小麥TaPP2-A13基因的表達響應(yīng)逆境脅迫并與SCF復(fù)合體接頭蛋白TaSKP1相互作用

孟鈺玉 魏春茹 范潤僑 于秀梅,,* 王逍冬 趙偉全 魏新燕 康振生 劉大群

1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室, 河北保定071001; 2 河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治技術(shù)創(chuàng)新中心, 河北保定071001; 3 西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院 / 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室, 陜西楊凌712100

F-box蛋白是 SCF (SKP1-Cullin-F-box) 類 E3連接酶的重要組分。第一個F-box基序于1996年在Cyclin F蛋白的N端被發(fā)現(xiàn), 并因此而得名[1]。作為SCF復(fù)合體中特異性識別待降解底物的決定性蛋白,F-box蛋白廣泛地存在于植物中, 負責(zé)調(diào)控植物的生長發(fā)育、激素信號傳導(dǎo)、自交不親和及抵御脅迫等多個代謝過程。擬南芥(Arabidopsis thaliana)F-box蛋白 Hawaiian skirt和 UFO (Unusual floral organs)均參與花發(fā)育的過程[2-3]; 生長素受體TIR1和茉莉酸信號受體蛋白COI1 (Coronatine-insensitive 1)均由F-box基因編碼, 能與多種蛋白形成SCFTIR1和SCFCOI1, 繼而在植物生長發(fā)育及激素介導(dǎo)的生物/非生物逆境過程中發(fā)揮作用[4-5]; 植物的自交親和/不親和受雌蕊?；腟-RNase基因和多個花粉?；腟-位點F-box(SLF)基因共同調(diào)控。矮牽牛(Petunia inflata) F-box基因PiSLF2(S-locus F-box 2)編碼的花粉 S-決定因子可與花柱 S-決定因子發(fā)生相互識別,從而導(dǎo)致配子體的自交不親和[6]。據(jù)報道, 目前鑒定了17個SLF基因, 其中至少7個參與花粉的?；宰R別[7]; 在煙草(Nicotiana tabacum)中過表達小麥F-box基因TaFBA1可增強煙草的抗旱性及對熱、鹽和氧化脅迫的抵抗力[8-11]; F-box蛋白MAX2 (More axillary 2)不僅參與植物的發(fā)育, 而且在抵御病原細菌丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae,P. syringae)和胡蘿卜果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum,P.carotovorum)侵染及鹽和干旱脅迫過程中發(fā)揮作用[12]; F-box基因CPR30在擬南芥抵御病原細菌P.syringae的入侵過程中起著負調(diào)控作用[13]; 葡萄(Vitis vinifera) F-box基因BIG-24.1不僅受灰霉菌(Botrytis cinerea)的強烈誘導(dǎo), 對UV-C、傷害、SA、ABA、MeJA、乙烯等非生物脅迫和激素也反應(yīng)強烈[14]。由此可見, F-box家族在植物中發(fā)揮著廣泛而重要的作用, 近年來對其在抗病和抗逆中的作用引起愈加廣泛重視。

韌皮部為植物遠距離信息傳遞和大分子物質(zhì)的運輸提供了一條有效的途徑, 同時韌皮部也是植物防御病原物侵染的戰(zhàn)略要地。韌皮部蛋白 2(Phloem protein 2, PP2)是存在于植物韌皮部汁液中的一種最豐富和神秘的蛋白質(zhì), 以二聚體存在, 是具有幾丁質(zhì)結(jié)合功能的特殊凝集素[15]。韌皮部蛋白AtPP2-B11參與了擬南芥對干旱脅迫的響應(yīng), 且發(fā)揮負調(diào)控作用[16]; 擬南芥中 PP2-A1編碼韌皮部凝集素類似蛋白, 研究發(fā)現(xiàn)該蛋白具有分子伴侶和抗真菌侵染的雙重作用[17]; 南瓜(Cucurbita maxima)的韌皮部分泌蛋白 PP2可以將細菌和真菌固定在交聯(lián)的細絲上, 從而封閉受傷的韌皮部篩管, 使之免受病原菌的進一步侵染[18]; 黃龍病是柑橘(Citrus reticulate)上發(fā)生的一種世界級毀滅性病害。長春花(Catharanthus roseus)作為柑橘黃龍病的理想研究材料, 在受到黃龍病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas)感染后, 長春花中的PP2類蛋白呈現(xiàn)強烈誘導(dǎo)表達, 這可能導(dǎo)致胼胝質(zhì)沉積, 篩孔堵塞篩孔, 從而阻止病原菌的侵染[19];此外, PP2類蛋白CsPP2B15在高感CLas的品種錦橙(Citrus sinensis)嫩葉中受 CLas誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達, 而在耐病品種酸柚(Citrus grandis)的嫩葉中受CLas誘導(dǎo)顯著下調(diào)表達[20]; 苧麻(Boehmeria nivea)中鑒定了15個PP2蛋白, 這些蛋白的編碼基因在響應(yīng)非生物逆境、昆蟲及機械傷害的過程中呈現(xiàn)不同的反應(yīng)[21]。以上報道表明, 韌皮部蛋白2在抵御病原菌侵染, 昆蟲和機械傷害及非生物脅迫中均發(fā)揮重要作用。

綜上, F-box蛋白家族尤其韌皮部蛋白2亞家族(F-box/PP2, FBP)在植物抵御病原菌侵染和非生物脅迫過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。FBP成員在小麥中的功能如何, 是否參與小麥抵御生物及非生物脅迫過程, 目前尚未見報道。鑒于此, 本研究以小麥抗葉銹病近等基因系 TcLr15為材料, 在獲得小麥TaPP2-A13基因全長編碼區(qū)的基礎(chǔ)上, 借助生物信息學(xué)分析、qRT-PCR、亞細胞定位、酵母雙雜交(Yeast 2 Hybrid, Y2H)、雙分子熒光互補(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)和免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)等技術(shù), 明確該基因在逆境脅迫下的表達模式, 確定其亞細胞定位,并獲得與之互作的蛋白。研究結(jié)果將拓寬小麥中F-box家族基因的功能認識, 為深入解析TaPP2-A13在小麥抵御生物和非生物脅迫中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小麥和葉銹菌材料及處理方法

小麥抗葉銹病近等基因系TcLr15、小麥高感葉銹病品種鄭州 5389、供試葉銹菌株 05-19-43②和05-5-137③均由河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治技術(shù)創(chuàng)新中心提供。

鄭州 5389用于擴繁葉銹菌株 05-19-43②和05-5-137③的夏孢子, 方法參照 Kolmer[22]進行。小麥 TcLr15幼苗分別進行葉銹菌(05-19-43②和05-5-137③)侵染、激素(100 μmol L?1ABA、200 μmol L?1MeJA 和 2 mmol L?1SA)和非生物逆境(10%PEG、7 mmol L?1H2O2和 300 mmol L?1NaCl)處理,取樣時間及處理方法同于孟鈺玉等[23]的方法。

1.2 TaPP2-A13基因全長擴增

以小麥 TcLr15一葉一心期的葉片 cDNA作為PCR擴增的模板。自小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫 ExpVIP(wheat expression browser, http://www.wheat-expression.com/)中挖掘到 1條基因(TraesCS2D02G397700), 該基因與粗山羊草AetPP2-A13-like基因(GenBank登錄號為 XM_020331589.1)同源性高達 100%, 以此序列作為引物設(shè)計的模板, 設(shè)計克隆引物TaPP2-A13-F和TaPP2-A13-R (表 1)。PCR反應(yīng)總體系20 μL: cDNA模板1.0 μL、上、下游引物(10 μmol L?1)各 0.5 μL、2×EsTaqMaster Mix 10 μL、ddH2O 8 μL。PCR 擴增程序為 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s,58 ℃ 3 0 s, 72 ℃ 1 min, 33個 循 環(huán); 72 ℃ 1 0 min。擴增獲得的目的片段與 pMD19-T載體連接, 構(gòu)建pMD19-T-TaPP2-A13質(zhì)粒,然后將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。菌落PCR鑒定為陽性的克隆送至北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司進行序列測定。

表1 本實驗中涉及的引物信息Table 1 Primer information used in this study

1.3 生物信息學(xué)分析

DNAStar軟件將TaPP2-A13基因的編碼區(qū)翻譯為蛋白質(zhì)序列; ProtParam (https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)用于分析蛋白質(zhì)的分子量和等電點; ProtScale (https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)用于預(yù)測蛋白疏水性/親水性; SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)用于分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域; SOPMA (https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)和 Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)分別用于預(yù)測 TaPP2-A13蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu);SignalP 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)用于預(yù)測信號肽; TMHMM server v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和ProtComp 9.0 (http://www.softberry.com/)分別用于預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域及亞細胞定位; 利用MEGA7、Clustal X軟件和NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行多序列比對分析和進化樹構(gòu)建。

1.4 TaPP2-A13基因表達模式分析

以1.2獲得的TaPP2-A13基因全長序列為模板設(shè)計 qRT-PCR引物:TaPP2-A13-qPCR-F/TaPP2-A13-qPCR-R (表1)。RNA提取及第1鏈cDNA合成同于 1.2。以小麥三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,TaGAPDH,登錄號為EU022331.1)為內(nèi)參基因, 引物TaGAPDH-qPCR-F和TaGAPDH-qPCR-R序列見表1。qRT-PCR參 照 2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGen, 中國)說明書進行。反應(yīng)程序為94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s, 59.5 ℃ 15 s, 72 ℃ 10 s, 40個 循 環(huán) 。TaPP2-A13相對表達量采用 2?ΔΔCt計算, 利用Microsoft Excel 2013進行平均值和標準誤差的計算,利用SAS 9.4軟件的ANOVA進行方差分析。

1.5 亞細胞定位

根據(jù)目的基因編碼區(qū)和 GFP融合表達載體pSuper1300-GFP序列設(shè)計引物TaPP2-A13-GFP-F和TaPP2-A13-GFP-R (表 1)。以 pMD19-T-TaPP2-A13為模板擴增得到帶有XbaI和Spe I酶切位點的TaPP2-A13, 擴增體系與程序同于 1.2。擴增產(chǎn)物與pSuper1300-GFP載體連接, 構(gòu)建GFP融合蛋白的瞬時表達載體。測序驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株, 注射器吸取該菌液注入6～8周齡的煙草葉片。25℃培養(yǎng)30 h后, 以GFP-HQ熒光濾光塊(激發(fā)濾色鏡470 nm/40、分光鏡495 nm和吸收濾色鏡525 nm/50)在尼康倒置顯微鏡Ti2-U (Nikon, 日本)下觀察GFP綠色熒光, 以確定TaPP2-A13的亞細胞定位情況。

1.6 Y2H分析

用模板 pMD19-T-TaPP2-A13及引物TaPP2-A13-BD-F和TaPP2-A13-BD-R (表1)進行PCR擴增,將酶切位點引入TaPP2-A13兩側(cè), 擴增體系和程序同于1.2。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切后,與同樣雙酶切的pGBT9 (BD)載體連接, 重組載體命名為pGBT9-TaPP2-A13(BD-TaPP2-A13)。將其轉(zhuǎn)化酵母Y187后, 涂布在SD/-Trp (一缺)、SD/-Trp/-Leu(二缺)、SD/-Leu-Trp-His (三缺)和 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade (四缺)固體培養(yǎng)基上, 觀察酵母生長狀況,進行毒性和自激活活性驗證。

實驗室前期已構(gòu)建 TcLr15接種葉銹菌株05-19-43②的抗葉銹病性酵母 AH109文庫[24], 用誘餌載體 BD-TaPP2-A13篩選該文庫, 以獲取與TaPP2-A13互作的蛋白。具體操作參見 Hong等[25]的方法。以四缺平板上的單克隆為模板, 利用引物TaPP2-A13-BD-F和TaPP2-A13-BD-R進行菌落PCR,確認TaPP2-A13是否存在。再以pGADT7(AD)載體的通用引物AD-F和AD-R (表1)進行增, 鑒定捕獲蛋白基因及其片段大小。挑選條帶單一( >500 bp)的菌落PCR產(chǎn)物送北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司測序。

通過蛋白一對一互作方法驗證文庫篩選結(jié)果的準確性。首先將獲得的序列在 NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對, 根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計各篩選基因的全長擴增引物, 以小麥TcLr15葉片cDNA為模板, 獲得各篩選基因的全長編碼區(qū)。然后將各個篩選基因的編碼區(qū)序列分別與 AD載體連接, 構(gòu)建 AD-Prey載體。最后將AD-Prey和BD-TaPP2-A13共轉(zhuǎn)入酵母菌 AH109中, 共轉(zhuǎn)化后的菌液經(jīng)驗證后, 再分別稀釋為1∶1、1∶10和 1∶100, 各取0.5 μL稀釋后菌液接種至含有X-α-Gal的四缺平板上進一步篩選。

1.7 BiFC分析

根據(jù)目的基因編碼區(qū)和BiFC載體pSPY-NE序列設(shè)計引物TaPP2-A13-NE-F和TaPP2-A13-NE-R(表 1)。以 pMD19-T-TaPP2-A13為模板擴增得到帶有BamH I和SalI酶切位點的TaPP2-A13, 擴增體系與程序同于1.2。擴增產(chǎn)物與pSPY-NE載體連接,構(gòu)建BiFC載體pSPY-NE-TaPP2-A13, 隨后將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101。同時將 pSPY-CE和 pSPYCE-TaSKP1(已構(gòu)建)分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。將轉(zhuǎn)化 pSPY-CE-TaSKP1的農(nóng)桿菌與轉(zhuǎn)化 pSPY-NETaPP2-A13的農(nóng)桿菌混合, 以 pSPY-CE 和pSPY-NE-TaPP2-A13混合菌液為陰性對照, 用注射器吸取各混合菌液注入 6～8周齡的煙草葉片。25℃培養(yǎng) 40 h后, 觀察熒光信號及其分布, 儀器及設(shè)置同于1.5。

1.8 Co-IP分析

以TaSKP1和TaPP2-A13的編碼區(qū)序列分別設(shè)計引物TaSKP1-FLAG-F/TaSKP1-FLAG-R和TaPP2-A13-HA-F/TaPP2-A13-HA-R (表 1)。以 AD-TaSKP1為模板擴增得到帶有XbaI的TaSKP1, 以 pMD19-T-TaPP2-A13為模板擴增得到帶有MluI酶切位點的TaPP2-A13, 擴增體系與程序同于 1.2。pTF101-3FLAG和pTF101-6HA分別經(jīng)單酶切(XbaI和MluI)后與擴增產(chǎn)物連接, 構(gòu)建 Co-IP載體pTF101-3FLAG-TaSKP1和pTF101-6HA-TaPP2-A13,然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌(OD600為0.8) 1∶1混勻后注射 6～8周齡的煙草葉片。暗培養(yǎng)過夜, 然后轉(zhuǎn)入正常光周期(16 h光照/8 h黑暗), 25℃培養(yǎng)40 h后, 剪取注射的葉片, 提取其總蛋白。以帶有第一抗體anti-HA的beads孵育總蛋白。未經(jīng)孵育的總蛋白和孵育后的免疫沉淀物分別用anti-HA和anti-FLAG雜交, 以第二抗體羊抗兔IgG-HRP結(jié)合第一抗體。雜交完成的PVDF膜漂洗干凈后淋上混合液(等體積的 A液和 B液), 于 Odyssey Fc Imaging System(LI-COR Biosciences, 美國)上以固定程序Chemi曝光2 min, 以顯示目的蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 獲得一個小麥韌皮部蛋白 2編碼基因TaPP2-A13

以苗期小麥TcLr15的葉片cDNA為模板, 運用TaPP2-A13-F和TaPP2-A13-R擴增得到一特異條帶,大小與預(yù)期相符, 測序后確認該序列長度為 1361 bp。在小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中其 ID 為 Traes CS2D02G397700, 說明該基因序列位于小麥 2D染色體上。在 NCBI網(wǎng)站進行 BLASTx比對, 結(jié)果表明, 該序列與普通小麥 D染色體組的供體種粗山羊草(Aegilopstauschii, 登錄號為 XP_020187178.1)的PP2-A13-like相似性最高, 為 100%; 其次與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon, 登錄號為XP_010240281.1)中對應(yīng)序列相似性為 90.66%; 與短花藥野生稻(Oryzabrachyantha, 登錄號為XP_006652663.1, 84.87%)和小米(Setariaitalic, 登錄號為 XP_004976538.1, 80.53%)等禾本科植物的PP2-A13/PP2-A13-like相似性均大于 75%。根據(jù)以上比對結(jié)果, 將該基因命名為TaPP2-A13(登錄號為MT364339)。

TaPP2-A13基因編碼一個由 298個氨基酸組成的蛋白質(zhì)多肽鏈, 其相對分子量為 33.18 kD, 理論等電點為6.36, 平均親水系數(shù)為–0.322, 屬于親水性蛋白。TaPP2-A13蛋白第22～62位是F-box結(jié)構(gòu)域,第 128～287位具有 PP2結(jié)構(gòu)域, 為 F-box蛋白家族中FBP亞家族。經(jīng)預(yù)測, 該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占22.82%, β-轉(zhuǎn)角占6.04%, 無規(guī)則卷曲和β-折疊分別為 46.31%和 24.83%。三維結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-折疊構(gòu)成, 與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致。TaPP2-A13蛋白不含信號肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域, 暗示其既非分泌蛋白, 亦非跨膜蛋白。亞細胞定位預(yù)測顯示, TaPP2-A13定位在細胞核上。

利用Clustal X軟件對小麥TaPP2-A13與其他禾本科植物 PP2-A13進行氨基酸序列比對, 發(fā)現(xiàn)各氨基酸序列間均具有較高的相似性, 尤其是在 F-box結(jié)構(gòu)域和PP2結(jié)構(gòu)域 2個區(qū)域。F-box結(jié)構(gòu)域共包含41個氨基酸, 其中31個氨基酸是完全保守的, 5個氨基酸位點僅在一個物種(1個在二穗短柄草, 1個在短花藥野生稻和3個在玉米)中有差別。PP2結(jié)構(gòu)域共包含 160個氨基酸, 其中 112個氨基酸是完全保守的, 有12個氨基酸是僅在一個物種(1個在二穗短柄草, 1個在 II型少花古爾德草(Dichanthelium oligosanthes), 1個在短花藥野生稻, 2個在水稻, 1個在哈氏黍(Panicum hallii), 1個在黍子(Panicum miliaceum), 2個在狗尾草和3個在玉米)中有差別。高度保守的氨基酸說明其對于維持PP2-A13/PP2-A13-like的功能至關(guān)重要(圖1)。

采用MEGA7中的NJ (Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。根據(jù)親緣關(guān)系的遠近將進化樹分為 5個組。與小麥親緣關(guān)系最近的為小麥近緣種屬植物, 如粗山羊草、大麥(Hordeum vulgare)、二穗短柄草等, 其PP2-A13位于同一進化分支上(V組)。其中 TaPP2-A13與粗山羊草 AetPP2-A13的親緣關(guān)系最近, 其氨基酸序列完全一致。TaPP2-A13與IV組的玉米、高粱(Sorghum bicolor)、谷子(Setaria italica)和糜子(Panicum miliaceum)等的 PP2-A13親緣關(guān)系次之。稻類和彎葉畫眉草(Eragrostis curvula)的PP2-A13聚為一類(III組)。烏拉爾圖小麥處于單獨的分支, 為 II組。木本植物如胡楊樹(Populus euphratica)、小墊柳(Salix brachista)和銀葉玫瑰木(Rhodamnia argentea)等及雙子葉植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和石斛蘭(Dendrobium catenatum)等的 PP2-A13聚為一類(I組)。I組、II組和III組的PP2-A13序列與第V組相應(yīng)序列的親緣關(guān)系更遠些。

2.2 小麥中 TaPP2-A13在基因水平的表達響應(yīng)激素處理及生物和非生物脅迫

為了解TaPP2-A13基因受激素誘導(dǎo)表達的情況,分別對小麥TcLr15進行ABA、SA和MeJA處理。經(jīng) 3種外源激素處理后, 隨處理時間延長,TaPP2-A13基因均呈現(xiàn)穩(wěn)步地顯著上升表達趨勢。ABA處理0.5 h時,TaPP2-A13基因的表達量與0 h樣品無異, 自處理2 h時開始升高, 12 h時的表達量約為0 h樣品的5倍, 24 h突然降低至0 h樣品的3倍左右, 然后再次升高, 在所取樣時間范圍內(nèi), 48 h時表達量達到最高, 為0 h樣品的5.3倍; SA處理小麥葉片6 h時,TaPP2-A13基因的表達量與0 h樣品差異不大, 自 12 h開始表達量升高, 24 h時TaPP2-A13基因表達量達到最大, 為0 h樣品的6倍,48 h雖然有所下降但仍為對照的5.2倍; MeJA處理后, 小麥TaPP2-A13基因的表達量在6 h時開始緩慢升高, 在所取樣品的時間范圍內(nèi), 48 h時表達量達到最高, 為0 h樣品的2.8倍(圖3)。經(jīng)3種抗病/抗逆相關(guān)激素處理小麥TcLr15后, SA和ABA可以誘發(fā)TaPP2-A13基因更高的表達, 其中, ABA呈現(xiàn)更早的誘發(fā), 而SA誘導(dǎo)TaPP2-A13基因的表達更強。

本研究設(shè)置3種非生物逆境處理小麥TcLr15幼苗。在H2O2脅迫下, 隨著處理時間延長,TaPP2-A13基因整體呈現(xiàn)下調(diào)的表達趨勢。0.5 h的表達量與0 h樣品幾乎無差異, 自 2 h開始表達量持續(xù)下降, 至48 h時表達量僅為0 h的1/5; 在PEG模擬的干旱脅迫條件下, 從0.5 h開始TaPP2-A13基因表達量即出現(xiàn)明顯下降, 在所取樣的時間范圍內(nèi), 24 h時表達量最低, 僅為對照的3/50; NaCl處理后,TaPP2-A13基因在前3個時間點出現(xiàn)明顯地上調(diào)表達, 6 h時表達量為0 h的4.8倍, 而后表達量顯著下調(diào), 至24 h時達到最低值, 為0 h樣品的2/5 (圖4-A)。3種逆境條件下, 氧化脅迫和干旱脅迫使TaPP2-A13基因呈現(xiàn)顯著地下調(diào)表達, 而鹽脅迫則誘導(dǎo)TaPP2-A13基因在短時間內(nèi)顯著上調(diào)表達。

小麥 TcLr15與葉銹菌形成的感病(05-5-137③)及抗病(05-19-43②)組合中,TaPP2-A13基因均呈現(xiàn)先下調(diào)再上調(diào)的表達趨勢。在抗病組合中, 接種葉銹菌株05-19-43② 6 h后,TaPP2-A13的表達量即開始下降, 12 h達到最低, 為0 h的1/4, 隨后開始升高,48 h時的表達量恢復(fù)到與0 h樣品相同水平, 96 h時升高到0 h樣品的2.4倍; 在感病組合中, 接菌6 h的樣品表達量與0 h樣品無顯著變化, 12 h出現(xiàn)顯著下調(diào), 之后表達量開始升高, 在取樣的時間范圍內(nèi)96 h表達量達到最高值, 為 0 h樣品的 4.3倍(圖4-B)。比較抗/感病組合間表達的趨勢, 發(fā)現(xiàn)TaPP2-A13在感病組合各個時間點的表達量均高于抗病組合。

2.3 TaPP2-A13亞細胞定位于細胞核和細胞質(zhì)中

為明確TaPP2-A13在細胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能的場所, 本試驗對其亞細胞定位進行觀察。結(jié)果如圖5所示, 25℃培養(yǎng) 30 h時, 陽性對照葉片中的綠色熒光遍布整個視野, 表明實驗體系及煙草生長狀況均較好。但此時樣品中尚無綠色熒光出現(xiàn)。25℃繼續(xù)培養(yǎng)至48 h時, 在細胞核和細胞質(zhì)中可見較強綠色熒光。以上觀察結(jié)果表明TaPP2-A13定位在細胞核和細胞質(zhì)中。

2.4 TaPP2-A13與TaSKP1在細胞內(nèi)相互作用

2.4.1 酵母雙雜交確定5種蛋白與TaPP2-A13存在物理相互作用 為解析TaPP2-A13在細胞內(nèi)發(fā)揮作用的機制, 擬篩選胞內(nèi)與其有相互作用的蛋白并進行驗證。首先構(gòu)建誘餌表達載體 BD-TaPP2-A13,將其轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞 Y187后涂布于一缺、二缺、三缺和四缺平板上。經(jīng)驗證, 重組質(zhì)粒對酵母細胞無毒性, 亦無自激活能力。

以BD-TaPP2-A13為誘餌載體, 篩選酵母文庫。挑選20個擴增條帶單一且條帶大于500 bp的克隆進行序列測定。測序結(jié)果在 NCBI網(wǎng)站上進行BLASTx比對, 結(jié)果表明 11種候選蛋白可能與TaPP2-A13存在相互作用(表2)。其中一部分與植物光合和呼吸作用相關(guān), 如核酮糖二磷酸羧化酶小鏈(ribulose-bisphosphate carboxylase small chain,RbcS)、核酮糖二磷酸羧化酶活化酶 B (ribulose bisphosphate carboxylase activase B, RcaB)、RUBISCO活化酶 β基因(rca1_betagene for RUBISCO activase beta, TaRca1_beta)、核酮糖活化酶A (ribulose activase A, RcaA)和Fe-S蛋白的前體蛋白(Fe-S precursor protein)等[26-27]。另有一部分與植物生長發(fā)育、抗病及激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān), 如 SCF復(fù)合體骨架蛋白SKP1[28]、UDP葡萄糖類黃酮3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶 7 (UDP-glucose flavonoid 3-O-glucosyltransferase 7, UFGT7)[29]、蛋白磷酸酶(Protein phosphatase 2C 5, PP2C5)[30]、幾丁質(zhì)酶(Chitinase, CHI)[31]和酮酰 CoA 硫醇酶(3-ketoacyl-CoA thiolase 2, KAT2)[32]及 SEC1蛋白家族的 SLY1(SEC1 family transport protein SLY1)[33]等。

根據(jù)文庫篩選獲得序列, 結(jié)合實驗室前期研究結(jié)果, 開展酵母一對一互作驗證。構(gòu)建的重組質(zhì)粒AD-prey (篩選基因)分別與BD-TaPP2-A13共轉(zhuǎn)化酵母菌株 AH109, 在含有 X-α-Gal的四缺固體培養(yǎng)基上進行回復(fù)驗證。結(jié)果如圖6所示, AD-TaPP2C5、AD-TaSLY1、AD-TaCHI、AD-TaRbcS和 AD-TaSKP1分別與 BD-TaPP2-A13形成的 5個組合在含有X-α-Gal的四缺培養(yǎng)基上均能正常生長, 且菌落呈現(xiàn)藍色, 初步證明 TaPP2C5、TaSLY1、TaCHI、TaRbcS和 TaSKP1與 TaPP2-A13存在物理性相互作用。

2.4.2 BiFC確定TaPP2-A13與TaSKP1存在相互作用 將TaSKP1和TaPP2-A13分別與載體pSPY-CE和 pSPY-NE連接, 構(gòu)建 pSPY-CE-TaSKP1和 pSPY-NE-TaPP2-A13載體。將 pSPY-CE和pSPY-CE-TaSKP1分別與pSPY-NE-TaPP2-A13混合,注射煙草葉片, 培養(yǎng)40 h后進行熒光觀察。pSPY-CE和pSPY-NE-TaPP2-A13形成的陰性對照中無熒光信號, 實驗組合中可見綠色熒光信號, 且熒光信號主要集中在細胞核和細胞質(zhì)(圖 7), 表明 TaSKP1與TaPP2-A13存在相互作用。

表2 TaPP2-A13篩選酵母文庫的結(jié)果Table 2 Results of library screening by TaPP2-A13

2.4.3 Co-IP證實TaPP2-A13與TaSKP1在胞內(nèi)存在相互作用 構(gòu)建重組載體 pTF101-3FLAGTaSKP1和 pTF101-6HA-TaPP2-A13, 分別將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101, 混合2種菌液后共注射6～8周齡本氏煙草葉片。提取煙草總蛋白, 利用 HA和 FLAG抗體分別進行雜交實驗。已知TaPP2-A13的預(yù)測分子量為33.18 kD, TaSKP1的預(yù)測分子量為19.06 kD,載體上HA和FLAG標簽蛋白的分子量分別為7.54 kD和 4.06 kD。融合蛋白 TaPP2-A13-6HA和TaSKP1-3FLAG的分子量大小應(yīng)該為 40.72 kD和23.12 kD。由圖8可知, 未瞬時表達TaPP2-A13-6HA和 TaSKP1-3FLAG的煙草葉片, 其全蛋白無雜交的目的條帶, 而在瞬時表達 TaPP2-A13-6HA和TaSKP1-3FLAG的材料中, 其全蛋白與 HA抗體或FLAG抗體分別雜交獲得目的蛋白。進一步利用帶有 anti-HA的磁珠進行總蛋白的免疫沉淀, 沉淀蛋白中富含 TaPP2-A13-6HA和TaSKP1-3FLAG, 說明TaPP2-A13和TaSKP1在植物細胞內(nèi)是互作的(圖8)。

3 討論

利用同源克隆技術(shù)自小麥TcLr15中首次獲得了TaPP2-A13基因, 其編碼蛋白的 N端為一個保守的F-box結(jié)構(gòu)域, C端具有一個PP2結(jié)構(gòu)域, 屬于典型的FBP亞家族。本實驗室前期已得到了小麥F-box基因TaFBL14和TaSKP2A[34-35], 這 2個基因與TaPP2-A13雖然同屬于 F-box家族, 不同的是,TaFBL14和TaSKP2A的C端含有典型的LRR結(jié)構(gòu)域, 屬于FBL亞家族, 同時實驗室也已獲得了C端含有Kelch結(jié)構(gòu)域的FBK亞家族成員[36]。Zhou等[8]獲得的TaFBA1屬于FBA亞家族。由此可見, 小麥中存在不同類型的 F-box亞家族成員。各個亞家族成員是否存在功能差異尚未可知。

近年來, F-box蛋白在植物抵御病原細菌和真菌侵染中的作用日益引起關(guān)注。例如, F-box基因CPR30在擬南芥抵御病原細菌P. syringae的入侵過程中起著負調(diào)控作用[13]; 棉花(Gossypium hirsutum)F-box蛋白GhACIF1通過與GhSKP1互作增強陸地棉對棉花黃萎病致病菌-大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的抗性[37]; BIG-24.1是分離自葡萄葉片中的F-box蛋白, 當葡萄受到灰霉菌感染時, 葉片及漿果中BIG-24.1的表達量顯著上升[14]; 此外, SON1、MAX2、COI1、Nictaba等F-box家族成員在植物抵御病原菌侵染過程中均發(fā)揮著重要作用[38-40]。但尚未見 F-box蛋白在小麥抵御葉銹菌侵染過程中發(fā)揮作用的報道。本研究對小麥葉片中TaPP2-A13基因受葉銹菌侵染后的表達情況進行分析, 發(fā)現(xiàn)隨葉銹菌侵染進程的延伸, 該基因在抗病及感病組合中均呈現(xiàn)上調(diào)表達, 且在感病組合中呈現(xiàn)更加強烈的上調(diào)(96 h時, 感病組合的表達量是抗病組合的2倍)。長春花在遭受黃龍病菌感染后, 韌皮部蛋白基因PP2-B11和PP2-B15顯著上調(diào), 而PP2-A1和PP2-A13則下調(diào)。PP2-A13在受到不同病原菌侵染后呈現(xiàn)差異的表達模式。柑橘黃龍病致病菌為細菌,而小麥葉銹病菌為專性寄生真菌, 細菌和真菌在侵染植物后引起的抗/感病路徑不同, 啟動抗病相關(guān)基因的表達不同, 這可能是造成相同基因在不同植物-病原物組合中表達模式不同的主要原因。

植物 F-box蛋白也響應(yīng)各種非生物脅迫過程。例如, FBP7、DOR、MAX2等在響應(yīng)非生物脅迫方面均發(fā)揮重要作用[12,41-42]。TaPP2-A13基因受MeJA誘導(dǎo)呈現(xiàn)上調(diào)表達, 在SA、ABA和NaCl處理后呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的表達趨勢, 經(jīng)H2O2和PEG處理后,TaPP2-A13隨處理時間延長總體呈現(xiàn)顯著下調(diào)的表達模式, 說明TaPP2-A13的表達受到包括葉銹病菌侵染、外源激素和非生物逆境在內(nèi)的共同影響。相同的結(jié)果見于 F-box基因BIG-24.1, 該基因不僅受灰霉菌的強烈誘導(dǎo), 對 UV-C、傷害、SA、ABA、MeJA、乙烯等非生物脅迫和激素也反應(yīng)強烈[14]。這說明植物 F-box家族的一些成員參與多種非生物脅迫的調(diào)節(jié)過程。

本研究試圖找到胞內(nèi)與TaPP2-A13具有相互作用的蛋白。通過篩選抗葉銹病小麥 TcLr15的酵母cDNA文庫, 獲得了11種可能與TaPP2-A13互作的蛋白。但由于酵母文庫篩選方法假陽性率較高, 進一步運用 Y2H 確定 TaPP2C5、TaSLY1、TaCHI、TaRbcS、TaSKP1與TaPP2-A13存在相互作用。Hong等[25]發(fā)現(xiàn) TaKFB1和 TaKFB3經(jīng)過酵母文庫篩選分別獲得了 61個和 74個克隆, 進一步驗證確定TaKFB1與4個蛋白存在相互作用, TaKFB3與3個蛋白存在相互作用, 且這 2個 TaKFB蛋白都能與TaSKP1s蛋白相互作用。這說明1個F-box蛋白可識別多個底物, 且1個F-box蛋白可能與多個SKP1蛋白相結(jié)合。

SKP1是 SCF (SKP1-CUL1-F-box protein)復(fù)合體的組分, 能夠與F-box蛋白中的F-box結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合, 從而參與靶蛋白的泛素化過程。經(jīng)預(yù)測,TaPP2-A13和TaSKP1均無信號肽結(jié)構(gòu), 且TaSKP1的亞細胞定位預(yù)測結(jié)果為細胞核, 這為二者在空間上互作提供了可能性。據(jù)報道, AtPP2-B11能與SCF復(fù)合體骨架蛋白 SKP1家族成員 ASK7、ASK18和ASK19互作, 暗示其具有 F-box蛋白的功能。同時過表達牡丹(Paeonia suffruticosa)PSK1基因的擬南芥耐鹽性得到顯著提高[28], 同樣的結(jié)論在大豆GmSK1過表達的煙草中得到了印證, 此外, 過表達GmSK1的煙草還表現(xiàn)出對干旱脅迫有較強的耐受性。本研究通過Y2H、BiFC和Co-IP實驗證實TaPP2-A13與TaSKP1存在相互作用, 因此推測TaPP2-A13可能為SCF復(fù)合體的組分, 通過與TaSKP1結(jié)合實現(xiàn)其響應(yīng)生物/非生物逆境過程的作用。

PP2C5是可以調(diào)控植物ABA信號通路的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶, 該酶既影響植物的生長發(fā)育,又在植物抵御非生物脅迫和抗病過程中發(fā)揮作用[30];SLY1屬于SEC1蛋白家族, 其亞細胞定位為高爾基體。酵母中的 SLY1參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的囊泡運輸過程[43]。目前, SEC1家族蛋白的研究主要集中在酵母、線蟲(Limnodrilus hoffmeisteri)和大鼠(Rattus norvegicus)中[33], 其在植物中的研究鮮見報道; CHI在植物體中普遍存在, 病原真菌攻擊、真菌細胞壁的刺激和乙烯等均能誘導(dǎo)植物體內(nèi)幾丁質(zhì)酶的快速積累。此外, 幾丁質(zhì)酶也會響應(yīng)重金屬、滲透壓和干旱等非生物逆境脅迫[44]。在活體外, 幾丁質(zhì)酶能高度抑制真菌的生長[31]。根據(jù)Melchers等[45]的分類方法, 本研究中獲得的小麥 TaCHI為 I類幾丁質(zhì)酶。煙草中的I類幾丁質(zhì)酶定位于植物液泡中[46],本研究中獲得的 TaCHI亞細胞定位預(yù)測也是液泡中。RbcS基因編碼的蛋白質(zhì)已被證明影響 Rubisco的催化效率、組裝、活性及其穩(wěn)定性[47]。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中RbcS的表達存在組織特異性且受光的誘導(dǎo)[27]。本文通過Y2H技術(shù)證實TaPP2-A13分別與TaPP2C5、TaSLY1、TaCHI和TaRbcS存在相互作用, 該結(jié)果仍需其他蛋白互作技術(shù)深入驗證。

4 結(jié)論

自小麥抗葉銹病近等基因系TcLr15中分離了1個小麥FBP亞家族基因TaPP2-A13; 該基因所編碼蛋白在小麥近緣種屬中的進化比較保守; 定位于細胞核和細胞質(zhì)上; 受葉銹菌侵染、外源激素和非生物逆境處理后,TaPP2-A13基因表達量呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的顯著變化。文庫篩選獲得11種與TaPP2-A13互作的蛋白, Y2H 驗證表明 TaPP2C5、TaSLY1、TaCHI、TaRbcS、TaSKP1與TaPP2-A13存在物理相互作用, BiFC和 Co-IP深入研究確定 TaSKP1與TaPP2-A13存在相互作用。