玉米籽粒突變體smk7的表型分析和基因定位

蔣成功 石慧敏 王紅武 李 坤 黃長玲 劉志芳 吳宇錦 李樹強(qiáng) 胡小嬌,* 馬 慶

1 作物抗逆育種與減災(zāi)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 安徽合肥 230036; 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 作物分子育種國家工程實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081

玉米是世界第一大糧食作物, 也是重要的飼料和工業(yè)原料[1], 玉米產(chǎn)量對(duì)全球糧食安全具有舉足輕重的作用。玉米籽粒發(fā)育狀況決定著玉米的產(chǎn)量和品質(zhì), 因此籽粒遺傳發(fā)育機(jī)制一直是玉米研究的熱點(diǎn)[2-3]。玉米的籽粒由胚、胚乳和表皮3個(gè)部分組成。胚是籽粒的關(guān)鍵部分, 是精子與卵細(xì)胞融合形成的二倍體。胚乳占籽粒的絕大部分, 為籽粒的早期發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì), 是精子與中央細(xì)胞極核融合形成的三倍體[4]。發(fā)掘調(diào)控胚和胚乳發(fā)育的關(guān)鍵基因并解析其分子機(jī)制, 對(duì)指導(dǎo)玉米高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種具有重要意義[5]。

籽粒突變體是研究胚和胚乳發(fā)育機(jī)制的良好材料。早在1980年, Neuffer和Sheridan[6]利用EMS化學(xué)誘變玉米材料, 發(fā)現(xiàn)大約300個(gè)基因上的相關(guān)位點(diǎn)與玉米籽粒發(fā)育有關(guān)。隨后, 學(xué)者們根據(jù)突變籽粒的表型將玉米籽粒突變體大致分為, 小籽粒(small kernel,smk)、籽粒嚴(yán)重缺陷(defective kernel,dek), 胚特異缺陷(embryo defective,emb), 粉質(zhì)胚乳(opaque或floury)和空果皮(empty pericarp,emp)等類型[7]。

胚乳是玉米籽粒營養(yǎng)的主要儲(chǔ)存部位, 包括淀粉胚乳、糊粉層、轉(zhuǎn)移層及胚周層4個(gè)區(qū)域。粉質(zhì)胚乳突變體具有不透明胚乳, 通常賴氨酸含量較高。賴氨酸具有促進(jìn)生長發(fā)育及增強(qiáng)免疫的作用,因此這類突變體被廣泛研究。目前已克隆opaque或floury突變體有14個(gè), 如隱性突變o2、o5-7、o10、o11[8-10], 半顯性突變fl1[11]等。其中研究最早的o2突變體賴氨酸含量較野生型增加約69%[12]。O2基因編碼 Bzip轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控醇溶蛋白基因表達(dá), 突變后醇溶蛋白含量顯著降低, 富含賴氨酸的非醇溶蛋白含量增加, 從而極大提高籽粒中賴氨酸含量[13-15]。而其余opaque或floury基因也均與醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)、分布和積累密切相關(guān)。近期克隆的fl3在淀粉胚乳細(xì)胞中特異表達(dá), 通過與 RNA聚合酶III互作調(diào)控5S rRNA和tRNA的轉(zhuǎn)錄[16]。胚乳基部轉(zhuǎn)移層(basal endosperm transfer layer, BETL)位于胚和胚乳之間, 是籽粒從母體獲取營養(yǎng)的重要部位, 并且還具有細(xì)胞分裂素合成、能量代謝、防御反應(yīng)以及母本和籽粒之間信號(hào)傳導(dǎo)等多種功能。一旦受損會(huì)嚴(yán)重影響籽粒發(fā)育, 如mn1、dek37、dek41、dek44等突變體。Mn1編碼細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶,mn1突變體胚乳基部轉(zhuǎn)移層缺乏己糖的合成, 導(dǎo)致BETL細(xì)胞發(fā)育受到影響, 引起籽粒缺陷表型[17]。DEK37編碼P亞家族的三角狀五肽重復(fù)蛋白(PPR),該蛋白功能的喪失導(dǎo)致線粒體復(fù)合體 I亞基nad2的第一個(gè)內(nèi)含子剪接效率降低[15]。DEK41編碼 1個(gè)P型的PPR蛋白, 與玉米nad4內(nèi)含子3的順式剪切有關(guān), 突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)移層細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞, 引起B(yǎng)ETL層細(xì)胞發(fā)育受損[18]。糊粉層包裹著胚和胚乳細(xì)胞, 種子萌發(fā)時(shí), 糊粉層產(chǎn)生水解酶, 分解胚乳中的營養(yǎng)物質(zhì)。目前已知調(diào)控糊粉層發(fā)育的基因有DEK1、CR4、SAL1、THK1和NKD1。DEK1基因編碼胚乳中糊粉層細(xì)胞的1個(gè)蛋白酶,CR4編碼受體激酶,SAL1編碼1個(gè)E類液泡蛋白, 在質(zhì)膜的囊泡運(yùn)輸上起作用,CR4和DEK1參與糊粉層細(xì)胞特化的信號(hào)接收與傳導(dǎo),SAL1降解或者循環(huán)DEK1,CR4來維持質(zhì)膜上二者的濃度, 起負(fù)調(diào)控作用[19]。

胚是玉米籽粒具有生命活性的部分。胚特異突變體通常表現(xiàn)為籽粒大小正常, 但是沒有可見胚或胚發(fā)育畸形。已克隆的胚發(fā)育特異基因有EMB8156、EMB8522、LEM1、EMB12、EMB14、EMB16、EMB-7L[20]等。EMB8516、LEM1、EMB14和EMB16的功能均與質(zhì)體核糖體形成相關(guān),Emb12編碼質(zhì)體起始因子 3 (IF3), 質(zhì)體基因的正確表達(dá)對(duì)玉米胚發(fā)生具有重要意義。PPR8522與EMB-7L均編碼葉綠體靶向的 PPR蛋白, 突變后葉綠體受損, 代謝產(chǎn)物合成受抑制[21]。除了上述突變體外, 還有一類胚和胚乳都有缺陷的突變體, 如small kernel突變體的胚和胚乳發(fā)育都比較滯后。SMK6基因編碼 1個(gè)PPR-E+型蛋白, 突變導(dǎo)致線粒體nad1-740、nad4L-110、nad7-739和mttB-138、139位置上 C-U的編輯受到影響, 損害了線粒體活性[22]。SMK4基因堿基的缺失突變導(dǎo)致線粒體復(fù)合物 IV細(xì)胞色素 C氧化酶1 (cox1)轉(zhuǎn)錄本的1489位C被U編輯[23]?？偠灾? 在玉米籽粒突變中, 大部分的籽粒突變是由PPR蛋白的突變導(dǎo)致的。而PPR蛋白分為PLS、E、E+、DYW 幾種類型, 直接或間接參與 RNA穩(wěn)定、翻譯、切割、剪切、編輯等[24]。

本研究以玉米自交系B73經(jīng)EMS誘變產(chǎn)生的籽粒突變體smk7為研究材料, 對(duì)突變籽粒的表型和顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察, 同時(shí)構(gòu)建不同遺傳背景的 F2分離群體, 開展性狀的遺傳解析和基因定位。結(jié)合對(duì)定位區(qū)間的基因注釋, 為候選基因的克隆及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

利用EMS誘變玉米B73自交系花粉構(gòu)建突變體庫, 經(jīng)過篩選獲得 1個(gè)表型可穩(wěn)定遺傳的小粒突變體smk7(small kernel 7)。由于smk7發(fā)芽率低, 且不能生長成正常植株, 我們將雜合植株(+/smk7)自交4代(M4)獲得的分離果穗用于突變表型分析。2017年和2018年在北京昌平基地, 分別以昌7-2、Mo17和鄭58為母本, 以M4代雜合植株(+/smk7)為父本, 雜交得到F1群體, 再自交獲得不同遺傳背景的F2分離群體。F2群體用于后續(xù)的遺傳分析和基因定位。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 掃描電鏡觀察淀粉粒結(jié)構(gòu) 取 M4代分離果穗上的野生型和突變體籽粒, 在 65℃烘箱內(nèi)連續(xù)烘 48 h確保籽粒完全脫水干燥, 把胚乳部分敲碎,固定在貼有導(dǎo)電條的圓形金屬樣品臺(tái)上, 置于離子濺射儀中鍍金膜, 用HITACHISU8020掃描電鏡對(duì)突變體胚乳的淀粉大小和結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察。

1.2.2 石蠟切片 取授粉后12 d的M4代分離果穗上的突變體和野生型籽粒, 用 FAA固定液保存,固定后的組織材料進(jìn)行脫水、透明、浸蠟與包埋, 將包埋好的蠟塊切片黏附于載玻片上, 然后蓋上蓋玻片在45℃烘箱里干燥。再用OLYMPLUS BX53正置顯微鏡(奧林巴斯, 日本)觀察并照相。

1.2.3 籽粒蛋白、油分和淀粉含量的測(cè)定 淀粉含量的測(cè)定: 取野生型籽粒和突變體籽粒在 65℃烘箱中烘6 h以上, 用磨樣機(jī)磨樣, 稱取2.5 g粉末, 加10 mL CaCl2-乙酸溶液潤濕, 再加50 mL CaCl2溶液充分混勻, 置于120℃油浴鍋中加熱30 min, 放入冷水槽冷卻至室溫, 將水解液全部加入帶漏斗100 mL容量瓶中, 并加1 mL硫酸鋅溶液搖勻, 在加1 mL硫酸亞鐵溶液充分沉淀蛋白質(zhì), 蒸餾水定容至100 mL, 搖勻過濾。用空白液調(diào)整旋光儀零點(diǎn), 再將濾液裝滿旋光儀室溫下測(cè)定。結(jié)果計(jì)算:

粗淀粉(%) = α×105/L × W × (100 ? H) × 203。

式中, α為旋光儀上讀出的旋轉(zhuǎn)角度; L為炫光管長度(dm); W為樣品重(g); 203為淀粉比旋度; H為樣品含水量(%)。

籽粒蛋白和油分測(cè)定: 用德國 BRUKER MPA近紅外光譜儀測(cè)定油分和蛋白含量, 分別選取大小均一的突變體和野生型籽粒置于樣品杯中, 用透射方式掃描獲得籽粒近紅外樣品的吸收光譜圖, 每個(gè)樣品重復(fù)裝樣掃描3次, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的蛋白和油分模型, 利用BRUKER公司的OPUS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 基因的初定位和精細(xì)定位 以突變體與Mo17雜交構(gòu)建的 F2群體為材料開展基因定位。提取F2果穗上的45粒突變籽粒及雙親的基因組DNA。委托博瑞迪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基于 20K GBTS(genotyping by target sequencing) 靶向測(cè)序基因型分型[3]。計(jì)算每個(gè)多態(tài)性 SNP標(biāo)記的基因型頻率(SNP index), 即親本型基因型占所有F2樣本基因型的頻率, SNP index越接近1, 表明標(biāo)記與目標(biāo)基因連鎖越緊密。然后用MaizeGDB和Gramene等網(wǎng)站比對(duì)和下載定位區(qū)間內(nèi)的核苷酸序列, 用 Primer 5等軟件開發(fā)InDel和SNP標(biāo)記。進(jìn)一步擴(kuò)大定位群體, 篩選標(biāo)記處的交換單株, 完成基因精細(xì)定位。

利用試劑盒 DP360 (天根生化科技(北京)有限公司)提取正常籽粒和突變籽粒的DNA, 操作步驟如下:樣品充分研磨, 加入裂解液, 渦旋離心, 轉(zhuǎn)移上清過柱, 將濾液和無水乙醇等體積混合, 將混合液過柱,倒掉濾液, 加漂洗液漂洗2次, 離心, 加ddH2O溶解2 min, 得到的DNA溶液置于–20℃保存。選用25 μL擴(kuò)增體系, 上下游引物各1.25 μL, PCR mix 12.5 μL,DNA 2 μL, ddH2O 8 μL。擴(kuò)增程序?yàn)? 98℃預(yù)變性3 min; 98℃變性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸30 s、共35個(gè)循環(huán); 72℃終延伸5 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 小粒突變體smk7的表型分析

smk7是玉米自交系 B73經(jīng) EMS誘變產(chǎn)生的小籽粒突變體。對(duì) M4和 F2代成熟分離果穗進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),smk7突變體與野生型相比, 種皮皺縮,籽粒扁小, 胚與胚乳發(fā)育缺陷(圖 1-A, B)。僅有10%的突變籽?？梢园l(fā)育成苗, 但幼苗植株生長發(fā)育緩慢, 葉色淺黃, 最終不能發(fā)育為正常植株(圖 1-C)。百粒重測(cè)量結(jié)果表明, 突變體籽粒百粒重顯著降低, 僅約野生型籽粒的 35% (圖 2)。對(duì)smk7和野生型籽粒胚乳結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn), 野生型淀粉粒呈球形, 形狀規(guī)則, 而突變體淀粉粒變小, 結(jié)構(gòu)不規(guī)則。突變體與野生型蛋白體結(jié)構(gòu)無明顯差異(圖3)。

2.2 小粒突變體smk7的籽粒成分測(cè)定

smk7突變體籽粒成分測(cè)定結(jié)果表明, M4代分離果穗的smk7突變籽粒淀粉含量和蛋白含量低于野生型籽粒, 油分含量突變籽粒略高于野生型籽粒,均未達(dá)到顯著水平。F2代分離果穗的smk7突變籽粒淀粉和油分含量顯著低于野生型, 而蛋白含量顯著高于野生型, 可能是由于不同背景的影響導(dǎo)致 F2代籽粒淀粉、油分和蛋白的含量發(fā)生變化(圖4)。

2.3 小粒突變體 smk7授粉后不同時(shí)期胚和胚乳的觀察分析

對(duì)授粉后12、15、18、21、25和30 d的M4代分離果穗進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn), 授粉后12 d即可明顯區(qū)分出smk7突變籽粒。與野生型籽粒相比,smk7籽粒明顯體積較小, 胚乳不飽滿, 胚發(fā)育遲滯, 幾乎不可見。隨著發(fā)育進(jìn)程的增加, 突變表型更加顯著, 授粉后21～25 d, 胚發(fā)育明顯滯后, 大小不足野生型胚的1/10, 胚乳灌漿不飽滿。授粉后30 d, 突變籽粒果皮和胚乳間出現(xiàn)較大空隙, 籽粒皺縮體積約為野生型的 1/3, 胚和胚乳略有增大, 但結(jié)構(gòu)畸形明顯, 以上結(jié)果表明smk7突變產(chǎn)生與籽粒發(fā)育的早期(圖 5-A,B)。進(jìn)一步對(duì)授粉后12 d的野生型和smk7籽粒制作石蠟切片, 顯微觀察發(fā)現(xiàn), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型籽粒相比, 突變體發(fā)育嚴(yán)重滯后, 突變體的胚乳轉(zhuǎn)移層細(xì)胞(BETL)存在明顯發(fā)育異常。授粉后12 d, 野生型籽粒 BETL區(qū)細(xì)胞發(fā)育完善, 成帶狀和基部胚乳細(xì)胞接觸更為緊密, 有明顯的細(xì)胞壁內(nèi)突, 而smk7突變體BETL區(qū)細(xì)胞與基部分離, 細(xì)胞壁內(nèi)突不明顯(圖 6)。由此推測(cè)SMK7基因突變可能導(dǎo)致BETL細(xì)胞發(fā)育異常, 影響母體營養(yǎng)物質(zhì)向胚和胚乳傳遞, 造成了籽粒的發(fā)育缺陷表型。

2.3 smk7受單隱性核基因控制

利用雜合植株(+/smk7)分別與自交系Mo17、昌7-2、鄭58雜交得到F1群體, F1自交獲得不同遺傳背景的F2群體。挑選雜合體F1植株進(jìn)行自交, 對(duì)M2、M3和 F2分離果穗中的小粒突變體和正常籽粒進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 計(jì)算分離比, 卡方測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明, 正常籽粒與突變籽粒之比均符合3∶1分離規(guī)律(χ2<3.84) (表2)。表明smk7小籽粒性狀受1對(duì)隱性單基因控制, 是細(xì)胞核遺傳。

2.4 SMK7基因的定位

表2 不同群體的遺傳分離比檢驗(yàn)Table 2 Genetic segregation test of different populations

以 Mo17為遺傳背景的 F2分離果穗為材料, 利用CTAB法提取45個(gè)粒突變籽粒及其親本DNA, 利用20K GBTS靶向測(cè)序技術(shù)分析樣本基因型。去除雜合及雙親之間無多態(tài)的位點(diǎn)后, 共得到 7903個(gè)SNP多態(tài)性標(biāo)記, 占總位點(diǎn)數(shù)的39.5%, 其中1號(hào)染色體最多為1314個(gè), 10號(hào)染色體最少為586個(gè)(圖7)。通過計(jì)算各條染色體, 每個(gè)多態(tài)性 SNP標(biāo)記的基因型頻率(SNP index), 發(fā)現(xiàn) 2號(hào)染色體上 0.04 Mb～9.54 Mb區(qū)間可能與目標(biāo)性狀連鎖(圖8)。擴(kuò)大定位群體, 提取 274個(gè)突變籽粒 DNA, 同時(shí)開發(fā)In0.83、In1.16、In1.9和 In4.3若干對(duì) InDel標(biāo)記, 將SMK7定位在0.83 Mb～1.9 Mb區(qū)間。繼續(xù)擴(kuò)大定位群體到 399, 開發(fā) SNP1、SNP2、SNP3、SNP4和SNP5等若干對(duì)SNP標(biāo)記, 最終將SMK7基因定位在 2號(hào)染色體的 SNP2和 SNP3兩個(gè) SNP標(biāo)記之間, 左側(cè)標(biāo)記處交換單株數(shù)為4, 右側(cè)標(biāo)記處交換單株數(shù)為 9, 物理距離為 120 kb (圖 9)。利用Gramene (http://www.gramene.org/)網(wǎng)站檢索到此區(qū)間內(nèi)含有 8個(gè)蛋白編碼基因。對(duì)Zm00001d00 1818和Zm00001d001820兩個(gè)基因進(jìn)行測(cè)序并和B73序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)無變化; 其余6個(gè)基因分別編碼:乙?；讣易宓鞍?Zm00001d001819)葉綠體 β亞基鄰氨基苯甲酸合成酶(Zm00001d001823)、Dof鋅指蛋白(Zm00001D001824)和 WD40重復(fù)超家族轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(Zm00001D001825); 還有 2個(gè)功能未知蛋白(Zm00001d001821和Zm00001d001822)(表 3)。

3 討論

籽粒是玉米主要營養(yǎng)儲(chǔ)存器官, 也是研究禾本科種子發(fā)育的模式器官。開展籽粒突變體研究對(duì)于克隆籽粒發(fā)育關(guān)鍵基因及解析籽粒發(fā)育調(diào)控分子機(jī)制具有重要意義。

本研究中smk7突變體屬于小粒(small kernel)類型突變體, 表現(xiàn)為胚和胚乳發(fā)育遲滯的表型。成熟的smk7突變體種子體積較小, 胚和胚乳發(fā)育缺陷, 尚有少數(shù)可以成苗, 幼苗具有黃化現(xiàn)象。這種表型不同于emp、emb等類型的突變體,emp是胚和胚乳嚴(yán)重缺陷的致死突變, 而emb突變體僅胚發(fā)育存在異常。小部分dek突變體表型與smk7類似, 如dek36、dek37、dek40、dek42[25]等發(fā)育成幼苗。對(duì)smk7授粉后12 d 的籽粒石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn), 突變體 BETL層細(xì)胞壁向內(nèi)生長受阻, 發(fā)育遲緩。胚乳基部轉(zhuǎn)移層是一類2～3層高度特異的細(xì)胞, 含有大量線粒體, 參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),激素合成等重要功能, 種子灌漿發(fā)育需要通過BETL從母體中獲取營養(yǎng)。表明SMK7基因可能調(diào)控胚乳基部轉(zhuǎn)移層細(xì)胞形成, 進(jìn)而影響胚和胚乳發(fā)育。

表3 候選區(qū)間內(nèi)基因信息Table 3 Gene information in the candidate region

目前已克隆的smk突變體有smk1、smk2、Zmsmk3、smk4、smk6和Zmsmk9[26-29]。smk1突變體胚和胚乳發(fā)育滯后, 種皮和胚乳之間有很大空腔,約 10%的突變籽?？擅劝l(fā)。SMK1基因編碼 1個(gè) E型PPR蛋白, 參與了線粒體nad7-836的編輯。smk2突變體籽粒變小, 胚敗育, 胚乳細(xì)胞少, BETL細(xì)胞發(fā)育受阻。SMK2位于4號(hào)染色體, 編碼谷氨酰胺酶參與vitamin B6的合成。Zmsmk3突變體表現(xiàn)為胚與胚乳發(fā)育滯后, BETL細(xì)胞發(fā)育嚴(yán)重受損, 約30%突變籽粒可萌發(fā)成苗。ZmSMK3位于 3號(hào)染色體, 編碼 1個(gè)線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子(mTERF)蛋白, 參與nad1的第4內(nèi)含子和nad4的第1內(nèi)含子剪切過程;smk4小粒突變體95%可以成苗, 但是植株生長發(fā)育緩慢且花期延后?；蚩寺〗Y(jié)構(gòu)表明SMK4位于 4號(hào)染色體編碼E亞類PPR蛋白, 參與線粒體cox1轉(zhuǎn)錄本 C-U的編輯;smk6是 1個(gè)小粒胚致死突變體,SMK6基因位于10號(hào)染色體, 該基因編碼E型PPR蛋白, 影響線粒體基因的編輯功能;Zmsmk9突變體胚與胚乳發(fā)育滯后, 但是能正常萌發(fā)并發(fā)育成株。ZmSMK9位于1號(hào)染色體, 編碼1個(gè)P型PPR蛋白,參與nad5的剪切。由此可知大部分smk突變均與線粒體功能缺陷有關(guān), 線粒體作為細(xì)胞的能量工廠和進(jìn)行有氧呼吸的主要場所, 在胚乳 BETL細(xì)胞功能及籽粒發(fā)育中具有重要的作用。

本研究中smk7被定位在 RM1433917～RM15 35316兩個(gè)SNP標(biāo)記之間, 物理距離約為120 kb。通過MaizeGDB和Gramene生物信息學(xué)網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)段包含了 8個(gè)新的蛋白編碼基因。對(duì)其中Zm00001d001818和Zm00001d001820進(jìn)行PCR擴(kuò)增并和誘變親本 B73進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)無突變位點(diǎn);Zm00001d001819編碼氮-乙酰氨基葡萄糖基磷脂酰肌醇-氮-乙?；讣易宓鞍? 目前今發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物, 酵母和原生動(dòng)物中有活性[30];Zm00001d001823的編碼葉綠體β亞基鄰氨基苯甲酸合成酶1, 可能參與IAA合成的色氨酸途徑[31]。在核分化過程中, IAA控制著糖和蛋白質(zhì)的代謝, 是胚乳 BETL形成的必要條件, IAA通過CK或ABA直接或間接地調(diào)控玉米醇溶蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄。Zm00001d001824編碼Dof鋅指蛋白, 廣泛參與碳氮代謝、花和花粉發(fā)育、種子發(fā)育和萌發(fā)、次生代謝、維管發(fā)育和葉片等植物生長發(fā)育過程。Zm00001d001825編碼WD40重復(fù)超家族轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白, 可能與 AP2形成復(fù)合物協(xié)同作用于網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[32]。玉米edh1突變體中與網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞作用的基因發(fā)生突變, 導(dǎo)致突變體籽粒變小, 因此 WD40也可能參與籽粒發(fā)育調(diào)控。所以后續(xù)還需通過候選基因測(cè)序、基因表達(dá)分析等分子實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定候選基因。

4 結(jié)論

本研究以B73為背景材料通過EMS誘變得到1個(gè)可以穩(wěn)定遺傳的籽粒突變體, 該突變體籽粒變小,胚和胚乳發(fā)育嚴(yán)重滯后, 胚乳 BETL層細(xì)胞發(fā)育遲緩, 細(xì)胞壁發(fā)育向內(nèi)生長受阻。利用圖位克隆將SMK7定位在 2號(hào)染色體短臂 RM1433917～RM1535316這2個(gè)SNP標(biāo)記內(nèi), 物理距離約為120 kb, 在該區(qū)間內(nèi)沒有已克隆的籽粒發(fā)育相關(guān)基因,因此SMK7可能是1個(gè)調(diào)控籽粒發(fā)育的新基因。