體外法估測常用飼料原料內(nèi)源代謝葡萄糖值

■姜宇翔 鄭自彬 呂良康 馮 志 李 強 張 慧 任 瑩，2 趙勝軍，2*

（1.武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢 430023；2.動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430023）

代謝葡萄糖（MG）由盧德勛先生在1996 年首次提出，指日糧中經(jīng)動物機體消化、吸收過后，可以提供給動物本身用于代謝的葡萄糖總量[1]。MG 分為外源代謝葡萄糖（IDSG）和內(nèi)源代謝葡萄糖（LFAG）。IDSG指飼糧中淀粉即碳水化合物在小腸消化酶作用下分解成的葡萄糖，LFAG 指飼糧經(jīng)過小腸后未被吸收的營養(yǎng)物質(zhì)在大腸中被微生物分解產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）被機體吸收后通過糖異生等作用產(chǎn)生的葡萄糖[2-3]。前期關(guān)于MG 的研究大多集中于反芻動物身上，我國目前關(guān)于豬MG的研究仍處于起步階段。趙勝軍[4]在2014年建立了豬MG計算公式，方勇[5]通過回腸瘺管技術(shù)對斷奶仔豬IDSG 進行測定，張丹丹[6]通過血瘺管技術(shù)結(jié)合動靜脈濃度差法建立了日糧LFAG的體內(nèi)測定方法。

揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）包含乙酸、丙酸、丁酸以及其異構(gòu)體等，其特點是具有較強的揮發(fā)性[7]。在反芻動物中，瘤胃發(fā)酵日糧纖維所產(chǎn)生的VFAs 可提供能量需求的70%～80%[8]。在單胃動物中，后腸微生物發(fā)酵所產(chǎn)生的VFAs 可占生長豬能量需求的5%～30%[9]。其中發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸被腸壁吸收后，小部分會轉(zhuǎn)化為乳酸，其余部分吸收到肝臟被轉(zhuǎn)化為葡萄糖。乙酸被吸收后轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，乙酰輔酶A是糖代謝、脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)代謝的重要中間產(chǎn)物[10]。丁酸的產(chǎn)生可直接為腸道細胞提供能量，并促進豬體腸道健康[11]?？梢?，腸道發(fā)酵產(chǎn)生的VFAs 在豬營養(yǎng)物質(zhì)代謝和生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，是不可被忽略的[12]。因此，如何定量測定機體VFAs 凈吸收量就顯得尤為重要。

腸道產(chǎn)生的VFAs，除了少量隨糞便排出體外以外，大部分會被腸壁細胞吸收利用或通過門靜脈進入肝臟被轉(zhuǎn)化和利用。由于VFAs 代謝和吸收的復(fù)雜性，定量測定VFAs的凈吸收量，需要給試驗動物安裝血管瘺，并采用同位素示蹤法、動靜脈濃度差法和屠宰法綜合測定，不僅過程繁瑣，技術(shù)難度也非常大。體外法不僅簡便、快捷，可避免繁瑣的動物試驗，而且還可以測定單一原料的VFAs 產(chǎn)生量，所以更適用于推廣和應(yīng)用。為此，本研究擬用體外法來測定日糧丙酸和乳酸的產(chǎn)生量，并與前期體內(nèi)法的結(jié)果相結(jié)合，建立回歸關(guān)系，最終建立日糧LFAG 的體外估測方法，并測定常用飼料原料LFAG值，為MG作為營養(yǎng)評價新指標奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗日糧

根據(jù)NRC（2012）和中國飼養(yǎng)標準配制等氮和纖維水平分別為3.00%、4.50%和6.00%的3 種日糧。其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧組成和營養(yǎng)水平(%)

1.2 主要儀器

恒溫搖床（上海知楚儀器有限公司，ZHSY-50）、100 mL三角瓶、微型粉碎機、電子分析天平。

1.3 試驗設(shè)計

將3 組日糧及4 種飼料原料進行粉碎過篩（分析篩：孔徑0.42 mm）作為底物，具體見表1、表2。體外進行模擬“胃-小腸消化”，收集殘渣并烘干粉碎，進行體外發(fā)酵產(chǎn)氣，同時測得丙酸及乳酸產(chǎn)生量，通過與前期體內(nèi)法研究[10]所得的大腸丙酸凈吸收量、乳酸門靜脈凈吸收量進行回歸分析，具體為3種日糧對應(yīng)生長豬大腸丙酸凈吸收量為（15.21±2.55）、（13.33±2.23）g/d和（8.13±1.63）g/d，生長豬大腸乳酸凈吸收量為（7.57±2.60）、（3.17±1.25）g/d 和（12.04±1.81）g/d。根據(jù)它們的相關(guān)性系數(shù)得到體外測定日糧LFAG的方法，進而通過此方法測定幾種常用飼料原料中MG值。

參照方勇[5]模擬“胃-小腸消化”，其中胃消化階段在胃蛋白酶作用下40 ℃恒溫搖床中消化1 h。在小腸階段在胰蛋白酶作用下40 ℃恒溫搖床中消化6 h。參照Williams等[13]的方法進行體外產(chǎn)氣法研究，大概步驟為收集“胃-小腸消化”后的殘渣制備發(fā)酵底物，采集6～8頭30 kg左右豬的新鮮糞樣制備發(fā)酵菌源，稱取0.5 g底物、10 mL菌源和164 mL培養(yǎng)基于200 mL發(fā)酵瓶中，同時沖入CO2形成厭氧環(huán)境。在恒溫搖床39 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h，每組日糧5個重復(fù)，1個對照。收集24、36 h和48 h上清液，測定丙酸和乳酸產(chǎn)生量。

1.4 測定指標及計算方法

參照桂黎鳳等[14]的方法測定發(fā)酵過程中丙酸產(chǎn)生量，參照郭子好等[15]測定發(fā)酵過程中乳酸產(chǎn)生量。參照趙勝軍等[4]提出的豬日糧中常見飼料原料LFAG計算公式：

式中：LFAG——內(nèi)源代謝葡萄糖；

Pr——大腸發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸量（mmol/d）；

La——大腸發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸量（mmol/d）；

K2和K3——分別為丙酸和乳酸的吸收率；

0.83 和0.87——分別為丙酸和乳酸與葡萄糖的能值之比。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用“平均數(shù)±標準差（Mean±SD）”表示，單因素方差分析進行顯著性檢驗，采用Duncan’s 多重比較，使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件設(shè)計回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時間段體外發(fā)酵丙酸產(chǎn)生量與體內(nèi)大腸吸收量回歸分析（見表3、圖1）

表3 不同時間體外發(fā)酵丙酸產(chǎn)生量與體內(nèi)大腸丙酸吸收量回歸分析

圖1 48 h體外發(fā)酵丙酸產(chǎn)生量與體內(nèi)大腸丙酸吸收量回歸分析散點圖

由表3和圖1可知，隨發(fā)酵時間增長，丙酸產(chǎn)生量也不斷增加，在36 h 時，日糧Ⅰ組丙酸產(chǎn)生量顯著高于日糧Ⅲ組（P＜0.05），在48 h 時，日糧Ⅰ組丙酸產(chǎn)生量顯著高于日糧Ⅲ組（P＜0.05），而日糧Ⅰ組和日糧Ⅱ組間丙酸產(chǎn)生量無明顯差異。同時日糧Ⅰ組丙酸產(chǎn)生量在3個時間段均為最高，且隨著纖維水平的上升，丙酸產(chǎn)生量呈下降趨勢。通過體外發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸與體內(nèi)大腸丙酸吸收量回歸分析發(fā)現(xiàn)，在48 h兩者關(guān)系達到最佳（R2=0.968 3）。

2.2 不同時間段體外發(fā)酵乳酸產(chǎn)生量與體內(nèi)門靜脈吸收量回歸分析（見表4、圖2）

圖2 48 h體外發(fā)酵乳酸產(chǎn)生量與體內(nèi)門靜脈乳酸吸收量回歸分析散點圖

表4 不同時間體外發(fā)酵乳酸產(chǎn)生量與體內(nèi)乳酸門靜脈凈吸收量回歸分析

由表4和圖2可知，與丙酸產(chǎn)生量不同的是，乳酸產(chǎn)生量較少，且只有在24 h 時，日糧Ⅱ組與Ⅲ組乳酸產(chǎn)生量差異顯著（P＜0.05），其余時間點，3個組間并無顯著差異（P＞0.05）。同時日糧Ⅲ組乳酸產(chǎn)生量在3個時間段均為最高，且隨著纖維水平的上升，乳酸產(chǎn)生量呈上升趨勢。同時通過體外發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸與體內(nèi)門靜脈乳酸吸收量作回歸分析發(fā)現(xiàn)，在48 h兩者關(guān)系達到最近（R2=0.992 5）。

2.3 4種常用飼料原料LFAG值（見表5）

4 種常用飼料原料體外發(fā)酵后丙酸（Y1）和乳酸（Y2）的產(chǎn)生量如表5 所示，將其代入線性方程Y1=3.826 8X1-6.832 9（R2=0.968 3）和Y2=0134 1X2+3.445 0（R2=0.992 5）后根據(jù)最佳發(fā)酵時間（48 h）進行單位換算，并代入LFAG 測定公式中，得到玉米、豆粕、大豆皮、小麥麩LFAG 值分別為177.55、32.83、76.02 g/kg 和14.83 g/kg。由此可知玉米和大豆皮LFAG 值相對較高，豆粕和小麥麩LFAG 值相對較低。

表5 4種常用飼料原料體外發(fā)酵丙酸和乳酸產(chǎn)生量及內(nèi)源代謝葡萄糖值

3 討論

葡萄糖作為機體生命活動中最主要的能源物質(zhì)，在維持機體自身新陳代謝中起著非常重要的作用[16-17]。單胃動物中，VFAs 占生長豬維持能量需要的5%～30%[17]。MG 的提出將飼糧組分和葡萄糖的產(chǎn)生量建立起直接聯(lián)系[19]，LFAG 作為MG 的組成部分，將體內(nèi)葡萄糖需要量與大腸發(fā)酵所產(chǎn)生VFAs 相聯(lián)系起來，有利于達到對機體能量精細化調(diào)控的目的。由此可認為，丙酸和乳酸的產(chǎn)生量即為影響LFAG 的主要因素。飼糧中經(jīng)動物大腸發(fā)酵產(chǎn)生的VFAs（丙酸和乳酸），通過糖異生轉(zhuǎn)化而成的葡萄糖，即為本試驗的估測指標LFAG。

本試驗通過體外發(fā)酵產(chǎn)氣法測定3 組日糧丙酸和乳酸產(chǎn)生量，結(jié)果表明在同一時間段內(nèi)，3組日糧的丙酸產(chǎn)生量呈下降趨勢，乳酸的產(chǎn)生量呈上升趨勢，該趨勢是由于3組日糧的纖維水平較低、淀粉水平較高所導(dǎo)致。隨著發(fā)酵時間的增長，3 組日糧丙酸和乳酸的產(chǎn)生量呈上升趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間為48 h，其與體內(nèi)法研究所得數(shù)據(jù)線性回歸擬合度最高（丙酸，R2=0.968 3；乳酸，R2=0.992 5）。因此，通過它們的線性關(guān)系可以達到體外法估測日糧LFAG 的目的。本試驗利用該方法通過線性回歸方程進一步計算出4 種飼料原料玉米、豆粕、大豆皮和小麥麩LFAG 值，分別為177.55、32.83、76.02 g/kg和14.83 g/kg。該方法與李強等[19]通過體外法建立淀粉降解率的線性回歸方程，估測飼糧IDSG所用到的方法相似，均具有簡便性及精確性。但不同原料丙酸和乳酸產(chǎn)生量相差較大，因此有關(guān)于原料間的組合效應(yīng)還有待于更深入的研究。

總而言之，MG 作為一種新的飼糧營養(yǎng)價值評價指標，在能量代謝與物質(zhì)代謝之間建立了直接聯(lián)系，有利于通過對物質(zhì)的供給控制達到對機體能量精細化調(diào)控的目的。而體外法測定LFAG方法的建立，對MG飼料數(shù)據(jù)庫的完善提供了有效手段，具有重大的意義。

4 結(jié)論

體外法可作為日糧LFAG水平的體外估測方法。

體外法發(fā)酵時間48 h 時，回歸方程擬合度最佳。丙酸產(chǎn)生量線性回歸方程為Y1=3.826 8X1-6.832 9，R2=0.968 3；乳酸產(chǎn)生量回歸方程為Y2=0.134 1X2+3.445 0，R2=0.992 5。

③測得4種常用飼料原料玉米、豆粕、大豆皮、小麥麩LFAG 含量分別為177.55、32.83、76.02 g/kg 和14.83 g/kg。