RNA N6-甲基腺苷修飾的研究方法綜述

劉飛燕

武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 湖北 武漢 430072

引言

RNA是遺傳信息傳遞的重要一環(huán)，具有非常重要的生理功能。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)RNA上的修飾對(duì)于RNA的功能具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。m6A是腺嘌呤（A）第6位氮原子處發(fā)生甲基化形成的修飾，該修飾廣泛存在于mRNA和非編碼RNA上，是mRNA上最普遍的修飾[1]。mRNA的修飾過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞核中，其被甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物甲基化形成m6A，甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物被稱(chēng)為m6A的編寫(xiě)器，包括異源二聚體甲基轉(zhuǎn)移酶樣3-甲基轉(zhuǎn)移酶樣4（METTL3-METTL14）催化核心，還有腎母瘤細(xì)胞1相關(guān)蛋白（WTAP）、KIAA1429蛋白、RNA結(jié)合基序蛋白15（RBM15）及其旁系同源物RBM15b、鋅指蛋白ZC3H13等。然而，m6A修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過(guò)程，它也可以被FTO、ALKBH5等的脫甲基酶（擦除器）去除[2]。能夠識(shí)別并結(jié)合m6A修飾的蛋白被稱(chēng)為m6A的閱讀器，現(xiàn)在已鑒定到的閱讀器包括最早發(fā)現(xiàn)的YTHDF1，YTHDF2，YTHDF3，還有細(xì)胞核蛋白YTHDC1，HNRNPC，HNRNPG，HNRNPA2B1，核質(zhì)共存蛋白YTHDC2，以及細(xì)胞質(zhì)中的IGF2BPs，F(xiàn)MR1等，這些閱讀器蛋白可以調(diào)節(jié)mRNA的幾乎整個(gè)生命周期，包括翻譯、降解、剪接、出核、結(jié)構(gòu)開(kāi)關(guān)等[3-4]。m6A通過(guò)其編寫(xiě)器、擦除器、閱讀器調(diào)控著細(xì)胞的各個(gè)生命過(guò)程，對(duì)腫瘤發(fā)生、癌癥細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、晝夜節(jié)律、精子發(fā)生等都有影響[5]。

自20世紀(jì)70年代首次發(fā)現(xiàn)m6A，在長(zhǎng)達(dá)半個(gè)世紀(jì)的過(guò)程中，對(duì)m6A的研究一直處于相對(duì)停滯的狀態(tài)，原因是缺乏有效檢測(cè)m6A的方法，隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是高通量測(cè)序時(shí)代的到來(lái)，m6A的檢測(cè)方法越來(lái)越豐富，對(duì)m6A鑒定的準(zhǔn)確性也越來(lái)越高，接下來(lái)，我將按照實(shí)驗(yàn)方法的技術(shù)特點(diǎn)對(duì)幾種主要的m6A檢測(cè)方法進(jìn)行簡(jiǎn)要概述。

1 定性方法

1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）應(yīng)用非常廣泛，其相對(duì)于柱色譜（LC）技術(shù)的改進(jìn)主要是由低壓玻璃柱換成了高壓金屬柱，提高了檢測(cè)效率。1974年，Desrosiers等人在放射性標(biāo)記的Novikoff肝癌細(xì)胞中純化了mRNA，利用液相色譜法首次發(fā)現(xiàn)了mRNA上的m6A修飾，后續(xù)長(zhǎng)達(dá)幾十年幾乎都用此方法對(duì)m6A進(jìn)行研究[6]?；驹頌槭紫壤妹赶痬RNA并純化，將其解離為不同的RNA核苷組分，各組分依次經(jīng)過(guò)色譜柱及檢測(cè)器，檢測(cè)器將各組分的生物信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)輸出得到色譜圖，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的比較，鑒定各種組分。HPLC由于在分析之前對(duì)RNA進(jìn)行了處理，可能會(huì)改變?cè)糝NA結(jié)構(gòu)，但是該方法操作簡(jiǎn)單、成本低，可有效定性檢測(cè)RNA的m6A修飾，至今仍然被廣泛使用。

1.2 MeRIP-seq

高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為m6A檢測(cè)方法的研究開(kāi)辟了新道路，Meyer等人將m6A特異性甲基化的RNA免疫沉淀技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了用以檢測(cè)m6A在轉(zhuǎn)錄組上位置信息的MeRIP-seq方法[7]。該方法首先對(duì)總RNA進(jìn)行RiboMinus處理以去除核糖體RNA，然后將其打斷成小片段，利用特異性結(jié)合m6A修飾的抗體與磁珠耦聯(lián)，再將磁珠與RNA進(jìn)行孵育，從而捕獲具有m6A修飾的RNA片段，最后進(jìn)行高通量測(cè)序。需同時(shí)進(jìn)行對(duì)照組實(shí)驗(yàn)以消除免疫沉淀過(guò)程中的背景，對(duì)得到的測(cè)序數(shù)據(jù)分析后，得到轉(zhuǎn)錄組中m6A位點(diǎn)信號(hào)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)m6A主要存在于mRNA的編碼區(qū)（CDS）及3‘非翻譯區(qū)（3’UTR），在內(nèi)含子和5‘非翻譯區(qū)及基因間也存在少量修飾，其在終止密碼子區(qū)域具有一個(gè)強(qiáng)烈的富集信號(hào)。MeRIP-seq由于其可高通量獲得m6A的位置信息，現(xiàn)已成為研究m6A機(jī)制和功能的主要方法之一。

1.3 MiCLIP

MeRIP-seq可將m6A修飾定位于mRNA上的100-200nt的區(qū)域內(nèi)，仍無(wú)法精準(zhǔn)定位到單個(gè)堿基，為了檢測(cè)到mRNA上m6A的精確位置，Linder等人開(kāi)發(fā)了m6A單核苷酸分辨率交聯(lián)和免疫沉淀方法（miCLIP）[8]。該方法基于紫外線(xiàn)（254nm）交聯(lián)特異性結(jié)合m6A的抗體和RNA，并在反轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生特征性突變，從而鑒定m6A的精確位置。一種特征性突變?yōu)锳bcam抗體以高度位置特異性誘導(dǎo)的m6A共有基序“DRACH”中的C突變?yōu)門(mén)，另一種為SySy抗體在m6A的+1位誘導(dǎo)的cDNA截短，前者可以對(duì)單個(gè)或者成簇的m6A位置進(jìn)行精準(zhǔn)定位，后者可以同時(shí)檢測(cè)m6A修飾以及新型RNA修飾m6Am。MiCLIP方法不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，得到的結(jié)果可靠，已越來(lái)越多地應(yīng)用于對(duì)m6A的研究。

2 定量方法

2.1 斑點(diǎn)印記技術(shù)

斑點(diǎn)印記技術(shù)不僅可以用來(lái)定量檢測(cè)m6A修飾，還可以檢測(cè)DNA，RNA和蛋白質(zhì)，其與蛋白印記（western）技術(shù)原理類(lèi)似，但是操作更為簡(jiǎn)單，效率更高[9]。斑點(diǎn)印記技術(shù)首先需要在提取細(xì)胞總RNA后純化poly(A) RNA，接下來(lái)無(wú)須進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳步驟，可直接使用Bio-Dot微濾裝置（Bio-Rad）將純化后RNA樣品滴加到尼龍膜上形成圓點(diǎn)，然后用UV照射交聯(lián)，后續(xù)的脫脂奶粉封閉、孵育洗滌一抗二抗、放射自顯影等步驟皆與western技術(shù)類(lèi)似，最后可利用Media Cyber netics等軟件對(duì)每個(gè)點(diǎn)的相對(duì)信號(hào)密度進(jìn)行檢測(cè)，從而定量m6A修飾[10-11]。該方法可以驗(yàn)證m6A的存在，也可以比較不同樣品之間m6A修飾的量，但是并不能對(duì)單個(gè)樣品進(jìn)行精確定量。斑點(diǎn)印記技術(shù)是初步定量m6A的基礎(chǔ)方法，由于其成本低，易操作，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為驗(yàn)證m6A的主要方法之一。

2.2 電化學(xué)免疫傳感器方法

為了更簡(jiǎn)單又靈敏地定量檢測(cè)生物樣品中的m6A，Yin等人開(kāi)發(fā)了一種電化學(xué)免疫傳感器的方法，該方法以N6-甲基腺苷5’-三磷酸（m6ATP）作為檢測(cè)目標(biāo)分子[12]。具體檢測(cè)策略為：先制備用以放大信號(hào)的銀納米顆粒和帶有胺-聚乙二醇3-生物素的SiO2納米球（Ag @ SiO2），該納米復(fù)合材料會(huì)被鏈霉親和素捕獲。然后依次將玻碳電極（GCE）、石墨烯-AuNPs（GR-Au）、MPBA、抗m6A抗體、生物樣品（含m6ATP）、磷酸標(biāo)記的生物素、鏈霉親和素、Ag @ SiO2連接，制備生物傳感器。最后將生物傳感器浸入硝酸溶液中，根據(jù)Ag氧化的電流信號(hào)得到m6A濃度的生物信號(hào)，從而對(duì)生物樣品進(jìn)行m6A定量檢測(cè)。電化學(xué)免疫傳感器方法便捷、成本低、特異性強(qiáng)、靈敏度高，已對(duì)多種人細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)了高精度m6A檢測(cè)。

2.3 m6A-LAIC-seq

同一個(gè)基因的不同轉(zhuǎn)錄本上的m6A修飾不盡相同，特定基因的甲基化轉(zhuǎn)錄本與非甲基化轉(zhuǎn)錄本的比例稱(chēng)為m6A水平，不同轉(zhuǎn)錄本m6A水平的檢測(cè)對(duì)于m6A與轉(zhuǎn)錄本的功能研究具有重要的參考意義。m6A水平和亞型特征測(cè)序（m6A-LAIC-seq）是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組m6A水平和轉(zhuǎn)錄本亞型的主要方法，與MeRIP-seq不同，該方法在進(jìn)行poly(A) RNA純化后，不會(huì)將RNA片段化，抗m6A抗體可以捕獲到完整的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，將m6A陽(yáng)性的轉(zhuǎn)錄本與m6A陰性的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序后，通過(guò)計(jì)算得到不同轉(zhuǎn)錄本的m6A水平及亞型信息[13]。m6A-LAIC-seq雖然不能定量單個(gè)核苷酸的甲基化修飾，但可以定量分析每個(gè)基因中的m6A水平，又由于其特異性好，靈敏度高，重復(fù)性好，因此成為檢測(cè)m6A的主要方法之一，對(duì)m6A與轉(zhuǎn)錄本的定量研究提供了新的視角。

3 結(jié)束語(yǔ)

對(duì)RNA上m6A的檢測(cè)及功能的研究是近年來(lái)興起的研究領(lǐng)域，由于m6A在RNA的廣泛存在，其功能復(fù)雜且重要。隨著m6A閱讀器蛋白的發(fā)現(xiàn)，m6A修飾的下游分子機(jī)制也逐漸受到關(guān)注，但是由于檢測(cè)方法的限制，仍有許多功能機(jī)制尚不清楚。除了上文闡述的m6A的幾種檢測(cè)方法，還有薄層色譜分析法、MazF RNA核酸內(nèi)切酶定量分析法等也是檢測(cè)m6A的常用方法，這些方法存在著局限性，例如無(wú)法對(duì)數(shù)量稀少的樣本進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法精確定量每個(gè)RNA上的m6A修飾數(shù)量[14-15]。三代測(cè)序技術(shù)（SMRT技術(shù)和納米孔測(cè)序技術(shù)）的發(fā)展可以逐漸彌補(bǔ)這些局限，其可以對(duì)原始全長(zhǎng)RNA進(jìn)行直接測(cè)序，但由于三代測(cè)序技術(shù)仍不夠成熟，還存在準(zhǔn)確度不夠高，通量不夠大的問(wèn)題。相信隨著測(cè)序技術(shù)及生物信息技術(shù)的不斷革新，關(guān)于m6A的功能機(jī)制將會(huì)越來(lái)越清晰。