謝夢琪 張詩雨 許荔立 蔣 飛 袁軍法, 吳志新, 陳孝煊,

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院, 武漢 430070; 2. 湖北省水生動物病害防控工程技術中心, 武漢 430070;3. 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實驗教學示范中心, 武漢 430070)

腸道微生物生活在動物胃腸道黏膜和內(nèi)容物中, 在長期的進化過程中, 與宿主之間形成了極為密切的關系。在正常生理狀態(tài)下, 腸道微生物之間通過相互作用維持著動態(tài)平衡, 共同影響宿主的營養(yǎng)、免疫、生產(chǎn)性能、生理狀態(tài)和疾病等過程[1,2]。研究表明, 許多腸道微生物可以分泌消化酶, 分解飼料中的淀粉和纖維素等物質(zhì), 為機體提供短鏈脂肪酸、氨基酸和維生素等[3], 促進機體的營養(yǎng)吸收[4]。許多微生物還可以促進宿主免疫系統(tǒng)(包括免疫細胞和免疫組織)的發(fā)育[5], 并通過影響?zhàn)つし置诿庖咔虻鞍?、非特異性免疫和免疫應答等過程提高機體的健康狀況[6]。因此, 維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)對提升宿主健康水平和促進宿主生長發(fā)育具有重要意義。

影響腸道菌群穩(wěn)態(tài)的因素有很多, 例如宿主基因型、性別、環(huán)境、生長階段和食物等。這在哺乳動物中已有廣泛研究, 在魚類中的研究也有較多報道[7—12]。在甲殼動物中, 有研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)成年雌性蟹的細菌群落多樣性高于雄性蟹, 不同生長階段各細菌比例不同, 優(yōu)勢細菌的豐度發(fā)生了顯著變化; 雌性和雄性蟹具有相同的優(yōu)勢細菌, 且菌群豐度隨生長階段發(fā)生的變化在雄蟹和雌蟹中顯示出一致的趨勢[13]。對蝦類腸道菌群的研究大多關注與疾病發(fā)生相關的微生物組成變化[14,15], 目前已有研究者對中國對蝦(Pe-naeus chinensis)、日本對蝦(Penaeus japonicus)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)和墨吉對蝦(Penaeus merguiensis)等蝦類早期發(fā)育階段的腸道菌群進行了分離鑒定[16—19]。但關于克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)腸道菌群在不同性別和不同生長階段之間的差異還未見報道。

克氏原螯蝦是一種淡水蝦類, 是我國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖蝦類之一[20]。本實驗通過16S rRNA高通量測序的方法, 對自然環(huán)境中不同性別的克氏原螯蝦以及實驗環(huán)境下不同生長階段的克氏原螯蝦腸道菌群組成及功能進行了分析, 為克氏原螯蝦生長過程中腸道益生菌的篩選及克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中益生菌制劑的研究提供科學依據(jù)和理論指導。

1 材料與方法

1.1 不同性別克氏原螯蝦腸道取樣

克氏原螯蝦樣品采集自湖北省武漢市蔡甸區(qū)武漢沃土清源稻蝦供養(yǎng)專業(yè)合作社(30.39°N,113.77°E)。取不同性別, 體長約10.00 cm的克氏原螯蝦成蝦, 用75.0%的酒精進行體表消毒, 在無菌環(huán)境下分離其后腸, 每3—4只蝦腸混成一個樣品, 保證每個樣品腸道中的內(nèi)容物共計不低于0.20 g, 其中雌性3個樣品, 雄性4個樣品, 置于無菌管中, 在-80℃下凍存。對克氏原螯蝦的處理嚴格遵從實驗動物飼養(yǎng)和處理標準。用糞便基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取樣品微生物總DNA。

1.2 不同生長階段克氏原螯蝦腸道取樣

克氏原螯蝦親本采集自武漢沃土清源稻蝦供養(yǎng)專業(yè)合作社。體表用高錳酸鉀浸泡消毒后, 置于經(jīng)高錳酸鉀消毒過的水族箱中暫養(yǎng)2周, 養(yǎng)殖密度為10只/箱, 雌雄性別比例為1∶1。養(yǎng)殖用水為經(jīng)過曝氣的自來水, 水深(5.00±1.00) cm, 水溫(25.00±1.00)℃, L∶D為12∶12, 投喂商業(yè)顆粒飼料(通威集團生產(chǎn))。親蝦自然交配產(chǎn)卵, 幼蝦孵出后置于另外的水族箱中飼養(yǎng), 投喂飼料和飼養(yǎng)條件與成蝦相同。取體長約2.00 cm的幼蝦(孵化后1個月)腸道(10只幼蝦腸道混為1個樣品)及體長約27.00 cm的成蝦(3只成蝦腸道混為1個樣品), 置于無菌管中, 在-80℃下凍存。按1.1的方法提取總DNA。

1.3 PCR擴增條件和測序

對16S rRNA的V3—V4區(qū)域進行擴增(引物為341F: 5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806R: 5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。熱反應條件為94.00℃變性5min; 94.00℃ 30s, 54.00℃ 30s,72.00℃ 30s的30個循環(huán); 最后在72.00℃下延長10min。從1.2%瓊脂糖凝膠上切下PCR產(chǎn)物, 并使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(AXYGEN, 美國)純化。對每種純化的PCR產(chǎn)物進行基于Illumina的高通量測序(BGI, 中國深圳)。

1.4 生物信息分析

對數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)過濾[21], 獲得Clean data。使用FLASH (Fast Length Adjustment of Short reads,v1.2.11)軟件, 利用reads 之間的重疊關系將雙末端測序得到的成對reads組裝成一條序列[22], 最小匹配長度10 bp, 重疊區(qū)域允許錯配率為0.1, 得到高變區(qū)的Tags; 利用USEARCH (v7.0.1090)軟件[23], 在97.0%的相似度下將Tags 聚類成OTU, 去除嵌合體,然后通過OTU 與數(shù)據(jù)庫比對, 對OTU 進行物種注釋; 基于OTU 和物種注釋結果進行樣品物種復雜度分析及組間物種差異分析。

Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析[24], 包括Observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)等。通過mothur (v1.31.2)軟件計算樣品的Alpha多樣性值, 用SPSS 22.0對Alpha多樣性指數(shù)進行獨立樣本t檢驗(Independent samplest-test)。

Beta多樣性分析是用來比較一對樣品在物種多樣性方面存在的差異大小, 包括Bray-Curtis距離、weighted UniFrac距離和unweighted UniFrac距離等。通過QIIME (v1.80)軟件分析各類群在樣品中的含量, 進而計算出不同樣品間的Beta多樣性值。

2 結果

2.1 性別對克氏原螯蝦腸道菌群的影響

高通量測序的一般分析對2組克氏原螯蝦樣品(4個雄性樣本, 3個雌性樣本)的腸道微生物進行測序, 去除低質(zhì)量序列后, 共獲得876639條序列,雄性腸道菌群高質(zhì)量序列在122100—133200, 雌性高質(zhì)量序列在123068—127654。對每個樣本獲得的序列按97.0%的序列相似度進行歸并和OTU劃分, 共得到2039個OTU。

用Alpha多樣性指數(shù)分析雌雄蝦腸道菌群多樣性的差異(表 1)。Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無顯著性差異, 表明雌雄克氏原螯蝦腸道菌群的Alpha多樣性在統(tǒng)計學上無差異。

表1 不同性別克氏原螯蝦腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)(平均值±標準差)Tab. 1 Alpha diversity index of intestinal microbiota in P. clarkii of different sexes (mean±SD)

腸道菌群組成和結構通過與數(shù)據(jù)庫進行比對, 對OTU進行物種分類并分別在門、綱、目、科、屬、種幾個分類等級對各個樣品作物種profiling面積圖和柱狀圖。在門水平上, 雌雄克氏原螯蝦腸道優(yōu)勢菌群(相對豐度＞1.0%)組成較為一致,包括變形菌門Proteobacteria (27.3±12.8)%、厚壁菌門Firmicutes (25.7±14.1)%、軟壁菌門Tenericutes(18.8±13.7)%和擬桿菌門Bacteroidetes (18.3±17.3)%等, 各優(yōu)勢菌門在個體間豐度不同, 但不具有顯著性差異(圖 1)。

圖1 門水平上不同性別克氏原螯蝦腸道菌群組成Fig. 1 Composition of intestinal microbiota of P. clarkii of different sexes at the phylum level

在屬水平上, 除未能歸類的屬外, 雌雄克氏原螯蝦腸道優(yōu)勢菌群的組成較為一致, 包括擬桿菌屬Bacteroides(11.8±14.0)%、希瓦氏菌屬Shewanella(6.8±6.5)%、梭菌屬Clostridium(4.8±7.7)%、厭氧桿菌屬Anaerorhabdus(3.8±5.3)%和檸檬酸桿菌屬Citrobacter(1.5±0.7)%等, 個體間相對豐度不同, 但不具有顯著性差異(圖 2)。

圖2 屬水平上不同性別克氏原螯蝦腸道菌群組成Fig. 2 Composition of intestinal microbiota of P. clarkii of different sexes at the genus level

腸道菌群Beta多樣性克氏原螯蝦腸道菌群基于Weighted_UniFrac多樣性距離、Unweighted_UniFrac多樣性距離及Bray_curtis多樣性距離的聚類熱圖分析都未顯示出根據(jù)性別進行聚類的現(xiàn)象,在雌性和雄性的腸道菌群組成中并未表現(xiàn)出有規(guī)律的差異(圖 3)。

圖3 不同性別克氏原螯蝦腸道菌群Beta多樣性分析Fig. 3 Beta diversity analysis of intestinal microbiota of P. clarkii of different sexes

2.2 成蝦和幼蝦腸道菌群組成差異

高通量測序的一般分析在去除低質(zhì)量序列后, 從8個樣本中共分離到249813條序列, 對獲得的序列按97.0%的序列相似度進行歸并和OTU劃分, 共得到18186個OTU。

Alpha多樣性指數(shù)分析顯示(表 2), Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)有顯著性差異(P＜0.05), Simpson和Shannon指數(shù)沒有顯著性差異, 表明幼蝦的腸道菌群多樣性高于成蝦。

表2 不同生長階段克氏原螯蝦腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)(平均值±標準差)Tab. 2 Alpha diversity index of intestinal microbiota in P. clarkii at different stages of growth (mean±SD)

腸道菌群組成和結構在門水平上, 幼蝦腸道中相對豐度較高的優(yōu)勢門有變形菌門(35.6%)、擬桿菌門(32.0%)、厚壁菌門(17.6%)、軟壁菌門(8.8%)和放線菌門(5.1%)。成蝦腸道中相對豐度較高的優(yōu)勢門有變形菌門(65.7%)、擬桿菌門(20.4%)、厚壁菌門(9.6%)、放線菌門(0.9%)和疣微菌門Verrucomicrobia (0.7%; 圖 4a)。雖然成蝦和幼蝦的優(yōu)勢菌群較為一致, 但Meta-stats分析顯示其豐度具有偏向性, 有顯著性差異的細菌門有13個, 包括Thermi、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、衣原體門Chlamydiae、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、GN02、浮霉菌門Planctomycetes、變形菌門、SR1、軟壁菌門、TM7和疣微菌門(圖 4b)。

圖4 門水平上不同生長階段克氏原螯蝦腸道菌群組成和差異Fig. 4 Intestinal microbial composition and differences of P. clarkii at different stages of growth at the phylum level

在屬水平上, 成蝦和幼蝦的腸道優(yōu)勢菌群組成差異較大, 在幼蝦腸道中相對豐度較高的優(yōu)勢屬有伯克氏菌目的一個未歸類屬Unclassified_Burkholderiales (21.1%)、氫噬胞菌屬Hydrogenophaga(7.6%)、黃桿菌屬Flavobacterium(7.4%)、叢毛單胞菌科的一個未歸類屬Unclassified_Comamonadaceae(5.4%)和嗜堿菌屬Alkaliphilus(5.2%); 成蝦腸道中相對豐度較高的優(yōu)勢屬有擬桿菌屬(12.5%)、黃桿菌屬(10.8%)、Paracoccus(9.1%)和毛螺菌科的一個未歸類屬Unclassified_Lachnospiraceae (5.5%; 圖5a)。Metastats分析顯示, 在屬水平上成蝦和幼蝦有顯著性差異的細菌屬有70個, 前20位差異最大的細菌屬包括枝動菌屬Mycoplana、不黏柄菌屬Asticcacaulis、鞘氨醇單胞菌Sphingomonas、嗜堿菌屬、新鞘氨醇桿菌屬Novosphingobium、Methylopila、鞘脂菌屬Sphingobium、成對桿菌屬Dyadobacter、紅球菌屬Rhodococcus、氫噬胞菌屬Hydrogenophaga、分枝桿菌屬Mycobacterium、Tepidibacter、甲基醌菌屬Demequina、Kaistobacter、曲桿菌屬Ancylobacter、戴爾福特菌屬Delftia、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、Rheinheimera、Methyloversatilis和Sediminibacterium(圖 5b)。

圖5 屬水平上不同生長階段克氏原螯蝦腸道菌群的組成和差異Fig. 5 Intestinal microbial composition and differences of P. clarkii at different stages of growth at the genus level

腸道菌群Beta多樣性PCA分析顯示出按照生長階段, 即成蝦和幼蝦分別聚類的結果(圖 6a)。無論基于Unweighted_UniFrac距離還是Weighted_UniFrac距離的PCoA分析, 都顯示出明顯地根據(jù)生長階段分別進行聚類的結果(圖 6b和圖 6c)。對測序結果進行Adonis/PERMANOVA分析, 基于加權和未加權UniFrac距離的分析結果均顯示出成蝦和幼蝦腸道菌群有顯著差異(P＜0.05)。

圖6 不同生長階段克氏原螯蝦腸道微生物的Beta多樣性分析Fig. 6 The β diversity analysis of intestinal microbiota in P. clarkii at different stages of growth

NMDS分析和UPGMA聚類分析也顯示出明顯的根據(jù)生長階段進行聚類的情況。進一步對測序結果進行Anosim分析, 基于加權和未加權UniFrac距離的分析結果均顯示出成蝦和幼蝦腸道菌群的顯著性差異(P＜0.05; 圖 7)。

圖7 不同生長階段克氏原螯蝦腸道微生物的NMDS分析和UPGMA聚類分析Fig. 7 The NMDS and UPGMA clustering analysis of intestinal microbiota in P. clarkii at different stages of growth

成蝦和幼蝦腸道菌群的比較分析PLSDA分析顯示成蝦和幼蝦腸道菌群結構具有顯著性差異; 使用R軟件, 對豐度前50位的屬進行聚類分析并繪制熱圖, 結果也顯示出其腸道菌群根據(jù)生長階段進行聚類的情況(圖 8)。

圖8 不同生長階段克氏原螯蝦腸道微生物的PLS-DA分析和熱圖Fig. 8 The PLS-DA and heatmap of intestinal microbiota in P. clarkii at different stages of growth

幼蝦和成蝦腸道菌群的功能預測在KEGG pathway database數(shù)據(jù)庫中對幼蝦和成蝦的腸道菌群進行PICRUSt功能預測, 使用R軟件, 對豐度前50位的功能類群進行聚類分析并繪制熱圖(圖 9)。成蝦和幼蝦腸道菌群的主要功能包括細胞通訊、膜運輸、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、遺傳信息復制和修復和能量代謝等, 2個生長階段差異最顯著的功能有細胞運動、膜運輸、碳水化合物代謝、異生素的生物降解和代謝、脂質(zhì)代謝和信號轉導等。

圖9 PICRUSt預測的不同生長階段克氏原螯蝦腸道菌群功能的相對豐度Fig. 9 The relative abundance of the function of the intestinal microbiota predicted by PICRUSt in P. clarkii at different stages of growth

3 討論

對不同性別克氏原螯蝦腸道菌群進行高通量測序發(fā)現(xiàn), 在野外蝦塘養(yǎng)殖下的克氏原螯蝦的腸道菌群不論是在群落多樣性、物種豐度還是菌群功能預測上, 都未體現(xiàn)出性別間的差異, 且腸道菌群的個體差異較大。對成蝦和幼蝦的腸道菌群進行高通量測序發(fā)現(xiàn), 不同階段對腸道微生物的群落多樣性、豐度及功能都有顯著影響。

3.1 不同性別克氏原螯蝦腸道菌群的分析

有報道表明, 中華絨螯蟹雌雄個體的腸道菌群并無明顯差異, 具有相同的優(yōu)勢細菌, 且菌群豐度隨生長階段發(fā)生的變化在雄蟹和雌蟹中顯示出一致的趨勢[11]。在本實驗中雌雄克氏原螯蝦腸道菌群的Alpha多樣性指數(shù)(Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))均無顯著性差異。在物種組成和結構上, 其擁有的優(yōu)勢菌群較為一致, 門水平上包括厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門等, 屬水平上包括擬桿菌屬、希瓦氏菌屬、梭菌屬和檸檬酸桿菌屬等,這些優(yōu)勢菌在成蝦腸道中趨于保守, 屬常駐菌群, 與南美白對蝦和黑虎蝦(Penaeus monodon)等結果相似[25—27]。

3.2 不同生長階段克氏原螯蝦腸道菌群的分析

在羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn), 隨著養(yǎng)殖周期的推移, 其腸道菌群多樣性表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢, 不同生長階段的優(yōu)勢菌群組成也有所差異[28]。在本實驗中克氏原螯蝦幼蝦的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著性高于成蝦(P＜0.05)。

在門水平的物種組成和結構上, 兩個階段的優(yōu)勢菌群較為一致, 包括變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門等。其中, 變形菌門是相對豐度最高的細菌門, 在許多動物腸道中都屬常駐菌, 腸道微生物群落的失衡通常源于變形菌門豐度的變化,在變形菌門中有許多條件致病菌, 其在腸道內(nèi)的比例能夠反映微生態(tài)和腸道微生物群落結構的穩(wěn)定性, 是腸道菌群失調(diào)的微生物標志[27]。擬桿菌門與碳水化合物的發(fā)酵相關, 可以參與到膽汁酸以及類固醇的代謝中。擬桿菌門和厚壁菌門對發(fā)酵多糖都非常重要, 且兩者之間存在著一種相互促進的共生關系, 它們共同促進宿主吸收或儲存能量, 其比值的變化會影響機體內(nèi)腸道菌群的代謝潛力, 具有十分重要的意義。有研究表明患有肥胖癥的小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門較多, 擬桿菌門較少, 這種菌群結構在分解食物和促進宿主能量吸收方面的能力更強[30]。在本實驗中幼蝦的比值為0.47 (F∶B=0.47), 成蝦比值為0.55 (F∶B=0.55), 顯示出成蝦更強的分解食物和吸收營養(yǎng)的能力。

在屬水平上, 成蝦和幼蝦的優(yōu)勢菌群均包括黃桿菌屬、擬桿菌屬和氫噬胞菌屬, 是克氏原螯蝦的核心菌群。黃桿菌屬可以分解多糖, 擬桿菌的表面鞘脂的合成有助于維持腸道穩(wěn)態(tài)[31], 且與氫噬胞菌屬一樣可以代謝氨基酸和碳水化合物,這些菌屬均在腸道代謝中扮演著重要作用[32]。成蝦和幼蝦有顯著性差異的細菌屬包括嗜堿菌屬、甲基醌菌屬、曲桿菌屬和紅球菌屬等。其中嗜堿菌屬在幼蝦中相對豐度較高, 是一類嚴格厭氧菌, 在自然界中常見于鹽度較高的水體中,而成蝦中相對豐度較高的甲基醌菌屬同樣是嗜堿菌, 可以分解代謝木聚糖。紅球菌屬是一種好氧的革蘭氏陽性菌, 在成蝦腸道內(nèi)相對豐度較高。有研究表明有些紅球菌可以合成自由基清除劑參與機體的免疫防御機制[33], 大多數(shù)紅球菌則通過分泌多種消化酶參與宿主營養(yǎng)代謝[34,35],廣泛存在于蝦蟹的腸道菌群中, 與本實驗結果相符。

在對成蝦和幼蝦腸道菌群Beta多樣性的分析中, PCA分析、PCoA分析、多元方差分析、NMDS分析、UPGMA聚類分析和PLS-DA分析均顯示出不同生長階段間腸道菌群組成和結構上的差異, 與鯉(Cyprinus carpio)等水生動物的報道相似[36]。功能預測的結果顯示, 幼蝦和成蝦腸道菌群差異較大的功能中, 成蝦腸道菌群的優(yōu)勢功能包括膜運輸和碳水化合物代謝等, 幼蝦腸道菌群的優(yōu)勢功能包括細胞運動、異生素的生物降解和代謝、脂質(zhì)代謝等。由于成蝦A4樣品與鐵復合運輸系統(tǒng)(Iron complex transport system)相關功能的相對豐度較高, 在聚類時與幼蝦聚為一支。

有作者報道, 莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)腸道正常菌群的建立是在其孵化后20—60d, 并推測其建立與腸道的結構與功能的發(fā)育有關[37]。研究表明, 在克氏原螯蝦的養(yǎng)殖過程中, 從幼蝦發(fā)育為成蝦會由攝食浮游生物轉換為攝食顆粒飼料[38], 腸道內(nèi)多種消化酶表達增強[39]。為了適應這種攝食習性的轉換, 克氏原螯蝦腸道菌群也會隨著消化系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生結構和功能上的變化。