急性肝衰竭動物模型的研究進展

龍富立，林 鏞，彭子明，馮 逢，張建玲，毛德文，韋艾凌,3

1 廣西中醫(yī)藥大學研究生學院，南寧 530200； 2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 肝病科，南寧 530023； 3 廣西中醫(yī)藥大學成人教育學院，南寧 530001

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是由多種原因引起的肝細胞大量壞死，肝功能嚴重障礙，以其病情進展迅速、惡化嚴重及高病死率為顯著特征，為患者和社會帶來嚴重負擔[1]。治療上肝移植能有效降低患者病死率，但由于費用高昂和肝源缺乏，仍以內科及人工肝為優(yōu)先選擇，但病死率居高不下。迄今為止，對于ALF的發(fā)病機制尚未明確，而符合ALF表現的高質量動物模型仍然缺乏，想要深入了解ALF發(fā)病機制、探求更加有效的治療方式、提高患者生活質量，制備與臨床發(fā)病相似并可復制的動物模型尤為重要。

1 實驗動物

1.1 嚙齒動物 嚙齒動物在ALF造模中最為廣泛，大鼠品系一般以 Wistar 和 SD 為主，小鼠以 ICR、C57BL/6J、KM在研究實驗中最為常見，也有其它品系鼠類在研究中出現，可以看出ALF造模對鼠類品系無嚴格要求。

1.2 兔、豬、犬 兔、豬、犬制備有手術和藥物兩種造模方式，因中大型動物手術對體內觀察情況較為直觀，是研究肝膽外科疾病良好的動物模型，其手術模型多用于試驗新型人工肝支持系統(tǒng)，化學藥物模型常用于研究ALF發(fā)病機制和組織病理變化等。

1.3 非人靈長類 研究[2]表明，非人靈長類動物肝臟發(fā)育和內環(huán)境變化與人類極其相似，其模型在臨床上與 ALF 患者的臨床特征、肝臟指標、組織病理學和壽命等表現出相似的變化，常用于深入研究ALF發(fā)生的潛在機制及新型病毒基因型試驗研究[3]。

2 造模方法

常見的ALF造模方法有化學或藥物、手術、手術結合藥物、感染等。化學藥物建模包括D-氨基半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、硫代乙酰胺( thioacetamide，TAA)、對乙酰氨基酚 (acetaminophen，APAP)、四氯化碳 (carbon tetrachloride，CCl4)、刀豆球蛋白A(CONA)、卡介苗、鵝膏蕈堿等。手術建模包括肝缺血模型和肝切除(次/全)模型。不同的建模方法涉及不同的實驗流程，每種動物模型各有優(yōu)勢，但同時存在一定的不足。

2.1 化學或藥物模型

2.1.1 對乙酰氨基酚(APAP)

2.1.1.1 原理 APAP通過誘導細胞氧化應激增強、線粒體功能障礙導致肝細胞壞死，而其中線粒體功能障礙是APAP誘導 ALF 模型成功的主要機制，其通過抑制線粒體 ATP 酶活性，并對線粒體超微結構造成損傷[4]。

2.1.1.2 造模方法 (1)嚙齒動物：以750 mg/kg APAP腹腔注射小鼠，12 h后肝臟病理符合臨床ALF特征表現，提示造模完成[5]。(2)犬類：Ortega等[6]方法為在動物禁食12 h后，以500 mg/kg APAP每90 min靜脈注射，此方法48 h后肝臟典型病理為Ⅲ區(qū)呈肝小靜脈匯合性壞死，76 h內動物全部死亡，且具有臨床ALF生化和形態(tài)學特征。(3)豬類：Dargue等[7]予250 mg/kg APAP經豬十二指腸給藥，并使用0.5～4 g/h的維持量將血清APAP濃度維持在300 mg/L以上，造模成功指標為凝血酶原時間>3 s，模型病理呈現肝小葉到中部肝細胞變性壞死，血清指標與臨床APAP誘導的ALF相似，包括肝性腦病的跡象。

2.1.2 D-氨基半乳糖胺(D-GalN)

2.1.2.1 原理 D-GalN可快速消耗體內尿苷酸，使細胞器和酶的生成補充障礙，導致肝細胞出現不可逆的損傷。LPS能刺激肝臟巨噬細胞、Kupffer細胞等產生TNFα，破壞血管內皮的完整性，使肝細胞壞死[8]。而D-GalN又能加強LPS的急性毒性，所以D-GalN的單一用藥和D-GalN配合LPS使用均可誘導ALF模型。

2.1.2.2 造模方法 (1)D-GalN/LPS：①小鼠。吳小紅等[9]腹腔注射200 μl LPS (2.5 mg/kg) /D-GalN (0.3 g/kg)的生理鹽水溶液一次成膜，小鼠存活時間為8～12 h。②大鼠。龍富立等[10]予D-GalN(600 mg/kg)聯合LPS(20 μg/kg)腹腔注射大鼠一次成模，造模時間為48 h；Kitazawa等[11]腹腔注射 D-GalN(500 mg/kg)/LPS(50 μg/kg)3 h 后，可達到ALF水平。③豬類。彭承宏等[12]經門靜脈注射0.5 g/kg D-Ga lN和1 μg/kg LPS的方法建立ALF模型，約48 h造模完成，肝臟病理可見肝細胞壞死伴出血，7 d病死率為83%，造模后表現及生化指標皆與臨床相似，可輔助部分原位肝移植治療ALF的研究。(2)D-GalN：①大鼠。Zhang團隊[13]經過實驗后證實1.4 g/kg D-GalN劑量制備的大鼠ALF模型在血清組織學、臨床表現等方面與人類相似。②豬類。Zhang等[14]通過分離頸靜脈后行中央靜脈導管給藥，D-GalN劑量為1.2 g/kg，模型在24 h各血清和炎癥指標升高，48 h后成膜，其病理表現為肝小葉結構異常，Disse腔明顯擴張，并有肝細胞溶解性壞死和碎片樣壞死，模型動物死亡約72 h。③犬類。Patzer等[15]使用異氟醚麻醉后經靜脈注射1.5 g/kg D-GalN，血清指標在16 h明顯上升而核苷酸、氨、膽紅素含量則在32 h出現高峰，模型平均生存時間 43.7 h。④非人靈長類。Feng等[16]以小隱靜脈穿刺代替血管插管，注射2.5 g/kg D-GalN可誘導ALF模型，模型在5 d內全部死亡，病理顯示在壞死區(qū)域有肝細胞彌漫性腫脹，并伴有細胞變性；肝酶、TBil、炎癥指標及內毒素水平均符合臨床ALF表現，也存在治療窗口期。

2.1.3 硫代乙酰胺(TAA)

2.1.3.1 原理 TAA首先是使細胞氧化應激增加，促使氧化產物的積累，出現細胞壞死和肝損傷；其次是釋放促炎性介質引起炎癥傳播,使肝損傷進一步加重[17]。

2.1.3.2 造模方法 (1)小鼠。楊天翼[18]予200 mmg/kg TAA腹腔注射小鼠，一次成膜，小鼠病理血清、病死率均與臨床相似，但伴有明顯腸道損傷；(2)大鼠。毛德文等[19]采用10%TAA溶液6 ml/kg皮下注射，24 h后重復注射同等劑量，48 h可造模成功；張美華等[20]予不同劑量TAA研究藥物量效關系,發(fā)現250 mg/kg、350 mg/kg組肝性腦病發(fā)生率100 %。TAA為制備ALF常見藥物，腹腔注射建模劑量尚未統(tǒng)一，100 mg /kg、400 mg/kg、600 mg/kg等也均有報道，制備方式也均無小特殊，注意結合體質量及次數即可。

2.1.4 四氯化碳(CCl4)

雖然福州城市林業(yè)在數量指標上較高，但各區(qū)域在城市森林的均勻度方面差異還是比較大的，臺江是老城區(qū)，人口、建筑相對比較密集，城市綠地的比例相對較小，而倉山區(qū)、晉安區(qū)、馬尾區(qū)有嚴格的綠地規(guī)劃，其綠化覆蓋率與綠地率與人均公園綠地面積遠遠高于臺江區(qū)，鼓樓區(qū)雖然人口密集、建筑物較多，但區(qū)內有西湖公園、左海公園、溫泉公園等市級公園，故福州鼓樓區(qū)市民對其綠地感知差異不大，臺江區(qū)內綠地數量明顯不足，故臺江區(qū)市民在城市森林覆蓋率、均勻度、滿足精神需要等方面感知與其它各區(qū)域有顯著差異。

2.1.4.1 原理 CCl4進入機體經細胞色素P450激活后攻擊細胞膜上的磷脂分子，并與肝細胞膜脂質和蛋白質共價結合，破壞肝細胞膜結構和功能，影響蛋白質代謝和Ca2+內流增加，引起肝損傷及生化血液學的改變[21]。

2.1.4.2 造模方式 CCl4制備ALF模型有多種方式，而灌胃法CCl4直接經門靜脈作用于肝臟，建模以此法較為多見。(1)嚙齒動物。王歡等[22]以4 ml/kg的CCl4灌胃可誘導大鼠ALF模型；(2)豬類。Nardo等[23]以450 mg/kg劑量CCl4制備ALF模型研究體外門靜脈氧合作用，模型7 d病死率為100%，肝組織顯示60%～70%肝壞死；(3)犬類。采用CCl4聯合APAP，第1次予30%APAP(0.5 ml/kg)靜脈注射和40%CCl4(0.5 ml/kg)腹腔注射，12 h后重復給藥，劑量為第1次的1/2，可建立犬ALF模型。24 h病死率為0，76 h為90%，病理出現以中心靜脈為中心的大片壞死，壞死區(qū)充血及炎癥細胞侵潤等，肝損傷在24 h達到高峰[24]。(4)CCl4聯合LPS。前12 周連續(xù)腹腔注射 20% CCl4油溶液 5 ml /kg，每周 2 次，制備小鼠慢性肝損傷模型，12周+3 d后腹腔聯合注射 1 g/kg D-GalN 和 10 μg/kg LPS 制備ALF模型[25]。

2.1.5 刀豆球蛋白A(Con A)

2.1.5.1 原理 Con A激活T淋巴細胞使動物肝實質大量淋巴細胞浸潤(CD4+T、TNFα、IL-6為主)，導致肝組織壞死，門靜脈充血等特異性肝損傷[26]。此方法能較好地模擬人類病毒性肝炎、免疫性肝病等。

2.1.5.2 造模方法 高鈺迪等[27]通過小鼠尾靜脈注射20 mg/kg ConA約12 h建立ALF模型，總生存率為40%,病理呈現肝組織呈大塊壞死，肝細胞腫脹及大量炎癥細胞浸潤，轉氨酶、caspase-3、炎癥因子等均與臨床ALF相似；Li等[28]和朱鏐孌等[29]在研究中12 mg/kg和15 mg/kg ConA建立的模型也符合ALF臨床表現癥狀。ConA作為新近ALF造模藥物，建模動物選擇大都為小鼠，最佳劑量尚有待統(tǒng)一。

2.1.6 卡介苗

2.1.6.2 造模方法 Yang等[31]通過小鼠實驗報道，先經鼠尾靜脈注射卡介苗 2.5 mg/只，10 d后注射LPS 10 μg/只，可成功誘導小鼠急性肝損傷模型。

2.1.7 鵝膏蕈堿 Ishiguro等[32]以豬為實驗對象，采用Amanitin提取物α-氨基丁酸聯合LPS的方式成功建立ALF參考模型。Zhou等[2]以獼猴采用Amanitin結合內毒素建立ALF模型，在臨床表現、血清病理學等方面均與人類相似。

2.2 ALF手術模型

2.2.1 肝切除模型 (1)全肝切除模型：Filipponi等[33]手術方法為腹正中切口或右上腹肋緣斜切口進腹，先切斷肝周韌帶，然后整塊肝切除并行門-腔靜脈重新移植和門-腔分流。術中輸液以維持血流動力學穩(wěn)定，術后予抗生素預防感染。從手術開始監(jiān)測動物生命體征、顱內壓，按時段抽血觀察相關指標以檢測最佳ALF模型。Knubben等[34]對手術進行改進，方法是先植入Y形旁路行門-腔靜脈端側吻合及胸腔內腔靜脈吻合，然后進行肝切除術，其優(yōu)勢在于不需要體外通道液體支持。全肝切除模型與ALF總體相似性不高，而且實驗結果的重現性、可逆性及應用均起到限制，現臨床使用不多。(2)部分肝切除模型：在手術方法上與全肝切除相類似，切除肝臟體積的70%～90%。Skawran等[35]手術切除豬70%的肝臟，并結合內毒素(400 μg/kg)構建ALF模型。Hung等[36]以兔為對象，摘除74%肝臟(三葉肝)后又結扎右外肝的肝蒂，適用于人工肝系統(tǒng)研究。Chen等[37]切除犬80%的肝臟制備ALF模型用以研究生物肝系統(tǒng)。占敏[38]、陳勇等[39]在切除85%、90%大鼠肝臟后可建立ALF模型。也有學者聯合藥物方法建模成功，曹友德等[40]報道的方法是一次性腹腔注射1000 mg/kg D-GalN和100 μg/kg LPS，同時加用乳果糖，3 h后使用戊巴比妥麻醉動物，隨后結扎切除肝左葉、右葉及尾葉共 50%肝組織，血清學表現與臨床相似，有較好的治療窗口期。

2.2.2 急性肝缺血模型 第一步，門-腔靜脈分流。開腹后分離門靜脈和下腔靜脈，再行端側吻合或側側吻合。第二步，肝動脈等肝血管阻斷。分流術后行肝動脈結扎，多數情況下為了保證不會出現新的側支循壞，常把膽總管、側支肝血管一并結扎[41]。也有報導聯合其他方法進行造模：Yuasa等[42]應用腹腔鏡在切除肝動脈后，通過門靜脈注射7.5 ml CCl4，結合門靜脈缺血誘導ALF模型，治療窗口為6.4 h。實驗能制備出較符合臨床的ALF模型，手術可逆性、重復性等較肝切除模型良好，但由于阻斷血流原因，其評估肝性腦病等神經系統(tǒng)變化方面存在不足。

2.3 感染模型 Tunon等[43]肌肉注射兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic diseaqse virus, RHDV)分離株2×104血凝單位，85%的兔子在36～54 h內死亡，36 h后兔模型出現血清組織學、腦部神經變化均符合臨床ALF癥狀。Crespo等[44]以同樣的方式進行研究，發(fā)現ALF模型的病毒復制和誘導的炎癥過程存在平行關系，而褪黑素可以通過抑制細胞自噬來降低RHDV RNA的復制發(fā)揮保護作用。

2.4 其他模型 Yamauchi等[45]注射人單克隆抗體(MoAb)誘發(fā)小鼠急性肝損傷，結果顯示，MoAb 與小鼠肝細胞發(fā)生交叉反應，并在肝細胞膜上識別出一個190 kD分子。模型在注射8 h后，血清組織學符合ALF表現。此方式證明注射自身抗體的方式也可誘發(fā)自身免疫性肝炎誘導急性肝損傷。

3 ALF模型評價

按照Terblanche和Hickman[46]提出的ALF理想動物模型應含有以下特點：有可逆性；模型有重復性；動物死于ALF；有適當治療窗口期；大型動物監(jiān)測和建立體外循壞，指導臨床應用和效果評價；對環(huán)境、實驗人員危害最小。2000年Fourneau等[47]和Newsome等[48]作了三點補充：動物須有意識，可評估肝性腦??；生理代謝與人相似；符合倫理道德。然而就目前研究情況，尚未有滿足上述情況的ALF動物模型報道，現就以所查文獻結合上述評價標準做簡單評價。

通過上述造模方式可以看出嚙齒類藥物性ALF模型大都具有可逆性、重復性、動物死于ALF、有窗口期等標準，實驗具有重現性高、費用低等優(yōu)勢，能很好的重現臨床相似的ALF癥狀，但生理代謝方面與人存在明顯的差異，行為意識上難以把握，在評估神經系統(tǒng)疾病上存在不足，所以該動物模型常用于內科對中西藥物機理和ALF發(fā)病機制的探討；嚙齒類動物手術模型對實驗要求嚴格，術中并發(fā)情況多，可逆性、重復性不高，手術建模尚不常用。兔、犬、豬藥物模型相比于嚙齒動物與人生理代謝相似度更高，具有一定神經系統(tǒng)表現指標、治療窗口期等優(yōu)勢，但其價格和建模方法較嚙齒動物嚴格，兔、犬、豬手術模型可連續(xù)監(jiān)測和建立體外循壞，常用于檢驗新型生物人工肝。RHDV感染兔模型能重現ALF相關特征，但兔與人類結構存在較大差異，其代表性仍有待商榷。從建模藥物上看，藥物模型以 D-GalN聯合LPS和CCl4最為常見，原因是其造模原理與臨床ALF發(fā)病機制相似，而且動物成模用時較短，易行性、重復性較高；手術模型上部分肝切除和肝缺血造模能重現較好的ALF癥狀，主要用于新型人工肝試驗。隨著科學技術的發(fā)展，手術結合藥物造模、ConA造模、Moab造模等新型方式不斷出現，研究人員可根據不同研究目的，選擇合適的建模方法。

4 展望與小結

目前，ALF的發(fā)病機制尚未完全明晰，給患者和社會帶來巨大的經濟負擔，建立良好的ALF動物模型對于發(fā)病機制和治療策略具有重要意義。但又因為人體與動物在結構上的本質區(qū)別，患病后藥物藥理作用、機體內環(huán)境變化、人文心理變化等方面有較大差別，對高質量動物模型帶來巨大的困難和挑戰(zhàn)。比如多種動物在神經系統(tǒng)方面無法很好觀察到符合人類的肝性腦病癥狀；同一方法在不同品種動物中所需的藥物劑量尚不統(tǒng)一；量效關系未明確等。綜上所述，制備一個高質量且可復制動物模型既必不可少，又充滿艱辛，需要在研究中開拓新思路、新方法，如采取現有多種造模方法聯合，取長補短；從基因組學、代謝組學、免疫組學模擬人體系統(tǒng)進行不斷嘗試；采用患者血清改造為造模藥物等。

作者貢獻聲明：龍富立、林鏞負責課題設計，資料分析，撰寫論文；彭子明、馮逢、張建玲參與收集數據，修改論文；毛德文、韋艾凌負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。