馬氏珠母貝肉提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的影響

王利霞，章超樺,2，高加龍,2，鄭惠娜,2，曹文紅,2，秦小明,2，陳建平,2

馬氏珠母貝肉提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的影響

王利霞1，章超樺1,2，高加龍1,2，鄭惠娜1,2，曹文紅1,2，秦小明1,2，陳建平1,2

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 // 國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江）// 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 // 廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室 // 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2. 大連工業(yè)大學(xué)海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

【】探討馬氏珠母貝（）肉提取物對小鼠急性酒精性肝損傷（alcoholic liver disease，ALD）的解酒護(hù)肝作用。采用堿溶酸沉法提取貝肉蛋白質(zhì)，酶解超濾后制備截留分子質(zhì)量為< 3 ku（F-Ⅰ）、3 ～ 8 ku（F-Ⅱ）、> 8 ku（F-Ⅲ）的超濾組分，同時采用水提法制備馬氏珠母貝肉全臟器水提物。以急性酒精性肝損傷小鼠為模型，以小鼠血清生化指標(biāo)（谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶AST）、肝臟生化指標(biāo)（超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽GSH、甘油三酯TG、丙二醛MDA、乙醇脫氫酶ADH和乙醛脫氫酶ALDH）和肝臟病理切片為指標(biāo)評價各提取物對急性酒精性肝損傷的改善作用，并對抗肝損傷活性較高組分進(jìn)行氨基酸含量測定及質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定。與模型組相比，貝肉蛋白酶解超濾組分和水提物組均能極顯著降低小鼠血清中ALT和AST活性（< 0.01），降低肝臟中MDA、TG含量（< 0.05），顯著提高小鼠肝臟中SOD、GSH含量（< 0.05）、ADH、ALDH活性（< 0.01)，改善肝臟組織的病理狀況，緩解細(xì)胞壞死、炎癥等病理狀態(tài)。氨基酸檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)-Ⅰ組分及水提物中氨基酸組成全面，水提物中牛磺酸含量是F-Ⅰ組分的2倍左右。質(zhì)譜結(jié)果表明F-Ⅰ組分、水提物分別包含15、20種主要肽片段。馬氏珠母貝肉蛋白酶解超濾組分和水提物對急性ALD具備保護(hù)作用，其中F-Ⅰ組分、水提物效果更佳，其改善機(jī)制與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、促進(jìn)乙醇代謝能力有關(guān)。

馬氏珠母貝；酶解液；水提物；急性酒精性肝損傷

酒精性肝損傷（alcoholic liver disease，ALD）是一種由于長期濫用酒精而造成的肝損傷疾病。當(dāng)機(jī)體短時間過量飲酒時，會導(dǎo)致急性酒精性肝損傷，大量的酒精使得血液酒精含量增高，并常導(dǎo)致氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙以及乙醛等代謝物的生成等多種不良反應(yīng)[1]。因此加速酒精在機(jī)體中的分解可減少有害物質(zhì)在血液中的保留，對預(yù)防肝臟疾病和由酒精攝入引起的機(jī)體損害非常重要[2]。目前從陸生植物、動物和水產(chǎn)品中提取護(hù)肝活性物質(zhì)均已有報道[3-5]，其中對貝類解酒護(hù)肝活性物質(zhì)的研究越來越多，如三角帆蚌（）[6]、企鵝珍珠貝（）[7]、河蜆（）[8]、牡蠣（Oyster）[9]和馬氏珠母貝（）[10]等均被證明能顯著降低血液中乙醇濃度或改善酒精性脂肪肝。

馬氏珠母貝在我國主要分布于廣東、海南和廣西等南海海域[11]，是重要的經(jīng)濟(jì)貝類。馬氏珠母貝肉含有豐富的蛋白質(zhì)、糖原、氨基酸、肽類、維生素及Se、Zn等微量元素?，F(xiàn)代研究表明馬氏珠母貝多具有抗氧化、增強(qiáng)免疫[12]、促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合[13]、抗腫瘤、解酒護(hù)肝[10,14-15]等活性功效。

高加龍[14]報道，馬氏珠母貝肉全臟器酶解產(chǎn)物及?；撬峋哂薪饩坪涂辜毙跃凭愿螕p傷作用。韓麗娜等[10]證明，除牛磺酸外馬氏珠母貝肉中糖原也具有醒酒活性。鐘佳佳等[15]制備馬氏珠母貝肉全臟器酶解產(chǎn)物并進(jìn)行超濾分級，動物試驗(yàn)結(jié)果表明，分子質(zhì)量< 3 ku超濾組分具有較好的抗ALD活性，推測小分子肽起重要作用。貝肉全臟器酶解產(chǎn)物含有多肽、多糖、氨基酸等多種活性物質(zhì)，除糖原、?；撬嵬猓壳吧形匆婑R氏珠母貝中其他成分具有護(hù)肝活性的研究報道?；诖耍狙芯糠蛛x貝肉蛋白并制備蛋白酶解超濾組分，與貝肉全臟器水提物對照，以急性酒精性肝損傷小鼠為動物模型，探究各組分的護(hù)肝活性，并對護(hù)肝活性較強(qiáng)的組分進(jìn)行氨基酸組成、?；撬岷繙y定及多肽結(jié)構(gòu)分析，為進(jìn)一步明確醒酒護(hù)肝有效成分結(jié)構(gòu)和開發(fā)馬氏珠母貝肉抗酒精性肝損傷功能性食品提供研發(fā)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與實(shí)驗(yàn)動物 馬氏珠母貝采于廣東省雷州市流沙養(yǎng)殖場；殼長10 cm，開殼取全臟器，每500 g分裝于?80 ℃冰箱備用。

SPF級雄性健康KM小鼠，5周齡，購于廣州迪恩基因技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SCXK（京）20200004。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：廣東海洋大學(xué)SPF級動物房，溫度（24±2）℃，濕度50% ～ 60%，晝夜12 h/12 h交替，自由攝水進(jìn)食。

1.1.2 試劑與設(shè)備 56°二鍋頭白酒，北京紅星股份有限公司，市售；中性蛋白酶（2×105U/g）、木瓜蛋白酶（2×105U/g）購于廣西南寧龐博生物科技有限公司；水飛薊素購于上海源葉生物科技有限公司；乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

DU-1100型真空冷凍干燥機(jī)（日本東京理化器械株式會社）；Varioskan Flash型全自動酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技中國有限公司）；L-8900全自動凱氏定氮儀（德國格哈特分析儀器有限公司）；Thermo Lynx-6000型高速落地離心機(jī)（賽默飛世爾科技中國有限公司）；R-1005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；Q-EXACTIVE質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA）。

1.2 方法

1.2.1 馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)酶解超濾組分的制備

取馬氏珠母貝肉全臟器，解凍后按料液質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶3加入蒸餾水勻漿，將勻漿液用1 mol/L NaOH調(diào)pH至12，4 ℃下勻速攪拌3 h，在10 000 r/min、4 ℃下離心15 min，取上清液，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.5，4 ℃靜置1 h，10 000 r/min、4 ℃下離心15 min得馬氏珠母貝肉蛋白[16]。參照韓麗娜等[10]方法酶解制備馬氏珠母貝肉蛋白酶解液，將所得的酶解液依次通過截留分子質(zhì)量為8、3 ku的超濾膜，得到分子質(zhì)量> 8 ku（F-Ⅲ）、3 ～ 8 ku（F-Ⅱ）、< 3 ku（F-Ⅰ）的超濾組分，經(jīng)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 馬氏珠母貝肉水提物的制備 參照謝曉霞[17]方法并稍加修改制備馬氏珠母貝肉水提物。將馬氏珠母貝肉全臟器按料液質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶3加入水勻漿后置于沸水中煮沸30 min，迅速冷卻后以8 000 r/min離心15 min，收集上清液，經(jīng)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 體內(nèi)急性酒精性肝損傷小鼠模型建立 將49只5周齡KM小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成空白對照組、酒精模型組、水飛薊素組、水提物組、F-Ⅰ組、F-Ⅱ組、F-Ⅲ組，每組7只。其中水提物組、F-Ⅰ組、F-Ⅱ組、F-Ⅲ組每天按小鼠體質(zhì)量200 mg/kg的劑量[18]分別灌胃馬氏珠母貝肉水提物、F-Ⅰ組分、F-Ⅱ組分、F-Ⅲ組分，水飛薊素組以體質(zhì)量50 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)灌胃水飛薊素，空白對照組、酒精模型組則灌胃等體積生理鹽水。30 min后，各組小鼠分別按體質(zhì)量12 mL/kg劑量灌胃56°紅星二鍋頭，空白對照組給予等量生理鹽水，連續(xù)灌胃8 d[8]。每次灌胃前監(jiān)測小鼠體質(zhì)量。

1.2.4 小鼠肝臟指數(shù)及血清生化指標(biāo)測定 8 d灌胃完成后，禁食不禁水16 h，摘眼球取血并全血靜置15 min后，以3 000 r/min、4 ℃條件離心10 min取上清液，分裝貯于-80 ℃保存?zhèn)溆?。對小鼠脫頸處死，迅速摘取肝臟組織，記錄肝臟的體質(zhì)量（精確值0.01 g），肝臟指數(shù)（%）計(jì)算如下：

肝臟指數(shù)= 肝臟質(zhì)量 / 小鼠最終體質(zhì)量。

取每只小鼠肝臟相同部位約0.2 g，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛中固定，其余部分-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶AST的水平。

1.2.5 肝臟生化指標(biāo)測定 向肝臟組織中加入一定體積預(yù)冷的生理鹽水，勻漿制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%組織勻漿液，以3 000 r/min、4 ℃條件離心10 min，取上清液進(jìn)行分裝，按照試劑盒說明書測定肝臟上清液的蛋白濃度、ADH、ALDH、SOD、MDA、TG、GSH。

1.2.6 病理學(xué)檢查 將固定于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛溶液中的小鼠肝臟取出，經(jīng)常規(guī)清除及脫水后，石蠟包埋，通過蘇木精-伊紅染色，于顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.2.7 氨基酸含量測定 將貝肉提取物中活性較好組分進(jìn)行氨基酸組成測定，方法參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.124-2016[19]。

牛磺酸含量測定方法參照GB 5009.169-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中?；撬岬臏y定》[20]。

1.2.8 ESI MS/MS質(zhì)譜鑒定 樣品上機(jī)于串聯(lián)ESI質(zhì)譜儀。一級質(zhì)譜分辨率設(shè)置為70 000（質(zhì)荷比/半峰寬）。用碰撞能量為27的HCD（Higher Energy Collisional Dissociation）模式對肽段進(jìn)行篩選，二級碎片在Orbitrap中檢測，分辨率為17 500。每個峰強(qiáng)度超過20 000的一級母離子打15個二級譜圖，一級掃描和二級掃描交替進(jìn)行。動態(tài)排除設(shè)定為：15 s相同的母離子打二級不會超過2次。離子源電壓設(shè)置為1.6 kV。AGC（Automatic gain control）通過Orbitrap來實(shí)現(xiàn)，其設(shè)置為：對Orbitrap內(nèi)控制聚集量在1e5到3e6之間的離子進(jìn)行二級掃描鑒定。掃描的質(zhì)荷比（m/z）范圍為350 ～ 2 000。用Mascot search engine進(jìn)行肽段和蛋白的鑒定，并在數(shù)據(jù)庫搜索設(shè)置為：容錯率為一級20×10-6，二級0.1 u。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組數(shù)據(jù)平行測定3次，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用SPSS 20.0進(jìn)行單因素均值比較（ANOVA），選用LSD法進(jìn)行組間顯著性分析。#代表與空白組相比，有顯著差異（< 0.05），##代表與空白組相比，有極顯著差異（< 0.01），*代表與模型組相比，有顯著差異（< 0.05），**代表與模型組相比，有極顯著差異（< 0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬氏珠母貝各提取物對小鼠肝臟指數(shù)的影響

酒精的急劇攝入會導(dǎo)致肝臟受損、腫大，因此，肝臟指數(shù)常作為肝臟受損與否的觀測指標(biāo)之一。表1小鼠肝臟指數(shù)顯示，相較于空白組，模型組小鼠肝臟系數(shù)有顯著上升（< 0.05），增長了11.48%，給予樣品干預(yù)后，水飛薊素組、F-Ⅰ組小鼠的肝臟系數(shù)均顯著降低（< 0.05），其余各組雖有下降趨勢，但并無顯著差異（> 0.05），表明馬氏珠母貝肉提取物各組分能不同程度的緩解酒精造成的肝臟腫大問題。

2.2 馬氏珠母貝各提取物對小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶AST、谷草轉(zhuǎn)氨酶ALT活性的影響

由表2可知，與空白組相比較，模型組小鼠血清中ALT、AST的活性極顯著上升（< 0.01），說明造模成功。而與模型組相比，F(xiàn)-Ⅰ、F-Ⅱ、F-Ⅲ及水提物組均能極顯著降低ALT、AST的生成（< 0.01），結(jié)果表明，馬氏珠母貝肉提取物對酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

表1 馬氏珠母貝肉蛋白酶解物超濾組分和全臟器水提物對各組小鼠肝臟指數(shù)的影響

注：與空白組相比，#表示< 0.05；與模型組相比，*表示< 0.05；未標(biāo)標(biāo)識表示差異不顯著（> 0.05）；= 7

Notes：Compared to blank group, # means< 0.05; Compared to model group, * means< 0.05; The difference between the unmarked marks is not significant（> 0.05）;= 7

表2 馬氏珠母貝肉蛋白酶解物超濾組分和全臟器水提物對各組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

注：與空白組相比，##表示0.01；與模型組相比，*表示< 0.05, **表示< 0.01；= 7

Notes: Compared to blank group, ##,< 0.01; compared to model group, * means< 0.05, and ** means< 0.01;= 7

2.3 馬氏珠母貝各提取物對小鼠酒精代謝酶學(xué)指標(biāo)的影響

表3結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組中ADH、ALDH活性均有略微下降；與模型組相比，陽性對照水飛薊素組有顯著提升（< 0.01），馬氏珠母貝肉水提物、組分F-Ⅰ、F-Ⅱ、F-Ⅲ中ADH、ALDH活性均顯著上升（< 0.01），說明馬氏珠母貝肉提取物能夠提升乙醇代謝酶活性，促進(jìn)乙醇在肝臟中的代謝效率，緩解乙醇及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的損傷。

表3 馬氏珠母貝肉蛋白酶解物超濾組分和全臟器水提物對各組小鼠肝臟乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶活性的影響

注：與模型組相比，*表示< 0.05，**表示< 0.01；未標(biāo)標(biāo)識表示差異不顯著（> 0.05）；= 7

Notes: Compared to model group, *,< 0.05, **,< 0.01; the difference between the unmarked marks is not significant（> 0.05）;= 7

2.4 馬氏珠母貝各提取物對小鼠肝臟中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

由表4可知，與空白組相比，模型組小鼠肝臟中SOD水平、GSH水平極顯著下降（< 0.01），而MDA、TG含量極顯著上升（< 0.01），小鼠各項(xiàng)指標(biāo)水平的顯著變化表明造模達(dá)成。與模型組相比，水飛薊素組、水提物組、F-Ⅰ組能極顯著提高SOD、GSH的水平（< 0.01），F(xiàn)-Ⅱ組能顯著提升SOD水平（< 0.05），對于GSH水平無顯著改變（> 0.05），F(xiàn)-Ⅲ組中SOD、GSH水平無顯著變化（> 0.05）；而水飛薊素組、F-Ⅰ組、水提物、能顯著降低MDA（< 0.05）、TG（< 0.01）的含量，F(xiàn)-Ⅱ組能顯著降低MDA、TG含量（< 0.05），F(xiàn)-Ⅲ組對MDA含量無顯著變化（> 0.05），但能顯著降低TG含量（< 0.05）。上述結(jié)果表明，酒精導(dǎo)致小鼠的氧化應(yīng)激和肝氧化損傷，而經(jīng)馬氏珠母貝肉提取物干預(yù)后，各癥狀均明顯改善。

表4 馬氏珠母貝肉蛋白酶解物超濾組分和全臟器水提物對各組小鼠肝臟超氧化物歧化酶活性，谷胱甘肽、丙二醛、甘油三酯含量的影響

注：與空白組相比，##表示< 0.01；與模型組相比，*表示< 0.05，**表示< 0.01；未標(biāo)標(biāo)識表示差異不顯著（> 0.05）；= 7

Notes: Compared to blank group, ##,< 0.01; compared to model group, *,< 0.05, **,< 0.01; the difference between the unmarked marks is not significant（> 0.05）;= 7

2.5 馬氏珠母貝肉蛋白酶解物超濾組分和全臟器水提物組織病理學(xué)分析

圖1顯示，空白組肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列緊密，胞漿內(nèi)無脂滴，組織未見壞死、炎癥等其他病理改變；模型組肝細(xì)胞廣泛腫脹，有局部肝細(xì)胞灶性壞死，胞核溶解，胞漿嗜酸性增強(qiáng)，伴較多炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。與模型組相比，水飛薊素組，及馬氏珠母貝肉各提取物組肝組織細(xì)胞癥狀有所改善，其中水飛薊素組肝組織肝索結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞輕度腫脹，組織未見明顯脂肪變性；F-Ⅰ組肝細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞少量輕微腫脹，組織未見其他明顯異常；F-Ⅱ組肝細(xì)胞排列緊密，肝細(xì)胞廣泛腫脹，小葉偶見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死；F-Ⅲ組肝組織肝索結(jié)構(gòu)清晰，胞漿疏松淡染，小葉偶見幾處炎性細(xì)胞小灶性浸染，未見其他明顯異常；而水提物組肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞廣泛腫脹，未見其他明顯異常。組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明，各樣品提取物組肝細(xì)胞壞死有所減少，且細(xì)胞的界限完整，細(xì)胞形態(tài)有改善變好現(xiàn)象，F(xiàn)-Ⅰ組、水提物組更為明顯，可能是馬氏珠母貝肉超濾組分、水提物中和了肝損傷產(chǎn)生的自由基，增強(qiáng)了肝臟的抗氧化和抗炎能力，從而降低了乙醇引起的肝損傷[21]。

圖1 馬氏珠母貝肉蛋白酶解物超濾組分和全臟器水提物對各組小鼠肝臟HE染色的影響（n = 7）

2.6 馬氏朱母貝超濾組分F-Ⅰ及水提物氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果分析

選擇急性酒精性肝損傷小鼠指標(biāo)中活性較優(yōu)組分F-Ⅰ組及水提物組進(jìn)行氨基酸組成分析，結(jié)果見表5。在F-Ⅰ組、水提物組中的16種氨基酸中，F(xiàn)-Ⅰ組分天冬氨酸（10.22%）、谷氨酸（14.51%）、亮氨酸（8.86%）、賴氨酸（9.09%）質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，游離氨基酸中，亮氨酸（10.80%）、酪氨酸（7.51%）、苯丙氨酸（30.30%）、精氨酸（11.74%）質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，而水提物組分中，天冬氨酸（9.92%）、谷氨酸（17.70%）、甘氨酸（14.03%）、丙氨酸（8.81%）質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，游離氨基酸中，谷氨酸（16.85%）、甘氨酸（33.84%）、丙氨酸（15.21%）、精氨酸（11.78%）比例較高。同時，在水解氨基酸中，F(xiàn)-Ⅰ組分及水提物組分中必需氨基酸含量分別占總氨基酸含量的41.06%和29.16%，支鏈氨基酸占比分別為19.38%、13.81%，疏水性氨基酸占比分別為36.40%、31.47%。F-Ⅰ組分中?；撬豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.71%，水提物中牛磺酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.38%。

2.7 馬氏朱母貝超濾組分F-Ⅰ及水提物ESI-MS/ MS鑒定

經(jīng)ESI-MS/MS鑒定，F(xiàn)-Ⅰ組分中得分較高的蛋白質(zhì)，分別為putative actin 00526、putative paramyosin-3、myosin essential light chain，從其中挑選出15條多肽得分較高的多肽序列，結(jié)果見表6；水提物組分中得分較高的蛋白質(zhì)主要是tropomyosin-1 tropomyosin-2、putative actin 00526，從中挑選出20條得分較高的主要多肽序列。F-Ⅰ的多肽一級結(jié)構(gòu)多由6 ～ 14個氨基酸組成，水提物多肽由9 ～ 16個氨基酸組成。

注：*，必需氨基酸；#，疏水性氨基酸；-，未檢出

Note: *, Essential amino acids; #, Hydrophobic amino acids; -, Not detected

3 討論

ALT、AST是肝臟中兩種主要的轉(zhuǎn)氨酶，ALT主要存在于肝細(xì)胞漿中，80%的AST存在于肝細(xì)胞線粒體中。機(jī)體將乙醇代謝為乙醛的過程中，常伴有自由基和致癌物質(zhì)的產(chǎn)生，從而會刺激炎癥反應(yīng)，肝臟受到損傷[22]，肝細(xì)胞通透性增加，造成細(xì)胞質(zhì)中ALT酶活升高，滲透于血液中，若肝細(xì)胞出現(xiàn)更嚴(yán)重的壞死現(xiàn)象，其主要存在于線粒體中的AST酶也會釋放[22-23]。因此，ALT、AST酶含量的變化可反映肝臟中細(xì)胞的損傷及細(xì)胞膜功能完整性的喪失的程度[24]。本研究表明，模型組小鼠血清ALT、AST極顯著升高，病理組織切片呈現(xiàn)出局部肝細(xì)胞灶性壞死且伴較多炎性細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象，而馬氏珠母貝肉各提取物組能顯著降低ALT、AST的水平，且肝細(xì)胞壞死有所減少，細(xì)胞形態(tài)有改善變好現(xiàn)象。

酒精代謝主要包含三條途徑，其中最主要的是細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)上的乙醇脫氫酶系代謝途徑，80% ～ 90%的酒精都經(jīng)此途徑[25]。此過程中主要由兩種酶（ADH、ALDH）發(fā)揮作用，乙醇先通過ADH被催化生成乙醛，后被ALDH催化成為乙酸，乙酸在三羧酸循環(huán)中氧化成為二氧化碳和水[26]。本研究結(jié)果顯示，相比于空白組，模型組小鼠肝臟ADH、ALDH活性下降，與模型組比較，馬氏珠母貝肉各提取物組能顯著提升ADH、ALDH活性，酒精代謝增快。

乙醇代謝常常會伴有機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)抗氧化防御機(jī)制將有所降低，ROS生成的速率超過肝臟天然酶和非酶抗氧化劑中和它們的能力[27]，而過度的氧化損傷會引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝受到損害，損傷肝細(xì)胞。對于這種危害，機(jī)體內(nèi)酶促和非酶促的抗氧化反應(yīng)是防止氧化損傷主要手段之一，所以內(nèi)源性酶促抗氧化劑SOD及非酶抗氧化劑GSH常作為評價氧化應(yīng)激的指標(biāo)[28-29]，而TG、MDA是肝臟脂肪變性，脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，能夠破壞抗氧化防御系統(tǒng)，引起肝細(xì)胞變性，常用于評估脂質(zhì)代謝。在本研究中，模型組小鼠能顯著降低SOD、GSH水平，增加MDA、TG含量，而各提取物干預(yù)后，除F-Ⅲ組外，其余各組能明顯提升肝臟SOD、GSH活性，降低MDA、TG含量。該結(jié)果表明，馬氏珠母貝水提物和F-Ⅰ、F-Ⅱ超濾組分可通過提升抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過氧化減輕酒精產(chǎn)生的肝損傷。這一結(jié)論符合《保健食品檢驗(yàn)與評價規(guī)范》中判定物質(zhì)是否具有肝損傷輔助保護(hù)功能的要求，即肝臟MDA、GSH、TG三指標(biāo)中任意二指標(biāo)和病理組織學(xué)檢驗(yàn)為陽性才可判定受試樣品具有輔助保護(hù)功能[30]。

Xiao等[18]研究發(fā)現(xiàn)，包括Ala、Pro在內(nèi)的疏水性氨基酸和短肽的吸收可能導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)疏水性增加，激活A(yù)DH，促進(jìn)乙醇的代謝，而Leu、Ala、Arg等有助于NAD+的生成，增強(qiáng)酒精代謝能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，水提物組中游離氨基酸占總氨基酸含量的比例為21.14%，明顯高于F-Ⅰ組比例7.43%，其中水提物組Pro（5.89%）、Ala（15.21%）含量高于F-Ⅰ組Pro（0%）、Ala（6.34%）的含量。?；撬釡y定結(jié)果顯示，水提物中?；撬岬暮渴荈-Ⅰ超濾組分的2倍左右，王文杰等[31]發(fā)現(xiàn)，牛磺酸在一定程度上抑制小鼠酒精性肝損傷的發(fā)生。本研究中F-Ⅰ超濾組分和水提物均能夠顯著改善小鼠酒精性肝損傷癥狀，但二者并無顯著差異，說明馬氏珠母貝提取物中除牛磺酸外還含有其他護(hù)肝活性物質(zhì)。質(zhì)譜結(jié)果顯示，F(xiàn)-Ⅰ、水提物中肽段均至少包含一個疏水性氨基酸（Leu、Ala、Ile），其中F-Ⅰ80%的肽段序列中疏水性氨基酸的比例超過30%，而水提物中較高，有88%的序列超過。Zhao等[32]研究發(fā)現(xiàn)，人工合成疏水性肽經(jīng)驗(yàn)證具有激活A(yù)DH活性的能力，因此，F(xiàn)-Ⅰ組、水提物組中這些肽段可能具有較好的活性，活性大小與其肽分子質(zhì)量、肽鏈中疏水性氨基酸數(shù)目位置以及其構(gòu)型有關(guān)，但對于馬氏珠母貝護(hù)肝肽的具體結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理仍需進(jìn)一步闡明。

4 結(jié)論

馬氏珠母貝肉水提物、蛋白酶解超濾組分具有較好的抗ALD活性，能從加快乙醇代謝，減輕乙醇及其代謝產(chǎn)物對機(jī)體產(chǎn)生的氧化應(yīng)激危害等方面進(jìn)行抗ALD干預(yù)，對酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，可提高酒精代謝酶ADH、ALDH的活性，提高SOD、GSH的抗氧化指標(biāo)水平，降低血清代謝酶AST、ALT活性及脂質(zhì)代謝中MDA、TG的含量，改善肝臟組織病變，保持細(xì)胞的界限完整性及細(xì)胞形態(tài)。其中馬氏珠母貝肉水提物、蛋白酶解超濾組分F-Ⅰ（分子質(zhì)量< 3 ku）具有較顯著的保護(hù)作用，根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，分別從F-Ⅰ組、水提物分中挑選出15條以及20條主要的肽段，具備一定的活性潛能。

[1] REN J Y, SHA W Q, SHANG S M, et al. Hepatoprotective peptides purified fromand its effect against ethanol-induced LO2 cells injury[J]. International Journal of Food Science & Technology, 2021, 56(1): 352-361.

[2] HSIEH P S, CHEN C W, KUO Y W, et al.spp. reduces ethanol-induced liver oxidative stress and inflammation in a mouse model of alcoholic steatohepatitis[J]. Experimental and Therapeutic Medicine, 2021, 21(3): 188.

[3] LI R, LIANG T, HE Q L, et al. Puerarin, isolated from Kudzu root (Willd), attenuates hepatocellular cytotoxicity and regulates the GSK-3β/NF-κB pathway for exerting the hepatoprotection against chronic alcohol-induced liver injury in rats[J]. International Immunopharmacology, 2013, 17(1): 71-78.

[4] 胡濱, 李康林, 吳橋, 等. 豬血蛋白酶解物對小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(11): 185-190.

[5] 陳頔, 殷繼永, 黃建. 魚皮低聚肽對小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2021, 27(5): 47-52.

[6] 鐘佳佳, 章超樺, 高加龍, 等. 三角帆蚌肉酶解產(chǎn)物響應(yīng)面優(yōu)化制備及醒酒活性[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報, 2020, 40(3): 103-111.

[7] 左光揚(yáng), 章超樺, 高加龍, 等. 企鵝珍珠貝肉酶解產(chǎn)物的制備及其醒酒作用的初步研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(15): 145-148.

[8] 張帥, 章超樺, 高加龍, 等. 河蜆肉酶解產(chǎn)物解酒護(hù)肝功效[J]. 食品與機(jī)械, 2019, 35(3): 166-171.

[9] BYUN J H, CHOI Y J, CHOUNG S Y. Protective effect ofhydrolysate peptide in alcohol induced alcoholic fatty liver in SD-rats[J]. Planta Medica, 2016, 81(S1): S1-S381.

[10] 韓麗娜, 秦小明, 林華娟, 等. 馬氏珠母貝肉的醒酒作用機(jī)理初探[J]. 食品科技, 2010, 35(10): 180-183.

[11] 王愛民, 閻冰, 葉力, 等. 馬氏珠母貝不同地理種群內(nèi)自繁和種群間雜交子一代主要性狀的比較[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2003, 27(3): 200-206.

[12] 鄧志程, 張迪, 吉宏武, 等. 馬氏珠母貝免疫活性肽的純化與鑒定[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報, 2017, 37(4): 78-86.

[13] YANG F M, QIN X M, ZHANG T, et al. Effect of oral administration of active peptides ofon the repair of skin wounds[J]. Marine Drugs, 2019, 17(12): 697.

[14] 高加龍. 馬氏珠母貝肉中?；撬岬奶崛〖捌淇辜毙跃凭卸咀饔玫某醪窖芯縖D]. 湛江: 廣東海洋大學(xué), 2007.

[15] 鐘佳佳, 章超樺, 高加龍, 等. 馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物的抗酒精性肝損傷作用[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2020, 16(2): 107-114.

[16] 鄭惠娜, 張晶晶, 周春霞, 等. pH調(diào)節(jié)法提取牡蠣蛋白及氨基酸、蛋白組成分析[J]. 中國食品學(xué)報, 2014, 14(7): 230-235.

[17] 謝曉霞. 文蛤與藍(lán)蛤鮮味肽的呈味特性及其與鮮味受體T1R1/T1R3的分子作用研究[D]. 錦州: 渤海大學(xué), 2019.

[18] XIAO C Q, ZHOU F B, ZHAO M M, et al. Chicken breast muscle hydrolysates ameliorate acute alcohol-induced liver injury in mice through alcohol dehydrogenase (ADH) activation and oxidative stress reduction [J]. Food & Funcion, 2018, 9(2): 774-784.

[19] 國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會, 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定: GB 5009.124—2016[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2017.

[20] 中華人民共和國衛(wèi)生部, 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會. 食品中?；撬岬臏y定: GB/T 5009.169—2003[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2004.

[21] LI J Y, LIU C, GUO Y H, et al. Determination of the effects of torularhodin against alcoholic liver diseases by transcriptome analysis[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 143: 47-54.

[22] LI F Y, DUAN K M, WANG C L, et al. Probiotics and alcoholic liver disease: treatment and potential mechanisms[J]. Gastroenterology Research and Practice, 2016, 2016: 1-11.

[23] GUO R, REN J. Alcohol and acetaldehyde in public health: from marvel to menace[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2010, 7(4): 1285-1301.

[24] TUMA D J, CASEY C A. Dangerous byproducts of alcohol breakdown: focus on adducts[J]. Alcohol Research & Health, 2003, 27(4): 285-290.

[25] 李靜, 張朝輝, 段筱杉, 等. 大葉藻黃酮對酒精性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2016, 40(5): 799-806.

[26] MIR S M, SAHU B D, KONERU M, et al. Supplementation of oat (Avena sativa L) extract abates alcohol-induced acute liver injury in a mouse model[J]. Nutrition Research, 2018, (54): 80-92.

[26] MIR S M, SAHU B D, KONERU M, et al. Supplementation of oat (L.) extract abates alcohol-induced acute liver injury in a mouse model[J]. Nutrition Research, 2018, 54: 80-92.

[27] OSNA N A, DONOHUE T M, KHARBANDA K K. Alcoholic liver disease: pathogenesis and current management[J]. Alcohol Research, 2017, 38(2): 147-161.

[28] MALLIKARJUNA K, SHANMUGAM K R, NISHANTH K, et al. Alcohol-induced deterioration in primary antioxidant and glutathione family enzymes reversed by exercise training in the liver of old rats[J]. Alcohol, 2010, 44(6): 523-529.

[29] LI S, TAN H Y, WANG N, et al. The role of oxidative stress and antioxidants in liver diseases[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16(11): 26087-26124.

[30] 凌關(guān)庭. 保健食品原料手冊[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2002: 590-591.

[31] 王文杰, 王娜, 陳奕晨. ?；撬釋π∈缶凭愿螕p傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制的研究[J]. 中南藥學(xué), 2020, 18(1): 53-57.

[32] ZHAO R J, HUO C Y, QIAN Y, et al. Ultra-high-pressure processing improves proteolysis and release of bioactive peptides with activation activities on alcohol metabolic enzymesfrom mushroom foot protein[J]. Food Chemistry, 2017, 231: 25-32.

Improving Effect ofMeat Extract on Acute Alcoholic Liver Injury in Mice

WANG Li-xia1, ZHANG Chao-hua1,2, GAO Jia-long1,2, ZHENG Hui-na1,2, CAO Wen-hong1,2,QIN Xiao-ming1,2, CHEN Jian-ping1,2

（1.,////////,524088,; 2.,116034,）

【】To futher explore the active anti-alcoholic components inmeat.【】The ultrafiltration components with a molecular weight of < 3 ku (F-I), 3 ～ 8 ku (F-Ⅱ) and > 8 ku (F-Ⅲ) were prepared by enzymatic hydrolysis and ultrafiltration fractionation methods, by using the protein ofmeat extracted by alkali solution and acid precipitation method. Meanwhile, the whole viscera water extract of the shellfish was prepared by the water extraction method. Taking mice with acute alcoholic liver injury as the model, the improvement effect of each extract on the acute alcoholic liver injury was evaluated by serum biochemical indexes (alanine aminotransferase ALT, aspartate aminotransferase AST), liver biochemical indexes (superoxide dismutase SOD, glutathione GSH, triglyceride TG, malondialdehyde MDA, alcohol dehydrogenase ADH and aldehyde dehydrogenase ALDH) and liver pathological sections, and the amino acid content and mass spectrometry structure of components with high activity against liver injury were determined.【】Compared with the model group, the ultrafiltration groups and the water extract group could significantly reduce the ALT and AST activities in the serum of mice (< 0.01), reduce the contents of MDA and TG in the liver (< 0.05), and significantly increase the activities of SOD, GSH (< 0.05), ADH and ALDH in the liver of mice (< 0.01), improve the pathological condition of liver tissue, alleviate cell necrosis, inflammation and other pathological conditions. Amino acid detection results showed that the amino acid compositions of F-I fraction and water extract were comprehensive, and the taurine content in the water extract is about twice that of the F-I fraction; mass spectrometry results showed that F-I fraction and water extract contained 15 and 20 main peptide fragments, respectively.【】The ultrafiltration fractions and water extract ofhave protective effect on acute ALD, and the F-I fraction and water extract have better effect. The improvement mechanism is related to the enhancement of the antioxidant capacity and promotion of ethanol metabolism.

; enzymatic hydrolysis solution; water extract; acute alcoholic liver injury

Q939.11

A

1673-9159（2021）06-0099-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2021.06.012

王利霞，章超樺，高加龍，等. 馬氏珠母貝肉提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2021，41（6）：99-107.

2021-08-25

財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助（CARS-49）；廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品高值化加工與利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（GDOU2016030503）；海洋貝類營養(yǎng)健康食品關(guān)鍵技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化（GDOU2017052606）

王利霞（1998―），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品貯藏與加工。E-mail: 1271355028@qq.com

高加龍（1983―），男，博士，副教授，從事水產(chǎn)品精深加工研究。E-mail: Garonne@126.com

章超樺（1956―），男，博士，教授，從事水產(chǎn)品精深加工研究。E-mail: zhangch2@139.com

（責(zé)任編輯：劉朏）