OsPAL2;3對(duì)水稻化感抑制稗草能力的調(diào)控作用

李蘭蘭 母 丹 嚴(yán) 雪 楊陸可 林文雄 方長(zhǎng)旬

福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 / 福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建福州 350002

在稻–稗競(jìng)爭(zhēng)的自然生態(tài)系統(tǒng)中, 一些水稻品種具有抑制稗草生長(zhǎng)的特性, 該特性也稱為水稻的化感作用, 即水稻通過根系分泌特定的次生化合物抑制鄰近雜草生長(zhǎng)的化學(xué)生態(tài)學(xué)現(xiàn)象[1-3]。王海斌等[4]在田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果顯示, 種植不同化感水稻品種的田間小區(qū)內(nèi)的雜草生物量較種植非化感水稻的小區(qū)減少32%～60%。徐正浩等[5]研究結(jié)果也顯示,直播和小苗移栽條件下, 化感水稻品種對(duì)無芒稗株高、分蘗和干重均有較好的抑制作用, 且水稻仍保持一定產(chǎn)量水平。由此可見, 種植化感水稻能夠控制田間稗草, 從而減少化學(xué)除草劑的使用。

稗草(Echinochloa crusgalliL.)為禾本科植物,其與水稻的生長(zhǎng)期、株型等生物學(xué)性狀極為相似, 具有作物擬態(tài)特性, 為水田中最難防除的惡性雜草[6]。針對(duì)伴生稗草, 化感水稻能夠通過調(diào)控自身的苯丙氨酸解氨酶基因(OsPAL)、9β-海松-7,15-二烯合酶基因(OsKSL4)、同向柯巴基二磷酸合酶基因(OsCPS4)、momilactone A合酶基因(OsMAS)、類黃酮3’-羥化酶基因(CYP75B3,CYP75B4)等次生代謝不同途徑上的關(guān)鍵基因的表達(dá), 分別合成原兒茶酸、香豆酸、肉桂酸、對(duì)羥基苯甲酸等酚酸類化合物, 麥黃酮(tricin)、黃酮 O-糖苷等黃酮類化合物, 以及二萜化合物momilactones等抑制稗草生長(zhǎng)的化感物質(zhì)[7-10]。其中, 酚酸類化合物在水稻化感抑草中的作用已有廣泛研究[11-22]。自然條件下, 化感水稻中酚酸類化合物含量顯著高于非化感水稻品種[23]; Li等[24]測(cè)定了化感水稻PI312777和非化感水稻Lemont培養(yǎng)液中酚酸的含量, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)三到七葉期PI312777培養(yǎng)液中的酚酸含量均極顯著高于 Lemont, 其中六葉期最高, 達(dá)710 μg 株–1。水稻中酚酸含量與調(diào)控酚酸類合成的關(guān)鍵酶——苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的表達(dá)水平密切相關(guān); 稗草脅迫、氮素脅迫、茉莉酸和水楊酸信號(hào)分子誘導(dǎo)等處理下, 水稻的PAL基因表達(dá)增強(qiáng), 且 PI312777增強(qiáng)表達(dá)倍數(shù)顯著高于Lemont[13-15,25-28]。

水稻基因組中含有9個(gè)PAL基因成員, 稗草競(jìng)爭(zhēng)干擾下化感水稻PI312777中PAL基因家族有8個(gè)基因成員上調(diào)表達(dá), 而Lemont僅3個(gè)基因成員上調(diào)表達(dá)[29]?；虮磉_(dá)由生物體內(nèi)反式作用因子(轉(zhuǎn)錄因子)作用于順式作用原件(啟動(dòng)子區(qū)域)所決定[30], 通過比較化感水稻和非化感水稻的PAL基因啟動(dòng)子的活性, 從中尋找在化感水稻中轉(zhuǎn)錄活性高于非化感水稻的PAL基因成員及其啟動(dòng)子, 有助于深入揭示特定PAL基因成員對(duì)水稻化感抑草的調(diào)控作用。為此, 本研究通過比較化感水稻PI312777和非化感水稻 Lemont的PAL基因成員的啟動(dòng)子組成序列及活性差異, 揭示在化感水稻中轉(zhuǎn)錄水平高的PAL基因成員對(duì)水稻化感抑草能力的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與種植

以國(guó)際上公認(rèn)的化感水稻品種PI312777和非化感水稻品種Lemont為供試材料[12,30]。采用25%次氯酸鈉溶液分別對(duì)PI312777和Lemont種子表面消毒30 min, 然后無菌水清洗10次, 并置于恒溫培養(yǎng)箱中 30℃浸泡過夜, 隨后保濕催芽。發(fā)芽的水稻種子播于表面懸浮聚乙烯網(wǎng)布的種植盆中, 盆內(nèi)添加水稻完全營(yíng)養(yǎng)液, 盆的外表面均勻涂布黑漆以防止?fàn)I養(yǎng)液中產(chǎn)生綠藻。將種植盆置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d, 培養(yǎng)條件為28℃下光照培養(yǎng)14 h (光照強(qiáng)度 360 μmol m–2s–1)、22℃下暗培養(yǎng) 10 h, 相對(duì)濕度保持 85%左右; 每周更換新鮮營(yíng)養(yǎng)液, 培養(yǎng)液 pH 5.5～6.0。待水稻長(zhǎng)至四葉一心時(shí), 取水稻葉片, 液氮速凍, 用于基因組DNA和總RNA的提取。

1.2 水稻基因組DNA提取及PAL基因啟動(dòng)子克隆與測(cè)序

采用植物基因組 DNA提取試劑盒(CW0553S,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司), 分別提取2個(gè)水稻品種葉片的基因組DNA。分別以PAL家族各基因成員的CDS上游3000 bp左右的序列作為該基因啟動(dòng)子的模板序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表 1), 采用KOD-Plus (TOYOBO, Japan)高保真酶從PI312777和Lemont的基因組DNA中分別擴(kuò)增PAL基因成員的啟動(dòng)子DNA片段, 測(cè)序比較2種水稻的同一個(gè)PAL基因成員啟動(dòng)子的序列組成差異。

1.3 水稻OsPAL2;3啟動(dòng)子活性檢測(cè)

將啟動(dòng)子與含有報(bào)告基因(GFP)的表達(dá)載體(pCambia3301)進(jìn)行融合, 構(gòu)建重組表達(dá)載體, 采用PEG4000介導(dǎo)[31-32]轉(zhuǎn)化方法將OsPAL2;3、OsPAL2;4基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體細(xì)胞, 28℃暗培養(yǎng)36 h, 利用激光共聚焦顯微鏡觀察水稻原生質(zhì)體細(xì)胞中綠色熒光蛋白發(fā)光情況。

1.4 OsPAL2;3基因克隆及遺傳轉(zhuǎn)化水稻

采用 TRIzol試劑(Invitrogen, USA)提取水稻葉片的總 RNA, 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。以O(shè)sPAL2;3(Os02g0626600)基因的CDS序列為模板擴(kuò)增OsPAL2;3基因, 并通過無縫克隆連接到 pCambia-2300-eYFP質(zhì)粒載體上, 構(gòu)建OsPAL2;3基因融合eYFP的重組表達(dá)載體, 將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌(EHA105)感受態(tài)細(xì)胞中, 分別遺傳轉(zhuǎn)化 PI312777和 Lemont。基因OsPAL2;3的遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織的方法[33-34], 通過遺傳霉素G418篩選抗性愈傷, 經(jīng)分化和脫分化獲得過表達(dá)OsPAL2;3轉(zhuǎn)基因T0代水稻植株, 收獲T0代轉(zhuǎn)基因水稻種子進(jìn)行萌發(fā), 采用PCR在OsPAL2;3過表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化水稻的基因組 DNA中擴(kuò)增融合OsPAL2;3基因CDS和eYFP序列的DNA片段鑒定重組表達(dá)載體的有效轉(zhuǎn)化, 同時(shí)采用Western-blotting檢測(cè)eYFP融合蛋白的表達(dá), 獲得T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻幼苗。

表1 本研究中所用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.5 qPCR檢測(cè)過表達(dá) OsPAL2;3轉(zhuǎn)基因PI312777水稻較其野生型株系的基因表達(dá)變化

采用TRIzol試劑分別提取過表達(dá)OsPAL2;3轉(zhuǎn)基因PI312777及其野生型植株的葉片總RNA, 采用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)合成 cDNA。qPCR采用 TransStart Green qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司),利用realplex4熒光定量PCR儀(Eppendorf, Germany),檢測(cè)OsPAL2;3過表達(dá)水稻和野生型PI312777的苯丙氨酸代謝途徑中OsPAL2;3、OsC4H、OsCOL、OsOMT、OsCAD五個(gè)基因的表達(dá), 以β-actin為內(nèi)參基因, 采用2?ΔΔCT計(jì)算基因在過表達(dá)OsPAL2;3的轉(zhuǎn)基因PI312777水稻較其野生型株系的表達(dá)變化[35]。

1.6 酚酸類化合物含量測(cè)定

分別取 1 g過表達(dá)OsPAL2;3的 PI312777和Lemont轉(zhuǎn)基因水稻及其野生型株系葉片, 液氮條件下研磨成粉末, 用50 mL蒸餾水在20℃下浸提24 h,浸提液用 0.22 μm 濾膜過濾, 并用磷酸將濾液調(diào)至pH 4.0, 加入NaCl溶液, 使?jié)舛冗_(dá)到8% (w/v)并超聲溶解。取經(jīng)蒸餾水—甲醇—蒸餾水(8 mL–8 mL–5 mL)活化的Cleanert PEP固相萃取小柱(天津博納艾杰爾科技有限公司)吸附、萃取浸提液中的代謝物,隨后加入3 mL超純水洗脫鹽分, 再用8 mL色譜級(jí)甲醇洗脫, 收集洗脫液, 冷凍干燥后用色譜級(jí)甲醇溶解至500 μL, 測(cè)試的每種水稻樣本均提取3個(gè)重復(fù)。采用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行對(duì)提取的樣本中的酚酸化合物進(jìn)行定量分析, 以對(duì)羥基苯甲酸、原兒茶酸、肉桂酸、阿魏酸、香草酸、對(duì)香豆酸、丁香酸、水楊酸作為標(biāo)準(zhǔn)酚酸對(duì)照樣品。HPLC檢測(cè)采用 Waters e2695型高效液相色譜儀, 色譜柱為ZORBAX Sb-C18 (150.0 mm × 4.6 mm, ID 5 m), 紫外檢測(cè)器, 酚醛柱; 流動(dòng)相: B-甲醇(色譜純)和C-0.1%磷酸溶液(分析純)、檢測(cè)波長(zhǎng)為 280 nm、流速 1.3 mL min–1、進(jìn)樣量 10 μL、柱溫 30℃。

1.7 OsPAL2;3過表達(dá)水稻抑草率檢測(cè)

分別收集過表達(dá)OsPAL2;3的轉(zhuǎn)基因 PI312777和Lemont及其野生型植株的根系分泌液, 過濾除雜后加入新鮮配制的水稻完全營(yíng)養(yǎng)液母液作為不同處理組, 每組中溶液的體積為0.5 L, 以新配制的終濃度與處理組一致的水稻完全營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照組, 將處理組和對(duì)照組溶液的pH調(diào)至5.5～6.0之間, 每個(gè)處理組以及對(duì)照組均設(shè)6個(gè)重復(fù)。將生長(zhǎng)一致的二葉期稗草種植于上述溶液中, 每個(gè)種植罐中種植 6棵,培養(yǎng) 14 d, 測(cè)量稗草根長(zhǎng)和株高; 隨后將每個(gè)罐中的稗草置于105℃殺青30 min, 80℃烘干3 d后測(cè)定干物質(zhì)重量, 計(jì)算不同處理方式較對(duì)照組對(duì)稗草生長(zhǎng)的抑制率, 其計(jì)算公式為IR = (1-TR/CT)×100%。其中, IR (inhibition ratio)為抑制率; TR (treatment)為處理組生長(zhǎng)指標(biāo); CT (control)為對(duì)照組生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.8 OsPAL2;3互作蛋白的分離與鑒定

將三葉一心期的過表達(dá)OsPAL2;3轉(zhuǎn)基因PI312777與Lemont分別與稗草共培7 d后, 取完全展開的倒二片葉于液氮中速凍, 根據(jù)Fang等[36]方法提取水稻葉片的天然活性蛋白, 將天然活性蛋白與GFP-Trap agarose beads (ChromoTek, Germany)進(jìn)行孵育, 獲得 OsPAL2;3的互作蛋白, 采用 Thermo Q-exactive質(zhì)譜平臺(tái)進(jìn)行蛋白鑒定, 并利用 Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/)的水稻蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.9 雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)驗(yàn)證OsPAL2;3的蛋白互作

分別克隆OsPAL2;3、ATP合酶 α亞基(ATP synthase subunit alpha)、ATP合酶β亞基(ATP synthase subunit beta)、轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase)、碳酸酐酶(carbonic anhydrase)、果糖 1,6-二磷酸醛縮酶(fructose-bisphosphate aldolase)基因的CDS, 將這些基因分別與含有黃色熒光蛋白 N端的質(zhì)體載體pCambia2300-YFPn、含有黃色熒光蛋白 C端的質(zhì)體載體 pCambia2300-YFPc融合, 構(gòu)建重組表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá), 煙草的轉(zhuǎn)化參照Fang等[36]的方法, 在轉(zhuǎn)化后48 h, 利用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8X DLS)觀察煙草葉片的黃色熒光蛋白發(fā)光情況, 驗(yàn)證OsPAL2;3與Co-IP獲得的蛋白的有效互作。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、相關(guān)性分析和回歸分析, 應(yīng)用LSD算法進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAL家族基因成員啟動(dòng)子序列組成

分別克隆了 PI312777和 Lemont兩種水稻的PAL基因家族中7個(gè)基因成員(OsPAL2;1,OsPAL2;2,OsPAL2;3,OsPAL2;4,OsPAL4;1,OsPAL4;2,OsPAL11)的CDS序列上游3000 bp左右的片段(圖1-a), 分別回收這些啟動(dòng)子DNA片段進(jìn)行測(cè)序, 比較2個(gè)水稻品種的同一PAL基因成員的啟動(dòng)子序列組成。結(jié)果顯示, 2個(gè)水稻品種的OsPAL2;1、OsPAL2;2、OsPAL4;1、OsPAL4;2、OsPAL11五個(gè)基因成員的啟動(dòng)子序列組成相似度較高, 而OsPAL2;3、OsPAL2;4基因啟動(dòng)子序列差異較大(圖1-b)。

2.2 PI312777和 Lemont的OsPAL2;3,OsPAL2;4基因啟動(dòng)子活性差異

分別將 PI312777和 Lemont的OsPAL2;3、OsPAL2;4基因啟動(dòng)子融合GFP的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體細(xì)胞, 通過激光共聚焦顯微觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度, 結(jié)果顯示OsPAL2;3基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的 GFP的熒光強(qiáng)度 PI312777明顯強(qiáng)于Lemont, 而OsPAL2;4基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP的熒光強(qiáng)度 PI312777略弱于 Lemont (圖 2)。由此可見,OsPAL2;3啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性PI312777大于Lemont, 而OsPAL2;4基因啟動(dòng)子的活性PI312777略小于Lemont。

2.3 過表達(dá)OsPAL2;3轉(zhuǎn)基因水稻的表現(xiàn)

通過構(gòu)建OsPAL2;3的重組表達(dá)載體分別遺傳轉(zhuǎn)化PI312777和Lemont, 過表達(dá)水稻在經(jīng)PCR檢測(cè)重組載體有效遺傳轉(zhuǎn)化后, 利用標(biāo)簽蛋白 eYFP的抗體, 對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行 Western-blotting檢測(cè),結(jié)果在過量表達(dá)OsPAL2;3的轉(zhuǎn)基因水稻中檢測(cè)到OsPAL2;3融合 eYFP蛋白的表達(dá), 在野生型對(duì)照植株中未檢測(cè)到該融合蛋白(圖 3-a); 同時(shí)采用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因水稻根系中 eYFP的熒光情況, 結(jié)果也顯示在過量表達(dá)OsPAL2;3的轉(zhuǎn)基因水稻植株中檢測(cè)到黃色熒光信號(hào), 而在野生型植株中未檢測(cè)到該熒光信號(hào)(圖3-b), 上述結(jié)果表明OsPAL2;3重組載體已成功遺傳轉(zhuǎn)化水稻且穩(wěn)定表達(dá)。

2.4 過表達(dá)OsPAL2;3水稻與野生型株系的苯丙氨酸代謝途徑主要基因的表達(dá)變化

利用 qPCR檢測(cè)了苯丙氨酸代謝途徑中OsPAL2;3、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase,OsC4H), O-甲基轉(zhuǎn)移酶(O-methyltransferases,OsOMT)、輔酶A連接酶(CoA-ligases,OsCOL)、肉桂醇脫氫酶(cinnamoyl alcohol dehydrogenases,OsCAD)5個(gè)基因在過表達(dá)OsPAL2;3的轉(zhuǎn)基因PI312777水稻及其野生型株系中的表達(dá)差異, 結(jié)果顯示過量表達(dá)OsPAL2;3基因后, 轉(zhuǎn)基因水稻苯丙氨酸代謝途徑中的OsPAL2;3、OsC4H、OsOMT、OsCOL、OsCAD基因均較其野生型株系上調(diào)表達(dá), 分別為野生型株系的2.44、1.81、1.24、1.36和1.64倍(圖 4)。

2.5 過表達(dá)OsPAL2;3水稻與野生型株系的酚酸類化合物含量

通過檢測(cè)過表達(dá)OsPAL2;3的轉(zhuǎn)基因PI312777和 Lemont及野生型PI312777和Lemont株系葉片中酚酸化合物的含量, 結(jié)果顯示, 過量表達(dá)OsPAL2;3后, 轉(zhuǎn)基因PI312777和Lemont中的原兒茶酸和香草酸的含量較其各自的野生型株系中的含量有所增加; 此外, 轉(zhuǎn)基因 PI312777中的丁香酸、4-香豆酸的含量較野生型PI312777中的含量也有所增加, 對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、水楊酸和肉桂酸的含量有所下降。轉(zhuǎn)基因 Lemont中的水楊酸的含量較其野生型植株有所增加, 對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸、肉桂酸在轉(zhuǎn)基因植株中的含量較野生型植株有所降低(表2)。上述結(jié)果表明,過量表達(dá)OsPAL2;3能提高水稻中部分酚酸類化合物的含量。

2.6 過表達(dá)OsPAL2;3水稻及其野生型株系的抑草率

為研究OsPAL2;3基因表達(dá)水平對(duì)水稻化感抑草作用的影響, 進(jìn)一步比較過表達(dá)OsPAL2;3轉(zhuǎn)基因水稻和野生型株系的抑草率。分別收集過表達(dá)OsPAL2;3轉(zhuǎn)基因水稻及其野生型植株的根系分泌液,用于培養(yǎng)稗草, 以不含水稻根系分泌液為對(duì)照, 測(cè)定稗草株高與根系長(zhǎng)度, 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因PI312777的根系分泌液顯著抑制稗草的根長(zhǎng)和株高(圖5)。

表2 OsPAL2;3過表達(dá)水稻與野生型植株中的酚酸類化合物的含量Table 2 Contents of phenolic acids in the OsPAL2;3-OX transgenic rice lines and its wild type

測(cè)算過表達(dá)水稻及其野生型株系對(duì)稗草的抑制率, 結(jié)果顯示, 野生型 PI312777對(duì)稗草根長(zhǎng)、株高、干重的抑制率分別為 18.73%、14.69%和33.33%; 過表達(dá)OsPAL2;3的轉(zhuǎn)基因PI312777對(duì)稗草的根長(zhǎng)、株高、干重的抑制率達(dá)39.31%、15.61%和44.44%。過表達(dá)OsPAL2;3明顯提高了PI312777對(duì)稗草根長(zhǎng)和植株干物質(zhì)重的抑制率。與之相似,野生型Lemont根系分泌物對(duì)稗草根長(zhǎng)、株高、干重的抑制率分別為12.19%、11.57%和22.22%; 過表達(dá)OsPAL2;3的轉(zhuǎn)基因Lemont根系分泌液對(duì)稗草的根長(zhǎng)、株高、干重的抑制率為8.48%、16.38%和 27.78%, 過表達(dá)OsPAL2;3也提高了 Lemont對(duì)稗草株高和植株干物質(zhì)重的抑制率(表3)。通過對(duì)比上述結(jié)果可見, 過量表達(dá)OsPAL2;3能夠提高水稻對(duì)稗草干物質(zhì)重的抑制作用, 阻礙稗草的正常生長(zhǎng)。

表3 OsPAL2;3轉(zhuǎn)基因水稻及其野生型植株根系分泌液培養(yǎng)的稗草形態(tài)指標(biāo)Table 3 Root length, plant height and dry weigh of barnyardgrass growth in the solution with root exudates from OsPAL2;3-OX transgenic rice and the wild type

2.7 OsPAL2;3的互作蛋白檢測(cè)

為明確 OsPAL2;3在水稻體內(nèi)的互作蛋白, 利用基于GFP-Trap的Co-IP體內(nèi)獲得OsPAL2;3的互作蛋白(圖 6), 對(duì) OsPAL2;3的互作蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定, 結(jié)果顯示 OsPAL2;3可與多個(gè)蛋白相互作用, 對(duì)其中豐度高的蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn), OsPAL2;3與核酮糖二磷酸羧化大鏈前體(ribulose bisphosphate carboxylase large chain precursor)、ATP合酶α亞基(ATP synthase subunit alpha, ATP-synα)、碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)、ATP合酶β亞基(ATP synthase subunit belta, ATP-synβ)、果糖-二磷酸醛縮酶(fructose-bisphospate aldolase isozyme, FBA)、轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase)、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase protein)和脂肪氧合酶(lipoxygenase)等蛋白可能存在互作(表4)。

表4 OsPAL2;3互作蛋白的鑒定結(jié)果Table 4 Identification of the proteins interaction with OsPAL2;3

2.8 BiFC驗(yàn)證OsPAL2;3與互作蛋白的有效互作

進(jìn)一步利用BiFC驗(yàn)證OsPAL2;3與Co-IP獲得的蛋白的有效互作, 通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察, 結(jié)果顯示, OsPAL2;3分別與 ATP合酶 α亞基(ATP-synα)、碳酸酐酶(CA)、ATP合酶 β亞基(ATP-synβ)、果糖-二磷酸醛縮酶(FBA)和轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase)共轉(zhuǎn)的煙草葉片中均觀察到黃色熒光,這些熒光主要分布在煙草葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上, 細(xì)胞核上未觀察到明顯的黃色熒光, 表明OsPAL2;3蛋白與ATP合酶α亞基、碳酸酐酶、ATP合酶β亞基、果糖-二磷酸醛縮酶、轉(zhuǎn)酮醇酶均存在相互作用, 且這種相互作用主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(圖 7), 該結(jié)果進(jìn)一步說明 OsPAL2;3與多個(gè)蛋白相互作用共同參與苯丙氨酸代謝過程。

3 討論

酚酸類化合物是水稻化感抑草中的重要化感物質(zhì)[11-22]。水稻中酚酸的含量與PAL基因的表達(dá)水平密切相關(guān), 化感水稻中PAL基因表達(dá)豐度明顯高于非化感水稻, 其合成與分泌的酚酸類化合物的總量也高于非化感水稻[15,24]。當(dāng)利用 RNAi技術(shù)抑制化感水稻中PAL基因的表達(dá)后, 與酚酸類合成相關(guān)的下游6個(gè)酶對(duì)應(yīng)的編碼基因也下調(diào)表達(dá)、酚酸類化合物含量減少、化感抑草作用顯著降低[37]。

水稻中的PAL是一個(gè)基因家族, 其基因成員分別位于水稻的2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、11號(hào)、12號(hào)染色體上[38]。本研究對(duì)化感水稻PI312777和非化感水稻Lemont的PAL家族基因成員的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆和測(cè)序分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種水稻的OsPAL2;3和OsPAL2;4基因啟動(dòng)子序列存在較為明顯的差異。啟動(dòng)子序列的組成差異使得啟動(dòng)子的活性不同, PI312777的OsPAL2;3基因啟動(dòng)子對(duì)綠色熒光蛋白報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)強(qiáng)于 Lemont的OsPAL2;3基因啟動(dòng)子, 而PI312777的OsPAL2;4基因啟動(dòng)子活性則較Lemont的OsPAL2;4基因啟動(dòng)子的活性弱。稗草共培下,PI312777中OsPAL2;3蛋白的表達(dá)水平高于Lemont水稻[36]。PI312777中 OsPAL2;3的表達(dá)豐度高促使其酚酸含量也較高, 其中原兒茶酸和香草酸在PI312777中的含量顯著高于 Lemont; 增強(qiáng)OsPAL2;3的表達(dá)后, PI312777和Lemont中這2種酚酸化合物的含量均有所提高, 轉(zhuǎn)基因 PI312777和Lemont水稻較其各自野生型植株對(duì)稗草的抑制作用增強(qiáng), 表明OsPAL2;3可能通過調(diào)控苯丙氨酸代謝途徑中原兒茶酸和香草酸等酚酸類化合物的含量, 提高水稻的化感抑草能力?；兄参锿ㄟ^自身調(diào)控、合成并分泌化感物質(zhì)進(jìn)入環(huán)境, 并與土壤微生物相互作用, 最終決定對(duì)靶標(biāo)植物的化感作用效應(yīng)[39-40]。添加不同酚酸至土壤中能顯著促進(jìn)土壤微生物群體數(shù)量的增加, 同時(shí)土壤中酚酸的濃度逐漸降低, 表明酚酸可與土壤微生物產(chǎn)生相互作用[41]。PI312777水稻根際的黃色粘球菌就能與酚酸類化感物質(zhì)相互作用, 增強(qiáng)抑草能力, 其中阿魏酸與黃色粘球菌相互作用下的稗草抑制率達(dá) 64.82%, 遠(yuǎn)高于阿魏酸和黃色黏球菌單獨(dú)作用下的抑制率(34.64%和8.26%)[12]。因此, 過量表達(dá)水稻的OsPAL2;3可能通過提高原兒茶酸和香草酸等酚酸類的含量, 并與環(huán)境中的相關(guān)微生物相互作用, 最終提高抑草能力。抑制PI312777的PAL基因表達(dá)后, 水稻的化感抑草能力下降, 根際微生物數(shù)量與多樣性降低[37]。蛋白與蛋白之間通過相互作用參與代謝催化, PAL酶通過催化苯丙氨酸的脫氨反應(yīng), 使 NH3釋放出來形成反式肉桂酸[42]。已有的研究顯示, OsPAL2;3受到絲裂原活化蛋白激酶 11 (mitogen-activated protein kinase 11, MAPK11)的調(diào)控作用[36]。本研究還發(fā)現(xiàn),OsPAL2;3還與ATP合酶α、β亞基、碳酸酐酶、轉(zhuǎn)酮醇酶以及轉(zhuǎn)氨酶等相互作用, 其中, ATP酶是生物體中能量合成的關(guān)鍵酶, 該酶廣泛存在于線粒體、葉綠體以及光合細(xì)菌中, 在細(xì)胞內(nèi)催化能源物質(zhì)ATP的合成, 其α亞基的C端結(jié)構(gòu)域能與β亞基相互作用, 而β亞基的C端結(jié)構(gòu)域也能與α亞基相互作用[43], 進(jìn)而合成ATP, 供OsPAL2;3的催化反應(yīng)。轉(zhuǎn)酮醇酶催化卡爾文循環(huán)(calvin cycle)和氧化戊糖磷酸途徑(OPPP)的反應(yīng), 并產(chǎn)生赤藻糖-4-磷酸, 這也是從莽草酸途徑到苯丙烷代謝的前體物質(zhì)[44]。碳酸酐酶則催化 CO2與 HCO3?之間的可逆反應(yīng), 其可為酚酸合成時(shí)的羧化作用提供 CO2[45]。由此可見,OsPAL2;3通過與這些互作蛋白的共同作用, 催化合成酚酸類化合物。

4 結(jié)論

化感水稻 PI312777和非化感水稻 Lemont的PAL基因家族的啟動(dòng)子序列組成存在差異, 導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性不同。PI312777的OsPAL2;3基因啟動(dòng)子的活性高于Lemont中該基因啟動(dòng)子的活性, 過量表達(dá)OsPAL2;3基因, 水稻的酚酸類物質(zhì)含量增加, 化感抑草能力增強(qiáng), 表明OsPAL2;3能夠通過調(diào)控水稻的酚酸類化合物合成, 進(jìn)而調(diào)控水稻化感抑草作用。OsPAL2;3與ATP合酶α亞基、ATP合酶β亞基、轉(zhuǎn)酮醇酶、碳酸酐酶、果糖二磷酸醛縮酶、轉(zhuǎn)氨酶等蛋白相互作用, 共同調(diào)控苯丙氨酸代謝。OsPAL2;3可作為利用分子遺傳育種提高水稻化感抑草潛力的候選基因。