調(diào)控基因表達(dá)的microRNA

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715）

之前很長一段時間，人們認(rèn)為RNA 的作用僅相當(dāng)于一個橋梁，連接DNA 與蛋白質(zhì)。隨著對研究深入，發(fā)現(xiàn)有些微小RNA 可以與某些mRNA 結(jié)合并進(jìn)行互補(bǔ)配對，從而關(guān)閉或抑制基因的表達(dá)，即在轉(zhuǎn)錄水平上對基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控。顯著的代表就是近30 年來被廣泛研究的microRNA（miRNA），它是一類長約19-24 個核苷酸的非編碼RNA 單鏈，由于核苷酸數(shù)量并不像普通RNA 分子那樣龐大，將其稱為微小RNA，但它可以廣泛地存在于真核生物中。越來越多的研究也讓我們認(rèn)識到miRNA 在細(xì)胞增殖、分化、生長發(fā)育和響應(yīng)外界環(huán)境信號等方面都有著不可替代的作用。

1.miRNA 的發(fā)現(xiàn)

1993 年，第一個miRNA 被Lee 等人在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，它不會翻譯成蛋白質(zhì)，而是對線蟲胚胎后期的發(fā)育具有調(diào)控作用，將其命名為lin-4。第一次miRNA 的發(fā)現(xiàn)并未完全引起人們的重視，大約7 年后才有新的發(fā)現(xiàn)。2000 年，第二個miRNA 基因let-7 被Pasquinelli 等人在線蟲中發(fā)現(xiàn)并報道，對應(yīng)的miRNA 為let-7。

植物miRNA 的研究進(jìn)展稍晚于動物。2002 年，第一個植物miRNA“miR171”被發(fā)現(xiàn)，是由Reinhart 等人在擬南芥中分離克隆出來的。隨后有人將植物與動物miRNA 進(jìn)行比較實驗，發(fā)現(xiàn)植物miRNA 與靶基因序列具有更高的互補(bǔ)配對性，而動物miRNA 與其靶mRNA 的契合度并不是那么高，miRNA 在動植物中使轉(zhuǎn)錄退化的機(jī)制不同之處就基于這一結(jié)論。此后，各種關(guān)于miRNA 的研究接踵而至，在病毒中也發(fā)現(xiàn)有miRNA 的存在。

2.miRNA 的生物合成

植物和動物細(xì)胞中的miRNA 合成不完全相同，但基本方式不變。miRNA 的合成主要有三個步驟：

（1）首先在DNA 聚合酶II 的催化下，細(xì)胞核內(nèi)含miRNA 基因的DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，得到pri-miRNA。PrimiRNA 只是miRNA 的前體轉(zhuǎn)錄本，不能直接經(jīng)過加工得到成熟的miRNA 分子。

（2）第二步pri-miRNA 被RNase Ⅲ核酸酶Drosha 進(jìn)一步加工得到miRNA 的前體pre-miRNA。Pre-miRNA 是具有莖環(huán)、約含70-80 個核苷酸的結(jié)構(gòu)，它成為成熟的miRNA 還需要下一步的修飾。

（3）miRNA 合成的最后一步是pre-miRNA 被剪切為僅有19-24 個核苷酸的成熟miRNA，同于前兩個步驟，它的發(fā)生場所從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞質(zhì)。主要是Ran-GTP 依賴的核質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin5 和G 蛋白因子Ran 將pre-miRNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)移，在剪切過程中雙鏈RNA轉(zhuǎn)移性RNA 內(nèi)切酶（Dicer 酶）發(fā)揮著必不可少的作用。

3.miRNA 的作用機(jī)制

miRNA*是一條在堿基序列上可以與成熟miRNA 分子進(jìn)行互補(bǔ)的單鏈，它會與miRNA 形成螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋體中的其中一條鏈會與細(xì)胞質(zhì)中的沉默復(fù)合體RISC 結(jié)合形成復(fù)合物miRNP。當(dāng)miRNA 與其結(jié)合后會打破沉默復(fù)合體RISC 的對稱，所以形成的miRNP 是非對稱的復(fù)合物。miRNA 可以在這種被其結(jié)合的非對稱復(fù)合物(miRNP)中進(jìn)行靶基因的識別，mRNA 會與靶mRNA 的3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）進(jìn)行互補(bǔ)配對從而起到轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控的作用，而小RNA 降解酶（SDN）會迅速降解掉另外一條RNA 鏈。miRNA 作用機(jī)制主要有兩種方式：使轉(zhuǎn)錄退化或參與翻譯抑制。

3.1 miRNA 使轉(zhuǎn)錄退化

miRNA 在動植物中使轉(zhuǎn)錄退化的作用機(jī)制并不完全相同。前文提到，植物miRNA 與動物的不同之處是它與靶基因序列的匹配性更高，植物miRNA 錯配率較低，在進(jìn)化過程中保守性更強(qiáng)。由于動物miRNA 與其靶基因的互補(bǔ)性不強(qiáng)，無法直接剪切mRNA。動物miRNA 主要是通過RISC 沉默復(fù)合體對mRNA 進(jìn)行降解，這個過程需要去腺苷化酶和脫帽蛋白與RISC 復(fù)合體結(jié)合后方能進(jìn)行。

植物miRNA 主要是通過介導(dǎo)靶基因mRNA 剪切來使轉(zhuǎn)錄退化。當(dāng)miRNA 對目標(biāo)mRNA 進(jìn)行剪切，靶mRNA的3′端由于被結(jié)合切割會暴露出5′單磷酸基團(tuán)，當(dāng)這個結(jié)構(gòu)被連接酶捕獲并添加接頭構(gòu)建，就可以得到降解組文庫。植物的miRNA 發(fā)揮剪切需要通過AGO 蛋白的核酸內(nèi)切酶來發(fā)揮作用，被剪切的mRNA 片段就會進(jìn)入下一步核酸外切酶降解途徑，降解靶mRNA 從而導(dǎo)致靶基因的降解，表達(dá)受到抑制。

3.2 miRNA 參與翻譯抑制

第一次提出“翻譯抑制”概念是在1993 年發(fā)現(xiàn)線蟲miRNA 時，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)線蟲miRNA“l(fā)in-4”的靶基因lin-14 轉(zhuǎn)錄出的mRNA 并沒有受到影響，而其蛋白質(zhì)水平明顯下降。關(guān)于miRNA 介導(dǎo)的翻譯抑制機(jī)制，在動物方面還沒有得到更深入的研究。

植物主要是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了miR172 可以通過使參與花器官發(fā)育調(diào)控的靶基因APETALA2（AP2）的蛋白水平下降，使得表達(dá)被抑制。后續(xù)還有眾多研究發(fā)現(xiàn)植物中的miRNA 不影響mRNA 的水平，而均可以降低其相應(yīng)的蛋白水平來抑制基因表達(dá)，揭示了miRNA 介導(dǎo)的翻譯抑制機(jī)制是在植物中廣泛存在且非常重要的。曾有報道指出miRNA 參與的翻譯抑制在早期的植物中就有所發(fā)現(xiàn)，DOUBLE-STRANDED RNA-BINDING 2 及其同源基因在早期被子植物和苔蘚中就已經(jīng)存在，它們可以影響這些植物基因的翻譯抑制。由此看來，miRNA 的翻譯抑制功能也具有保守性。

4.miRNA 調(diào)節(jié)的優(yōu)點

miRNA對基因表達(dá)調(diào)控的調(diào)節(jié)是在轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行調(diào)節(jié)，可以高效利用細(xì)胞內(nèi)資源。其調(diào)節(jié)的效果比轉(zhuǎn)錄前調(diào)節(jié)更好且可逆；與蛋白水平的調(diào)節(jié)相比它消耗能量更低，減輕了生物的負(fù)擔(dān)。

5.總結(jié)與展望

綜上，miRNA 在基因表達(dá)調(diào)控中有著不可替代的重要性。近年來，關(guān)于miRNA 在各個領(lǐng)域作用的研究正在不斷豐富中：miRNA 被發(fā)現(xiàn)是免疫反應(yīng)中重要的調(diào)控因子；在植物抗逆方面，miRNA 作為調(diào)節(jié)因子參與植物在高溫脅迫中的生長發(fā)育與逆境響應(yīng)；miRNA 還可以通過精密的調(diào)節(jié)機(jī)制對植物的胚和胚乳發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。除此之外，很多領(lǐng)域關(guān)于miRNA 研究也展現(xiàn)出蓬勃的生機(jī)，隨著未來科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，相信miRNA 研究之路會愈發(fā)寬廣。