合成生物學(xué)在水稻基因工程及遺傳改良中的應(yīng)用研究進(jìn)展

王 爽，何 勇，童曉紅，應(yīng)杰政，田志宏*，王以鋒

（1.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心/澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北荊州 434025；2.中國(guó)水稻研究所/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 311400）

合成生物學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)為研究基礎(chǔ)，利用基因工程和工程學(xué)概念人工設(shè)計(jì)和改造現(xiàn)有的生物系統(tǒng)，以獲得具有新功能生物體系的一門(mén)學(xué)科。近些年，合成生物學(xué)已成為農(nóng)作物改良的重要手段和焦點(diǎn)領(lǐng)域，在提高農(nóng)作物產(chǎn)量、增強(qiáng)作物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等方面發(fā)揮著重要作用。

水稻是世界重要的主糧之一，它高度自交、花粉壽命短，作為轉(zhuǎn)基因受體具有生態(tài)安全可控的特性。水稻作為合成生物學(xué)的載體具有以下明顯優(yōu)勢(shì)：1）水稻易儲(chǔ)存且蛋白不易因變性降解等導(dǎo)致功能損失；2）水稻產(chǎn)量較高，是我國(guó)居民的主食，在水稻上進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)加強(qiáng)是提升全民健康的最便捷方式；3）作為真核生物，水稻具有類(lèi)似人和動(dòng)物的加工修飾系統(tǒng)，可以保證下游產(chǎn)物的活性；4）水稻高度自交是轉(zhuǎn)基因生態(tài)安全的重要保證。本文綜述了合成生物學(xué)在水稻生物反應(yīng)器上取得的一系列進(jìn)展。

1 生物醫(yī)藥方面的研究

1.1 人血清白蛋白

人血清白蛋白（Human scrum albumin，HSA）是一種可溶性、球狀和非糖基化的單體蛋白，主要作為類(lèi)固醇、脂肪酸和甲狀腺激素的載體蛋白，在穩(wěn)定細(xì)胞外液方面起著重要作用。HSA 在臨床上廣泛用于治療嚴(yán)重?zé)齻?、失血性休克、低蛋白血癥和肝腹水等，也被用于癌癥和艾滋病的輔助治療［1-2］。在過(guò)去的幾十年中，各種表達(dá)系統(tǒng)被用來(lái)產(chǎn)生HSA，包括大腸桿菌［3］、釀酒酵母［4］、乳桿菌［5］、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物［6］、轉(zhuǎn)基因植物［7-8］，雖然在這些系統(tǒng)中成功地表達(dá)了HSA，但它們都沒(méi)有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高效、低成本的目標(biāo)。Yang 等成功地在水稻種子中表達(dá)重組人血清蛋白（rHSA），rHSA 水平達(dá)到水稻籽?？偪扇苄缘鞍椎?0.58%，大規(guī)模生產(chǎn)rHSA 產(chǎn)生的蛋白純度＞99%，生產(chǎn)率為2.75 g·kg-1糙米［9-10］。將得到的OsrHSA 與眾人血漿中提取的血清蛋白（pHSA）進(jìn)行各項(xiàng)物理指標(biāo)的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)它們具有高度的一致性。在促進(jìn)大鼠細(xì)胞生長(zhǎng)和治療肝硬化方面，OsrHSA 的效率與pHSA 相似。此外，OsrHSA 在體外和體內(nèi)的免疫原性與pHSA相似。

1.2 人胰島素樣生長(zhǎng)因子1

人胰島素樣生長(zhǎng)因子1（Human insulin-like growth factors 1，hIGF-1）是一種由70 個(gè)氨基酸組成的單鏈小肽，是調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、存活和代謝的主要生長(zhǎng)因子［11］。臨床上，hIGF-1 用于有效治療生長(zhǎng)激素（GH）受體缺乏、GH 不敏感綜合征、hIGF-1 基因缺失或GH 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷的患者［12］。此外，hIGF-1可有效用于治療1 型和2 型糖尿病或嚴(yán)重胰島素抵抗綜合癥患者［13］。Xie 等通過(guò)轉(zhuǎn)基因水稻植株在種子中高度積累重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子1（rhIGF-1），達(dá)到種子總蛋白的（6.8±0.5）%［14］，相當(dāng)于每粒（136±10）μg。功能分析表明，rhIGF-1 的融合作用在體外可刺激人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的增殖。動(dòng)物試驗(yàn)表明，糖尿病小鼠口服未加工的轉(zhuǎn)基因種子可顯著提高血漿IGF-1水平，降低血糖。

1.3 纖維素生長(zhǎng)因子

纖維素生長(zhǎng)因子（Fiber growth factor，F(xiàn)GFs）是一類(lèi)蛋白質(zhì)家族，與肝素結(jié)合多肽在結(jié)構(gòu)和生物活性上相似。到目前為止，已經(jīng)分離出23 種不同的FGFs［15］。堿性纖維生長(zhǎng)因子（Basic fibroblast growth facto，bFGF）是FGFs 的一種，它是一種單鏈蛋白，能刺激NIH/3T3 細(xì)胞的增殖，抑制干細(xì)胞的分化，并可能因其體外增殖，遷移和改變?nèi)藲獾榔交〖?xì)胞收縮表型的能力而在治療哮喘中發(fā)揮重要作用［16］；在臨床上，bFGF 廣泛應(yīng)用于加速傷口愈合，也用于心血管和神經(jīng)退行性疾病的有效組織修復(fù)和傷口愈合等方面［17-18］。An 等成功地在水稻胚乳中表達(dá)了重組bFGF，表達(dá)水平達(dá)到99.11～185.66 mg·kg-1糙米［19］，進(jìn)一步的研究表明，OsrbFGF 對(duì)NIH/3T3 細(xì)胞增殖具有相同的刺激作用。純化的FGF 與其他測(cè)試產(chǎn)品也具有相同的體內(nèi)傷口愈合效果。

1.4 乳鐵蛋白

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是80 kDa 鐵結(jié)合糖蛋白的轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一個(gè)成員，具有單個(gè)多肽鏈和兩個(gè)鐵結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由乳腺、唾液腺和胰腺分泌，在人（1.0～3.0 mg·mL-1）和哺乳動(dòng)物的初乳中含量最高。LF是一種多功能蛋白，具有多種生物活性，包括抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)鐵的吸收、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等，被認(rèn)為是一種新型抗菌、抗癌藥物和極具開(kāi)發(fā)潛力的食品和飼料添加劑。Nandi 等將一種合成人乳鐵蛋白（HLF）的基因與水稻的glutelin 1啟動(dòng)子結(jié)合轉(zhuǎn)入水稻中，得到了rHLF 表達(dá)水平為4.5～5.5 g·kg-1糙米的轉(zhuǎn)基因水稻，并且能在水稻中穩(wěn)定遺傳［20-21］。進(jìn)一步分析表明，rHLF 與人類(lèi)HLF 在一系列的生化和生物物理指標(biāo)高度相同。該產(chǎn)品目前已經(jīng)商業(yè)化，名稱(chēng)為L(zhǎng)acromin。

1.5 人溶菌酶

人母乳中含有50～400 μg·mL-1溶菌酶（Homan iysozyme，Hlys），這種酶是母乳中最豐富的蛋白質(zhì)之一，可作為一種具有殺菌作用的天然抗感染物質(zhì)，在抗菌、抗病毒、止血、消腫止痛及加快組織恢復(fù)功能等方面具有重要的作用。Huang 等通過(guò)利用Gt-1啟動(dòng)子及其信號(hào)肽區(qū)域構(gòu)建了Hlys基因相應(yīng)的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入水稻中成功表達(dá)了rHlys［22］。溶菌酶的表達(dá)水平達(dá)到糙米重量的0.6%或可溶性蛋白的45%，并能在后代中穩(wěn)定遺傳。

2 疫苗生產(chǎn)方面的研究

2.1 豬蛔蟲(chóng)病疫苗

豬蛔蟲(chóng)病是由于豬蛔蟲(chóng)寄生在豬體內(nèi)，導(dǎo)致生豬發(fā)育不良，嚴(yán)重者發(fā)育停滯，甚至造成死亡。該病在世界各地都存在并且相對(duì)廣泛，是一種危害養(yǎng)豬業(yè)極為嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病，給養(yǎng)殖戶(hù)經(jīng)濟(jì)收入造成巨大的壓力。Yasunobu 等在胚乳特異性GluB-1啟動(dòng)子的控制下，在水稻胚乳中表達(dá)As16（Ascaris suum 16，一種豬蛔蟲(chóng)的保護(hù)性抗原）［23］。這種抗原以與霍亂毒素（CT）B 亞單位CTB 的嵌合融合蛋白的形式被生產(chǎn)，表達(dá)水平達(dá)到50 μg·g-1糙米。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，將含有As16 的水稻種子喂食小鼠，會(huì)引發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生As16特異性的血清抗體免疫應(yīng)答。雖然疫苗的佐劑配方導(dǎo)致未能繼續(xù)提高特異性免疫應(yīng)答，但重組As16能誘導(dǎo)抗體表達(dá)，表明利用水稻胚乳生產(chǎn)該疫苗具有可行性。

2.2 阿爾茨海默病疫苗

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）亦稱(chēng)老年癡呆癥，是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要導(dǎo)致認(rèn)識(shí)障礙。AD 的發(fā)生被認(rèn)為是由于淀粉樣β 肽（Aβ）沉積在大腦皮層［24］，由于Aβ是一種蛋白質(zhì)，AD疫苗是潛在的治療或預(yù)防手段。Yoshida 等將Aβ 基因與綠色熒光蛋白（GFP）結(jié)合后轉(zhuǎn)到水稻中，得到的轉(zhuǎn)基因水稻中Aβ-GFP 融合蛋白最高可達(dá)400 μg·g-1糙米［25］。通過(guò)將含有Aβ-GFP 融合蛋白的糙米喂給小鼠來(lái)評(píng)價(jià)Aβ 水稻的免疫原性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服Aβ 米引起小鼠血清抗Aβ 抗體滴度升高，并且煮熟的Aβ 米并不會(huì)降低疫苗的有效性，從而允許其作為一種可食用的疫苗使用，因此Aβ 水稻可作為一種有效地預(yù)防阿爾茨海默病的疫苗。

3 膳食營(yíng)養(yǎng)改良方面的研究

植物營(yíng)養(yǎng)素和微量營(yíng)養(yǎng)素在人體的營(yíng)養(yǎng)與健康中起著重要作用，但它們往往在不同主食中表現(xiàn)不同程度的缺乏。此外，一些有利于健康的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也在糧食作物中缺乏。因此，合成生物學(xué)對(duì)于提高糧食作物的營(yíng)養(yǎng)健康物質(zhì)含量具有重要的應(yīng)用潛力。迄今為止，通過(guò)合成生物學(xué)的方法已經(jīng)開(kāi)發(fā)出富含類(lèi)胡蘿卜素的“黃金大米”［26-27］、富含花青素的“紫晶米”［28］、富含蝦青素的“蝦青米”［29］等。

3.1 富含花青素的“紫晶米”

花青素屬于生物類(lèi)黃酮物質(zhì)，而黃酮物質(zhì)最主要的生理功能是清除自由基和抗氧化能力，可以作為天然色素和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)用到食品著色劑、抗衰老化妝品、保健等方面。Zhu 等開(kāi)發(fā)一種高效的轉(zhuǎn)基因堆積載體系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)構(gòu)建了一個(gè)由胚乳特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的8 個(gè)花青素相關(guān)基因（來(lái)自玉米的2 個(gè)調(diào)控基因和來(lái)自錦紫蘇的6個(gè)結(jié)構(gòu)基因），加上一個(gè)可選擇的標(biāo)記和一個(gè)用于標(biāo)記切除的基因；將該載體轉(zhuǎn)入水稻中產(chǎn)生了一種新的“紫色胚乳稻”（紫晶米）；其在胚乳中具有較高的花青素含量和抗氧化活性［28］。該研究為多基因堆積提供了一個(gè)高效、通用的工具包，可應(yīng)用于復(fù)雜生物合成途徑，在合成生物學(xué)和改善植物農(nóng)藝性狀方面具有顯著的應(yīng)用潛力。

3.2 富含類(lèi)胡蘿卜素的“黃金大米”

類(lèi)胡蘿卜素（carotenoids）是一類(lèi)重要的脂溶性植物營(yíng)養(yǎng)素，動(dòng)物自身不能合成類(lèi)胡蘿卜素，故在促進(jìn)人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)和健康方面起著重要作用。流行病學(xué)研究表明，類(lèi)胡蘿卜素可以降低多種癌癥、代謝綜合征、肥胖、白內(nèi)障及黃斑變性等疾病的發(fā)病率［30］。Ye 等將來(lái)自水仙花的八氫番茄紅素合酶（phytoene synthase，psy）基因和來(lái)自細(xì)菌中的crtI基因轉(zhuǎn)入水稻中，成功獲得了在水稻胚乳中類(lèi)胡蘿卜素含量達(dá)到1.6 μg·g-1的“黃金大米”［27］。Paine 等為了提高類(lèi)胡蘿卜素的含量，將不同植物來(lái)源的psy基因在玉米的愈傷組織中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)玉米和水稻的psy基因?qū)е骂?lèi)胡蘿卜素含量最高，胡蘿卜、番茄、胡椒、擬南芥的psy表現(xiàn)為中間功效，水仙花psy表現(xiàn)最低；他們又將玉米、番茄、胡椒、水稻和水仙花psy的cDNAs 轉(zhuǎn)入水稻，發(fā)現(xiàn)在T1代種子種類(lèi)胡蘿卜素含量最高的是玉米（14 μg·g-1）和水稻（18 μg·g-1），胡椒或番茄psy產(chǎn)生中間的類(lèi)胡蘿卜素含量，而水仙花psy產(chǎn)生的含量最低（1.2 μg·g-1），這與玉米愈傷中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［26］。

蝦青素（astaxanthin）是一種紅色酮類(lèi)化合物，是一種類(lèi)胡蘿卜素，也是類(lèi)胡蘿卜素合成的最高級(jí)別產(chǎn)物。在自然界，蝦青素具有最強(qiáng)的抗氧化性。蝦青素主要在一些微藻、細(xì)菌和酵母中合成，但在大多數(shù)高等植物和動(dòng)物中不合成，因此人類(lèi)主要從一些海洋食物中獲得蝦青素，如鮭魚(yú)、貝類(lèi)和鱒魚(yú)。Zhu 等利用自己開(kāi)發(fā)的TransGene Stacking II（TGS II）將蝦青素合成途徑的sZmpsy1，sPaCrtI，sCrBKT和sHpBHY四個(gè)基因轉(zhuǎn)入水稻中，在水稻胚乳中建立了蝦青素生物合成途徑，使得蝦青素在胚乳中富集，并且具有較高的抗氧化活性［29］。

4 農(nóng)藝性狀改良方面的研究

據(jù)聯(lián)合國(guó)經(jīng)濟(jì)與社會(huì)事務(wù)部預(yù)測(cè)，至2050年，全球人口將增至97億。如果農(nóng)作物產(chǎn)量依然維持在現(xiàn)有水平，屆時(shí)，人類(lèi)必將面臨嚴(yán)重的糧食短缺局面。因此，提高農(nóng)作物產(chǎn)量、改良農(nóng)藝性狀就變得尤為重要。植物的產(chǎn)量與光合作用的效率緊密相關(guān)，因此，提高農(nóng)作物的光合作用效率是關(guān)鍵。Shen 等將水稻自身的三個(gè)基因：OsGLO3（乙醇酸氧化酶）、OsOXO3（草酸氧化酶）和OsCATC（過(guò)氧化氫酶）組合在一起成功構(gòu)建了一條新的光呼吸支路，簡(jiǎn)稱(chēng)GOC 支路；將該支路轉(zhuǎn)化到水稻（GOC 植物）中，通過(guò)這三種酶在葉綠體的作用可以將乙醇酸依次完全氧化成CO2，形成一種類(lèi)似C4植物的光合CO2濃縮機(jī)制；GOC 植物的光合效率、生物量、氮含量和籽粒產(chǎn)量等均得到顯著增強(qiáng)；該研究還發(fā)現(xiàn)，GOC 水稻在高光條件下更有優(yōu)勢(shì)［31］。

5 問(wèn)題與展望

雖然合成生物學(xué)在水稻中已經(jīng)取得一系列重大進(jìn)展，但是仍然存在諸多困難和挑戰(zhàn)。比如在利用水稻胚乳生產(chǎn)藥用蛋白方面，目前除HIys、LF 和HSA 已在生產(chǎn)中應(yīng)用外，多存在表達(dá)水平低、純化生產(chǎn)成本較高等問(wèn)題，導(dǎo)致產(chǎn)業(yè)化困難。

從分子生物學(xué)的角度來(lái)看，目前提高水稻胚乳中活性蛋白產(chǎn)量主要的方法在于提高特異性啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率，以及特異的增強(qiáng)合成活性蛋白的表達(dá)積累。

而在合成代謝產(chǎn)物方面，主要問(wèn)題是了解生物體中的代謝途徑和關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。盡管有越來(lái)越多的植物基因組被測(cè)序，但由于缺乏有效的基因功能注釋?zhuān)沟煤茈y確定編碼完全代謝途徑中關(guān)鍵酶的基因組成。而且組成的合成代謝產(chǎn)物很可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)育和生長(zhǎng)異常。同時(shí)，代謝途徑容易受到反饋調(diào)節(jié)等因素的影響。

隨著全球氣候變暖，極端天氣頻繁出現(xiàn)而可能引發(fā)的糧食危機(jī)，大力發(fā)展新的科學(xué)技術(shù)保障世界糧食安全日趨緊迫。水稻作為世界上主要的糧食作物之一，改良其農(nóng)藝性狀尤為迫切，目前利用合成生物學(xué)原理提高植物的光合效率是當(dāng)前進(jìn)一步大幅度提高水稻產(chǎn)量的有效手段。如何改造、優(yōu)化當(dāng)前光合作用系統(tǒng)，使得光能利用效率提高進(jìn)而增加作物產(chǎn)量，仍是需要我們解決的重大問(wèn)題。相信合成生物學(xué)的研究將在提高水稻產(chǎn)量、增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等方面發(fā)揮重要作用。