)試。

3.2 寡核苷酸探針技術(shù)

寡核苷酸探針技術(shù)主要優(yōu)勢(shì)為，可以將探針設(shè)計(jì)成不同的特異性，從而達(dá)到獲取群落結(jié)構(gòu)信息的目的，但由于FISH 檢測(cè)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，過度依賴探針的特異性，致使探針的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)非常重要。采用此技術(shù)能夠充分了解遺傳信息，從而發(fā)現(xiàn)菌落的組成結(jié)構(gòu)，獲取微生物的各種信息。以DNA 和RNA 的排序?yàn)榛A(chǔ)，針對(duì)特定的微生物，能夠在實(shí)際檢測(cè)過程中，發(fā)現(xiàn)其排序不同，得到不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，多數(shù)實(shí)驗(yàn)可以利用探針來熟知所要檢測(cè)細(xì)胞的RNA。進(jìn)行探針的研究中，可以發(fā)現(xiàn)部分區(qū)域之間存在互補(bǔ)關(guān)系，相關(guān)技術(shù)人員要嚴(yán)格注重檢測(cè)的工作環(huán)境，確保能夠處在合適的條件下進(jìn)行工作，從而保證實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜻_(dá)到預(yù)期效果[2]。

其中，寡核苷酸探針技術(shù)的熒光原位雜交使用較為廣泛，在生活中比較常見，若將分子生物學(xué)技術(shù)的準(zhǔn)確性和顯微鏡的可視性進(jìn)行組合，可以有效提高工作效率。熒光原位雜交技術(shù)在微生物檢測(cè)中能夠進(jìn)行不同類型的鑒定，因此受到廣泛技術(shù)人員的喜愛。除此之外，其應(yīng)用到污水處理中，可以了解污水中微生物的種類，還能清楚其分布位置，可以幫助技術(shù)人員快速進(jìn)行污水檢測(cè)。開通雜交探針的熒光信號(hào)，進(jìn)而對(duì)核酸序列開展檢測(cè)工作，相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，此技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。FISH 技術(shù)與其他技術(shù)的充分結(jié)合，也能為促進(jìn)環(huán)境微生物學(xué)的研究工作提供很大的幫助。研究人員在應(yīng)用PCR-DGGE 結(jié)合測(cè)序技術(shù)和FISH 技術(shù)，研究?jī)呻A段限氧自氧硝化中，結(jié)果表明，在亞硝酸鹽積累的過程中，亞硝化單胞菌屬占據(jù)氨氧化細(xì)菌的75%。此技術(shù)與共聚焦激光掃描顯微鏡和多光子顯微鏡的應(yīng)用，能夠得到十分清晰的圖像。

3.3 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)的工作模式已經(jīng)不能滿足人們的工作要求，跟不上時(shí)代的腳步，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法很容易受到外界因素干擾，不能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。采用分子生物學(xué)技術(shù)能夠有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足之處，其中限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析效果最明顯，技術(shù)人員為了獲得更多有價(jià)值的菌落基因信息，要仔細(xì)進(jìn)行多態(tài)性分析，若將其很好地利用，可以把不同的特征進(jìn)行分離，很大程度優(yōu)化工作流程，節(jié)省操作時(shí)間，還能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

相對(duì)于傳統(tǒng)生物技術(shù)在處理污水中微生物的檢測(cè)工作時(shí)出現(xiàn)的一些問題，利用此方法能有效避免這一現(xiàn)象的出現(xiàn)。例如，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法很難大量培養(yǎng)微生物，可以正常生長(zhǎng)的細(xì)菌更是少之又少，致使污水處理工作存在很大的問題，從而造成大量水資源浪費(fèi)現(xiàn)象，而此技術(shù)可以優(yōu)化操作流程。因此，要不斷創(chuàng)新生物學(xué)技術(shù)，及時(shí)采取當(dāng)前先進(jìn)技術(shù)。相關(guān)管理部門要重視技術(shù)的創(chuàng)新工作，為技術(shù)人員的正常工作提供保障。現(xiàn)如今，人們?cè)絹碓街匾暛h(huán)境問題，國(guó)家也加大整治力度，只有不斷更新檢測(cè)技術(shù)，才能促進(jìn)我國(guó)穩(wěn)定發(fā)展[3]。

3.4 DNA生物傳感器

生物傳感器設(shè)計(jì)的主要目的為固定化生物層與目標(biāo)污染物之間的專一性，由于生物的催化原理和免疫原理，在環(huán)境領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，主要工作是對(duì)生物層和目標(biāo)的污染物進(jìn)行信息傳遞，能夠檢測(cè)到敏感物質(zhì)。利用DNA 檢測(cè)，可以加快檢測(cè)污水物的傳感過程，其不僅可以應(yīng)用到相關(guān)核酸檢測(cè)工作中，還能在微量污染物的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用，并在研究DNA 和污染物之間的關(guān)系中起到相互作用，讓人們意識(shí)到污染物中存在有毒物質(zhì)。研究人員開發(fā)出來DNA 雜交生物傳感器并用于環(huán)境樣品的微生物檢測(cè)，例如污水中的病原菌的檢測(cè)，此類研究主要包括核酸探針固定化優(yōu)化、雜交反應(yīng)條件等，進(jìn)行雜交過程中，應(yīng)該注意與DNA 片段按堿基配對(duì)原則，尤其要注意影響雜交反應(yīng)動(dòng)力的各種因素，如離子強(qiáng)度、探針長(zhǎng)度等等。若將其內(nèi)部應(yīng)用先進(jìn)技術(shù)，其得到的圖像會(huì)更加清晰，提高最終檢測(cè)結(jié)果的精確性，雖然整個(gè)工作流程較為復(fù)雜，考驗(yàn)技術(shù)人員的耐心，但隨著其不斷改變，也在很大程度上優(yōu)化具體步驟。技術(shù)人員還應(yīng)該注意其雜交步驟很容易受到各種因素的干擾，如外界原因、人工操作問題等，尤其要注意雜交反應(yīng)動(dòng)力，才能保證技術(shù)的高度專一[4]。

3.5 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

該技術(shù)屬于一種特別的DNA 片段技術(shù)，出現(xiàn)時(shí)間較早，能夠加快體外酶擴(kuò)增速度，當(dāng)在實(shí)際工作中采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，要利用特異寡核苷酸作為基礎(chǔ)，還要參照目的基因，完成DNA 體外合成反應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生明顯現(xiàn)象，從而產(chǎn)生過多的目的基因。根據(jù)此技術(shù)，可以體現(xiàn)出分子生物學(xué)技術(shù)具有很強(qiáng)的特異性，靈敏度較高，進(jìn)行污水中微生物檢測(cè)工作較為方便，但還存在條件限制，只適用于微生物的核酸工作，還要利用酶促的作用，加快DNA 的合成和擴(kuò)增速度[5]。目前，使用最頻繁的分子生物學(xué)技術(shù)主要有兩種，RT-PCR 和競(jìng)爭(zhēng)性PCR。前者主要用于相關(guān)病毒的檢測(cè)工作，后者是一種定量的檢測(cè)方法[6-9]。

4 總結(jié)

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)也在不斷改進(jìn)，取得了社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益的雙豐收。污水中存在較多的微生物，采用分子生物學(xué)技術(shù)能夠提高污水處理技術(shù)水平，還與人們的生活息息相關(guān)，在有效改善人類生活環(huán)境的同時(shí)，還極大地提升了人們的生活水平。