肝纖維化中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控及靶向治療的研究進展

王永娟，謝肖立，姜慧卿

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，河北省消化病重點實驗室，河北省消化病研究所，石家莊 050000

肝纖維化是各種慢性肝臟疾病共同的病理過程，嚴重者會進展為肝硬化和/或肝癌。肝纖維化的病理基礎(chǔ)是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度沉積，而肌成纖維細胞是ECM的主要來源。近年來，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)被認為是肝纖維化中產(chǎn)生肌成纖維細胞的機制之一?，F(xiàn)有研究表明，肝細胞(hepatocytes，HC)、膽管上皮細胞、肝祖細胞(hepatic progenitor cells，HPC)及肝星狀細胞(HSC)均可通過EMT而促進肝纖維化[1]。目前，已有較多學(xué)者報道了通過調(diào)控EMT相關(guān)的信號通路能夠治療肝纖維化，本文將對現(xiàn)有的文獻進行綜述，以期為治療肝纖維化提供新思路。

1 EMT的定義及特點

1.1 EMT的定義 EMT是指貼壁上皮細胞獲得間質(zhì)細胞的特點，遷移及侵襲能力增強的生物學(xué)過程[2]。Greenberg等[3]于1982年首次提出了EMT的概念，他們發(fā)現(xiàn)在凝膠中培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞失去了極性，轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣的細胞。已經(jīng)證實EMT在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病中發(fā)揮重要作用。

1.2 EMT的特點 EMT最基本的特征是細胞表型的轉(zhuǎn)化。在EMT過程中，上皮細胞與基質(zhì)之間的緊密連接受損,閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1)及維持細胞極性、形態(tài)的黏附連接蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)缺失，開始表達間質(zhì)細胞標志蛋白,包括N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、成纖維細胞特異性蛋白-1(fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)SP-1，又稱為S100A4)，蝸牛同源物1(Snal1)，蝸牛同源物2(Snal2)和twist等；細胞骨架蛋白重排，由上皮細胞的角蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞的波形蛋白；發(fā)生EMT后細胞的遷移和侵襲能力明顯增強[2,4]。

EMT的另一個特征是可逆的，逆轉(zhuǎn)過程是間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化，即間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化獲得上皮細胞的特性[5]。術(shù)語“部分EMT”用于區(qū)分細胞尚未完成“全面EMT”的上皮細胞，即細胞已經(jīng)獲得間質(zhì)指標，但仍然表達上皮標志[2]。

2 EMT的分型及與肝纖維化的關(guān)系

鑒于EMT發(fā)生在不同的生物學(xué)過程中，Kalluri等[2]在冷泉港EMT會議上，將EMT分為三種：Ⅰ型與移植、胚胎形成及器官發(fā)育相關(guān)；Ⅱ型與傷口組織愈合，重塑或者器官纖維化相關(guān)；Ⅲ型與癌變相關(guān)。Ⅱ型EMT通常由炎癥信號介導(dǎo)，并且在修復(fù)完成且炎癥減輕時停止。但是，在持續(xù)的損傷和炎癥下，Ⅱ型EMT可以繼續(xù)生成肌成纖維細胞，這些肌成纖維細胞不斷積累，最終引起器官纖維化。Ⅱ型EMT在肝纖維化疾病中發(fā)揮重要作用，是引起肝纖維化中產(chǎn)生分泌膠原的成肌纖維細胞的機制之一[2,6]。肝臟內(nèi)能夠發(fā)生EMT的細胞主要包括HC、膽管上皮細胞、HPC和HSC。

3 肝纖維化中EMT相關(guān)的信號通路

肝纖維化中的EMT涉及許多信號傳導(dǎo)途徑，包括TGFβ1/Smad及TGFβ1/non-Smad，Wnt/β-catenin，Hedgehog(Hh)和Notch信號通路等。

TGFβ1是肝纖維化中引發(fā)EMT最重要的細胞因子。TGFβ1與其受體結(jié)合，觸發(fā)形成Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異四聚體復(fù)合物,活化的受體復(fù)合物通過其羧基末端的受體激活Smad2/3復(fù)合體，從而介導(dǎo)經(jīng)典的TGFβ1信號傳導(dǎo)。激活的Smad2/3與Smad4結(jié)合并移位至細胞核,在細胞核內(nèi)激活調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子如Snail、ZEB1、Slug、Twist等[7]，進而調(diào)控肝上皮細胞、HSC及HPC EMT。除了經(jīng)典的Smad途徑，TGFβ1還能夠通過非Smad效應(yīng)來介導(dǎo)生物學(xué)反應(yīng)，包括非受體酪氨酸激酶蛋白(如Src和FAK)，細胞存活的介導(dǎo)子(如NF-kB、PI3K/Akt途徑)，MAPK(ERK1/2、p38 MAPK和JNK等)和Rho GTPases(如Ras、RhoA、Cdc42和Rac1)[8]。

Hedgehog(Hh)蛋白是一種由上皮細胞分泌的信號蛋白,具有調(diào)節(jié)組織損傷后重建和再生功能?？扇苄訦h配體(Sonic Hh、Indian Hh和Desert Hh)與Hh反應(yīng)性細胞上的Patched(Ptc)受體相互作用。這種配體-受體相互作用可防止Ptc抑制其共受體Smo。激活的Smo反過來會引發(fā)一系列細胞內(nèi)事件，最終導(dǎo)致膠質(zhì)母細胞瘤(Gli)家族轉(zhuǎn)錄因子的激活和核定位，從而促進了Snail和Twist的表達，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[9]。

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)、CSL (CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合稱)DNA結(jié)合蛋白、其他的效應(yīng)物和Notch的調(diào)節(jié)分子等組成。Notch信號的產(chǎn)生是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經(jīng)過3次剪切，由胞內(nèi)段(NICD)釋放入胞質(zhì)，并進入細胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合,形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[10]。

Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑是由配體蛋白質(zhì)Wnt和膜蛋白受體結(jié)合激發(fā)的一組多下游通道的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。典型Wnt/β-catenin信號通路能夠激活核內(nèi)靶基因的表達，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[11]。

4 通過EMT影響肝纖維化的核酸分子

4.1 長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA) lncRNA是一種長度大于200個核苷酸，沒有蛋白編碼能力鏈非編碼RNA。與EMT相關(guān)的lncRNA主要包括lnc-Hser、lnc-Meg8、lnc-Meg3、lnc-H19、lnc-LFAR1等。Zhang等[12]研究表明，lnc-Hser通過C5AR1-Hippo-YAP途徑抑制HC凋亡，并通過Notch信號通路抑制HC發(fā)生EMT，從而抑制肝纖維化的發(fā)生。Chen等[13]研究表明，lnc-Meg8能夠通過Notch途徑抑制HSC活化和HC EMT，從而抑制肝纖維化的發(fā)生。He等[14]研究表明，lnc-MEG3通過SMO蛋白和miRNA-212抑制Hh信號通路介導(dǎo)的HSC EMT樣過程。Zhu等[15]研究表明，lnc-H19能夠抑制miRNA-148a的表達，促進TGFβ介導(dǎo)的HSC及HC的EMT。Zhang等[16]研究表明，lnc-LFAR1能夠促進Smad2/3與TGFβ受體1的結(jié)合及其在細胞質(zhì)中的磷酸化，從而抑制HC EMT及HSC EMT樣過程。

4.2 微小RNA(microRNA, miRNA) miRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小為20～25個核苷酸。與EMT相關(guān)的miRNA主要包含miRNA-146a、miRNA-21、miRNA-200a、miRNA-155等。Zou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，靜脈注射miRNA-146a高表達的腺病毒(Ad-miRNA-146a)后，能夠抑制HC EMT和Smad4的表達，通過抑制TGFβ介導(dǎo)的EMT，抑制肝纖維化的發(fā)生。Wu等[18]研究表明，在180例不同時期肝硬化患者血清中miRNA-21水平顯著升高，且與肝硬化的嚴重程度和活動性有關(guān)。并建立CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，在予以Ad-TuD-21治療后，大鼠肝纖維化程度明顯減輕。研究表明，在體敲低miRNA-21通過抑制ERK1信號通路，抑制HC EMT的發(fā)生。Yu等[19]研究表明，miRNA-200a在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化及HSC中的表達水平降低。miRNA-200a能夠抑制Hh信號通路的下游信號蛋白Gli2，抑制了HSC中的EMT樣過程。Dai等[20]研究表明，miRNA-155在肝硬化患者的肝臟組織、激活的HSC中的表達水平均顯著降低。過表達miRNA-155能夠降低間質(zhì)標志物和ERK1磷酸化水平。

4.3 寡核苷酸 轉(zhuǎn)錄因子誘餌寡核苷酸(transcription factor decoy oligodeoxynucleotides，TFD-ODN)是短雙鏈(ds)DNA，在靶基因的調(diào)控位點(即啟動子或增強子)攜帶已知的轉(zhuǎn)錄因子或DNA識別基序的保守結(jié)合序列。采用誘餌策略通過使用合成的TFD-ODN能夠阻斷轉(zhuǎn)錄因子的活性。與EMT相關(guān)的TFD-ODN主要包括TGFβ1/Smad ODN、NF-κB ODN。Gwon等[21-22]用TGFβ1和TGFβ1/Smad ODN處理的AML12細胞形態(tài)保留了上皮特征，TGFβ1/Smad ODN中E-cadherin的表達水平升高，而Vimentin的表達則降低。在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中，TGFβ1/Smad ODN能夠通過抑制TGFβ1表達和Smad轉(zhuǎn)錄因子，抑制肝纖維化的進展。Kim等[23]研究表明，在體外NF-κB誘餌ODN有效抑制了TGFβ1誘導(dǎo)的AML12 EMT，在體內(nèi)抑制了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。

5 以EMT為靶點的抗肝纖維化藥物

某些特定的藥物通過靶向調(diào)控EMT，發(fā)揮抗肝纖維化的作用。以下總結(jié)了通過抑制EMT減輕肝纖維化的藥物，供臨床工作者參考。

5.1 抗腫瘤藥物(索拉非尼和氟伐他汀) Hao等[24]研究表明，索拉非尼主要通過JNK和Akt信號通路誘導(dǎo)HSC自噬和凋亡，從而抑制肝纖維化的進展。Cheng等[25]通過二乙基亞硝胺誘導(dǎo)建立了大鼠肝纖維化模型，結(jié)果表明，索拉非尼聯(lián)合氟伐他汀能夠在體內(nèi)明顯降低膠原蛋白的含量及α-SMA、層黏連蛋白水平，并顯著抑制了HC中間質(zhì)標志物N-cadherin、Vimentin的表達,促進了上皮標志物ZO-1的表達。在體外，索拉非尼聯(lián)合氟伐他汀能夠上調(diào)HSC中Claudin-1的表達，上調(diào)間質(zhì)指標Vimentin的表達。機制上，索拉非尼加氟伐他汀通過抑制HC和HSC中TβRII的磷酸化阻斷TGFβ1/Smad3的信號通路,從而抑制HC和HSC EMT的發(fā)生。

5.2 分子靶向藥物——Vismodegib(GDC-0449，簡稱GDC) Pratap等[26]研究比較了兩種已知的Hh拮抗劑GDC和環(huán)孢素的抗纖維化能力，建立了膽管結(jié)扎大鼠肝纖維化模型，研究表明，環(huán)孢素和GDC能夠減輕大鼠早期肝纖維化，改善肝功能，阻止HSC活化，上調(diào)上皮標志E-cadherin的表達，而使間質(zhì)標志如α-SMA、FSP-1和TGFβ1表達下調(diào)。因此，GDC能夠通過抑制Hh信號通路，抑制HSC EMT樣過程，從而延緩肝纖維化的發(fā)生。

5.3 中藥

5.3.1 卡諾醇 卡若索爾是一種從迷迭香中提取的化合物，具有多種藥理活性。Zhao等[27]建立了CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，并用TGFβ1刺激AML12和LX-2細胞，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卡若索爾能夠在體外抑制AML12和LX-2細胞EMT，上調(diào)E-cadherin的表達，下調(diào)Vimentin的表達。在體內(nèi)，卡若索爾能夠抑制肝臟中Vimentin的表達，上調(diào)E-cadherin的表達，從而抑制肝纖維化的發(fā)生。機制上，卡若索爾抑制了增強的Zeste同源2，并使SIRT1的活性增強，從而抑制HC的EMT及HSC的EMT樣過程，抑制肝纖維化的發(fā)生。

5.3.2 蜂毒肽(melittin，MEL) MEL是蜂毒的主要成分，對類風濕關(guān)節(jié)炎、癌細胞增殖、纖維化和免疫疾病有效。Park等[28]建立了CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，并用TGFβ1刺激AML12和HSC，發(fā)現(xiàn)MEL在體外能夠抑制AML12和HSC EMT，上調(diào)E-cadherin和ZO-1的表達，而下調(diào)纖連蛋白和Vimentin的表達，而在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠體內(nèi)，能夠上調(diào)E-cadherin，下調(diào)Vimentin的表達。機制上，研究表明，蜂毒肽能夠通過抑制TGFβ/Smad和TGFβ/non-Smad-MAPK信號通路，抑制HSC及HC EMT，從而抑制肝纖維化的發(fā)生。

5.3.3 丁烯酞(BP) BP是中國藥材當歸、川穹中的成分。Chuang等[29]建立了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型，研究BP對HSC EMT及肝纖維化的作用，研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟組織中，BP能夠使BMP-7的表達上調(diào)，而TGFβ表達下調(diào)。通過提取大鼠原代HSC，研究BP在體外對HSC EMT的作用，研究發(fā)現(xiàn)，BP能夠抑制TGFβ和α-SMA的表達，而上調(diào)BMP-7的表達。機制上，BP通過調(diào)節(jié)BMP-7來降低EMT，以改善肝纖維化。

5.3.4 麥角甾醇 麥角固醇是一種活性化合物，通常存在于冬蟲夏草、香樟和蛹蟲草中。Tai等[30]建立了晚期糖基終產(chǎn)物誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，研究角固醇對HSC-T6細胞中RAGE信號傳導(dǎo)的影響。麥角固醇抑制了AGE誘導(dǎo)的HSC-T6的活化，并減弱了α-SMA，MMP-9和EMT間質(zhì)標志物如N-cadherin和Vimentin的表達。機制上，麥角固醇通過上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活的受體γ抑制HSC EMT，從而抑制肝纖維化的發(fā)生。

5.3.5 扶正化瘀方藥 扶正化瘀配方包括湯劑丹參、桃仁、冬蟲夏草、松花粉和絞股藍。Song等[31]通過TGFβ1刺激大鼠原代HSC，研究扶正化瘀方藥對HSC EMT及肝纖維化的作用，研究發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方藥能夠上調(diào)上皮標志E-cadherin的表達，而下調(diào)間質(zhì)標記物α-SMA和結(jié)蛋白的表達。另外，扶正化瘀能夠上調(diào)BMP-7表達，并能夠抑制TGFβ的表達。機制上，扶正化瘀方藥通過抑制p38蛋白激酶從而抑制TGFβ1信號通路，使HSC EMT逆轉(zhuǎn)。

5.3.6 丹酚酸B(Sal B) Sal B是從丹參中提取的主要水溶性組分。Yu等[32]建立了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型，研究Sal B丹酚酸B對肝纖維化的作用，研究發(fā)現(xiàn)，Sal B改善了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化，Sal B能夠上調(diào)HSC中結(jié)蛋白和Vimentin的表達，而抑制E-cadherin的表達。機制上，Sal B能夠上調(diào)PTCH1的表達，可逆轉(zhuǎn)由CCl4引起的PTCH1的DNA甲基化，從而通過抑制Hh信號通路，抑制HSC EMT，延緩肝纖維化的發(fā)生。

5.3.7 梔子苷 梔子苷是梔子中一種重要的環(huán)烯醚萜類化合物，具有廣泛的藥理活性。Park等[28]通過TGFβ1刺激AML12，研究梔子苷對AML12 EMT的作用。研究發(fā)現(xiàn)，京尼平苷顯著抑制TGFβ1誘導(dǎo)的COL1α1的mRNA和蛋白表達，而且能夠上調(diào)上皮標志物E-cadherin表達，抑制間質(zhì)標志物Vimentin的表達。機制上，京尼平苷阻斷了AML12細胞中Smad2/3、ERK和Akt的磷酸化。綜上所述，京尼平苷可能通過抑制TGFβ/Smad和ERK MAPK信號通路，抑制TGFβ1誘導(dǎo)的HC EMT，從而抑制肝纖維化的發(fā)生。

5.3.8 隱丹參酮(cryptotanshinone，CRY) Ren等[33]建立了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型,評估CRY對HC EMT及肝纖維化的作用。研究表明，CRY能夠抑制HC發(fā)生EMT，并減輕肝纖維化的程度。機制上，miRNA-539-3p是CRY調(diào)節(jié)靶點，CRY促進了miRNA-539-3p的表達，后者抑制了SMO，從而抑制HC的EMT過程。因此，CRY通過miRN-539-3p靶向抑制Hh途徑，從而抑制HC EMT，延緩肝纖維化的發(fā)生。

5.3.9 異甘草酸鎂 異甘草酸鎂在臨床上被用作肝保護劑。Yang等[34]建立了高果糖誘發(fā)的大鼠肝纖維化模型，高果糖攝入降低了miRNA-375-3p表達，并激活JAK2/STAT3和TGFβ1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。將BRL-3A細胞和/或原代大鼠HC予以高果糖刺激，然后用miRNA-375-3p模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染，或用JAK2抑制劑處理，研究發(fā)現(xiàn)，異甘草酸鎂增加了miRNA-375-3p的表達，從而抑制了JAK2/STAT3途徑和TGFβ1/Smad信號傳導(dǎo)，從而減輕了肝纖維化。

6 結(jié)語

HC、膽管上皮細胞、HPC EMT及HSC EMT樣過程是肝纖維化發(fā)展過程中的重要機制。TGFβ1/Smad、TGFβ1/non-Smad、Wnt/β-catenin、Hedgehog(Hh)和Notch通路等是參與肝纖維化EMT的重要信號通路，另外，某些核酸分子如lncRNA、miRNA、TFD-ODN等在肝纖維化EMT中也起到重要作用，以這些通路及分子為靶點，能夠抑制肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。臨床上，通過調(diào)控EMT抑制肝纖維化的藥物主要包括抗腫瘤藥物、分子靶向藥物及中藥，其中，中藥及相關(guān)成分的研究最廣泛，這些藥物為肝纖維化的治療提供了新的思路。

作者貢獻聲明：王永娟負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；謝肖立參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；姜慧卿負責擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。