游泳運動對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)MCT2表達及學習記憶的影響

高文濤，孫曼曼，王 彥

(河南醫(yī)學高等?？茖W校人體解剖學教研室，鄭州 451191)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)多發(fā)病于老年群體,臨床特征主要表現(xiàn)為記憶障礙、失語、認知和運動功能障礙。針對其發(fā)病機制，有學者[1-5]提出了能量代謝假說，該學說認為，除了葡萄糖之外，機體在無氧酵解過程中產(chǎn)生的乳酸、酮體等物質(zhì)在神經(jīng)元活動中也可作為重要的能量來源，尤其當機體處于缺氧、損傷等應急狀態(tài)下，葡萄糖供應量不足，乳酸等單羧酸類物質(zhì)就扮演著“救命稻草”的角色。單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白(monocarboxylate transporter,MCTs)負責單羧酸類物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)哺乳動物腦內(nèi)存在MCT1、MCT2和MCT4三種亞型[6-8]，三者協(xié)同作用，促使乳酸等物質(zhì)在膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元之間相互轉(zhuǎn)運，介導腦組織能量代謝，維持神經(jīng)元的興奮及神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。本實驗擬通過對已經(jīng)出現(xiàn)認知障礙的AD模型小鼠進行4周游泳訓練，檢測腦組織中MCT2的表達和對學習記憶的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠購自南京大學動物模式研究中心，野生型(WT)C57BL/6小鼠購自河南省動物實驗中心，[許可證號：SYXK(豫)2016-0002]。選擇10只雄性AD模型小鼠和20只同月齡雌性WT小鼠，按AD:WT=1:2比例合籠繁殖，取子代小鼠鼠尾組織基因提取進行鑒定，結(jié)果陽性的進行飼養(yǎng)實驗，同時飼養(yǎng)同月齡WT小鼠，每組保證12只，飼養(yǎng)采用自然光照，光照/黑暗為12 h/12 h，溫度20～26 ℃，自由攝水和飲食，動物處理符合動物倫理學標準。

1.1.2 試劑和儀器 PCR引物由上海捷端生物工程有限公司合成，瓊脂糖(西班牙Biowest Agarose，11860)，基因擴增儀(美國 Thermo Fisher)。MCT2多克隆抗體MCT2(D-5)(美國Santa Cruz，SC-166925)，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(中國碧云天，A0216)，RIPA裂解液(中國碧云天，P0013B)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(中國索萊寶，P1200)，特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(中國碧云天，P0018AM)，脫脂奶粉(中國碧云天，P0216-1500g)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天，P0010S)，PVDF膜(美國Thermo Fisher，T2234)，使用Alphlmager 2200對膠片進行掃描，適當?shù)恼{(diào)節(jié)亮度和對比度使條帶顯影效果最好時拍下圖片保存，而后采用該主機上配套的Image J 軟件，測定Western Blot 結(jié)果的灰度值。生物素標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(中國碧云天，A0286)，DAB顯色試劑盒(中國碧云天，P0203)，用NiKON DS-Fi2顯微鏡觀察，圖像采集處理用NiS-Elements F Version 4.0。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及訓練 PCR鑒定后的AD模型小鼠和WT小鼠飼養(yǎng)至5月齡，分為3組，具體如下表示：未訓練WT小鼠(WT-NT組)，未訓練AD模型小鼠(AD-NT組)，訓練的AD模型小鼠(AD-T組)。其中AD-T組給予4周游泳訓練；WT-NT組和AD-NT組正常飼養(yǎng)，不給予任何干預條件。訓練方法：每周5 d，周三、日休息，其他時間每天50 min，結(jié)束之后進行下一步實驗。

1.2.2 行為學檢測 動物模型制作完畢后，首先對小鼠進行行為學檢測，檢測小鼠通過訓練后學習、記憶等能力的改變。具體方法包括：隱蔽平臺實驗和空間探索實驗。選用儀器Morris水迷宮，分析軟件Smart 3.0。

將圓形水池通過電腦軟件劃分成4個象限，并且做好標記：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。將水池中放置一個實驗平臺于第Ⅱ象限。水池周圍用幕布遮擋，盡量避免外周因素的干擾，每天傍晚對小鼠進行行為學檢測，依次將小鼠從各個象限置入水中，觀察記錄小鼠的行走軌跡和時間。每日一次，連續(xù)5 d，之后開始空間探索實驗?？臻g探索實驗：行為學檢測第6 天，將平臺撤掉，將軟件系統(tǒng)的時間設置為60 s，從第Ⅰ象限將小鼠置入水中，記錄小鼠60 s內(nèi)在原先放置平臺的象限停留的時間百分比。

1.2.3 Western Blot檢測 各組隨機選取6只小鼠，質(zhì)量分數(shù)10%水合氯醛麻醉后，在冰上斷頭，取出腦組織，放入離心管，迅速置于-80 ℃冰箱保存。按每20 mg組織中加入200 μL裂解液(高效RIPA組織/細胞裂解液)，快速研碎后，將勻漿液置入離心管在4 ℃下12 000 r，高速離心5 min，離心后的上清液采用BCA蛋白定量試劑盒進行測量，加上樣緩沖液，100 ℃煮沸20 min。按照試劑盒說明配置凝膠，放入電泳槽，加入電泳液。按順序在凝膠中加入Marker及蛋白樣品。設置好電壓后開始電泳，電泳結(jié)束后根據(jù)預染Marker的位置分離出目的蛋白條帶。覆上PVDF膜，加入轉(zhuǎn)膜液開始轉(zhuǎn)膜。稀釋后的脫脂奶粉封閉PVDF膜，搖床3 h，孵育MCT2(1∶1 000)，搖床上4 ℃過夜后，加入二抗(生物素標記的山羊抗小鼠IgG 1∶1 000)，室溫下孵育2 h。PBS清洗后采用ELC發(fā)光液顯影，并進行圖像分析，測出灰度值。

1.2.4 免疫組織化學檢測 將每組剩余的6只小鼠進行腹腔注射質(zhì)量分數(shù)10%水合氯醛至深度麻醉后，固定小鼠于解剖臺，依次剪開皮膚和組織，暴露心臟，連接微量灌注泵，首先用生理鹽水沖洗，然后換入質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛磷酸緩沖液進行固定，觀察小鼠身體變硬，組織變白，迅速斷頭、去骨、剝腦，將取出腦組織再次置于質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛緩沖液，放入4 ℃冰箱，固定24 h。入石蠟包埋，切片3 μm，依次通過脫蠟、復水，PBS清洗，抗原修復液修復，封閉、孵育抗體MCT2(1∶60)過夜，加二抗(生物素標記的山羊抗小鼠IgG 1∶60)37 ℃孵育30 min，滴加工作液(1:60)，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明，中性樹膠封片。完成染色過程，進行觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 模型動物的鑒定 WT小鼠和AD模型小鼠合籠繁殖，待子代小鼠達1月齡時，采用鼠尾組織基因提取法對其進行鑒定、篩選。鑒定結(jié)果所示，擴增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，在成像分析系統(tǒng)下觀察到條帶范圍在350 bp左右，是鑒定出的AD模型小鼠。見圖1。

圖1 AD模型小鼠的鑒定結(jié)果

2.2 行為學檢測

2.2.1 隱蔽平臺實驗 在隱蔽平臺實驗中，隨著時間的推移，WT-NT組尋找平臺的潛伏期和逃避路程均低于AD-NT組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2A。經(jīng)過4周游泳訓練的AD-T組尋找平臺的潛伏期和路程低于AD-NT組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2B。

注：A:AD-NT的逃避路徑和逃避潛伏期均高于WT-NT(P<0.05)；B:AD-NT逃避路徑和逃避潛伏期均高于AD-T(aP<0.05)。圖2 隱蔽平臺實驗結(jié)果

2.2.2 空間探索實驗 在隱蔽平臺實驗結(jié)束后1 d，對小鼠進行空間定位能力的檢測，結(jié)果顯示，在60 s內(nèi)，WT-NT在目標象限停留的時間比高于AD-NT組；AD-T在目標象限停留的時間比明顯高于AD-NT組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3A-3B。

注：A:空間探索實驗中小鼠的運動軌跡圖。B:小鼠在目標象限停留的時間比，WT-NT組和AD-T 60 s內(nèi)在目標象限停留的時間高于AD-NT組 (aP<0.05)。

圖3 空間探索實驗結(jié)果

2.3 Western Blot檢測結(jié)果 經(jīng)過4周游泳的AD-T組小鼠腦組織中MCT2的蛋白表達量高于AD-NT組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 Western Blot 檢測結(jié)果

2.4 免疫組織化學檢測 對小鼠大腦皮層和海馬部位進行免疫組織化學染色觀察，MCT2在這兩個區(qū)域均呈現(xiàn)高表達趨勢，表達在AD-T組和AD-NT組之間未出現(xiàn)明顯的差異。見圖5。

圖5 免疫組織化學檢測(標尺=100 μm)

3 討論

目前,研究[9-13]已經(jīng)證實了AD的病理改變主要發(fā)生在兩大方面：海馬出現(xiàn)大量β-淀粉樣蛋白沉積，逐漸形成老年斑；神經(jīng)細胞內(nèi)Tau蛋白出現(xiàn)異常磷酸化，形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，后期可在影像學技術(shù)上觀察到腦組織萎縮。學者們[14-16]研究發(fā)現(xiàn)的AD特征性病理改變，利用DNA重組技術(shù)培育出了能夠穩(wěn)定遺傳此病理變化的理想動物模型—APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，從4月齡開始，小鼠腦內(nèi)已經(jīng)逐漸形成老年斑。實驗采用5月齡的AD模型小鼠以確保小鼠完全表現(xiàn)出AD癥狀。

能量正常代謝是維持機體活動的重要條件，疾病發(fā)生、發(fā)展的整個過程常常伴隨能量代謝的異常和紊亂，而腦組織是高度耗能的部位，針對中樞神經(jīng)退行性疾病提出能量代謝假說。20世紀末，有學者[17-18]提出了星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元乳酸穿梭假說，并通過一系列實驗證實，存在跨膜轉(zhuǎn)運蛋白MCTs，其是一種協(xié)助單羧酸類物質(zhì)進行跨膜轉(zhuǎn)運的載體。目前在哺乳動物體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了14種MCTs的亞型，其中MCT1、MCT2、MCT4三種存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并且具有協(xié)同介導乳酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)運的能力。MCT1、MCT4存在于星形膠質(zhì)細胞，而MCT2主要高表達于神經(jīng)元細胞膜，其在葡萄糖不足的情況下來發(fā)揮作用，使機體完成生理功能[19-20]。

本實驗結(jié)果顯示，在隱蔽平臺實驗中AD模型小鼠平均逃避路程和逃避潛伏期明顯高于WT-NT小鼠，相反空間探索實驗中在目標象限停留的時間則低于WT-NT小鼠，表明選擇實驗月齡段的小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了AD癥狀。再進行下一步的實驗：將在5月齡時開始給予4周游泳訓練至6月齡的AD模型小鼠作為AD-T組，正常飼養(yǎng)達到6月齡的AD模型小鼠為AD-NT組，分別對其進行行為學以及組織學檢測，其結(jié)果是AD-T組小鼠逃避路程和潛伏期低于AD-NT組，而在目標象限停留的時間比則高于AD-NT組。Western Blot檢測整個腦組織勻漿蛋白中MCT2的表達量AD-T組較AD-NT組有增高趨勢，皮層和海馬部位的免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)MCT2均呈高表達趨勢。本實驗結(jié)果提示 AD模型小鼠經(jīng)過規(guī)律游泳運動，提高了學習、記憶等認知功能，相應改善了AD癥狀，MC在皮層和海馬部位呈現(xiàn)高表達趨勢，訓練前后沒有明顯差異。