UPLC-MS/MS法同時測定杞菊地黃膠囊中7種有效成分

王珊 劉紅梅 劉兵 譚文波 童巧珍 劉湘丹

〔摘要〕 目的 建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時測定杞菊地黃膠囊中莫諾苷、綠原酸、馬錢苷、木犀草苷、丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇C、23-乙酰澤瀉醇B的含量。方法 采用ACQUITY UPLC[R][○] HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，流速為0.3 mL·min-1;采用電噴霧電離源（ESI）、多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）模式對7種有效成分進(jìn)行測定。結(jié)果 每粒杞菊地黃膠囊樣品中莫諾苷含量為0.28～0.35 mg，綠原酸含量為0.08～0.11 mg，馬錢苷含量為0.30～0.48 mg，木犀草苷含量為0.21～0.48 mg，丹皮酚含量為0.62～0.76 mg，23-乙酰澤瀉醇C含量為0.04～0.08 mg，23-乙酰澤瀉醇B含量為0.15～0.32 mg。7種有效成分相關(guān)系數(shù)為0.999 0～1.000 0;平均回收率（n=6）為97.72%～99.12%，RSD為0.61%～2.01%。結(jié)論 該方法專屬性強(qiáng)、靈敏高、重復(fù)性好，適用于杞菊地黃膠囊中莫諾苷、綠原酸、馬錢苷、木犀草苷、丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇C和23-乙酰澤瀉醇B 7種有效成分的同時測定。

〔關(guān)鍵詞〕 杞菊地黃膠囊;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;莫諾苷;綠原酸;馬錢苷;木犀草苷;丹皮酚;23-乙酰澤瀉醇C;23-乙酰澤瀉醇B

〔中圖分類號〕R284.1 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.011

Simultaneous Determination of Seven Effective Components in Qiju Dihuang

Capsule by UPLC-MS/MS

WANG Shan1， LIU Hongmei1， LIU Bing1， TAN Wenbo1， TONG Qiaozhen2， LIU Xiangdan2

（1. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China;

2. College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To establish an UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of seven effective components （morroniside， chlorogenic acid， loganin， luteolin-7-O-glucoside， paeonol， 23-acetate alisol C， 23-acetate alisol B） in Qiju Dihuang Capsule. Methods The ACQUITY UPLC[R][○]HSS T3 （100 mm×2.1 mm， 1.8 μm） column was adopted with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%-formic acid with gradient elution at the flow rate of 0.3 mL·min-1. Electrospray ionization （ESI） and multiple reactive ion monitoring （MRM） modes were used to determine the seven active components. Results The contents of morroniside， chlorogenic acid， loganin， luteolin-7-O-glucoside， paeonol， 23-acetate alisol C， 23-acetate alisol B in the samples per capsule were 0.28～0.35， 0.08～0.11， 0.30～0.48， 0.21～0.48， 0.62～0.76， 0.04～0.08， 0.15～0.32 mg. Correlation coefficient values of the 7 active components were among 0.999 0～1.000 0; the average recovery rates were among 97.72%～99.12% （n=6）， and the RSD were among 0.61%～2.01%. Conclusion The method established is specific， sensitive and reproducible， which is suitable for the determination of seven effective components （morroniside， chlorogenic acid， loganin， luteolin-7-O-glucoside， paeonol， 23-acetate alisol C， 23-acetate alisol B） in Qiju Dihuang Capsule.

〔Keywords〕 Qiju Dihuang Capsule; UPLC-MS/MS; morroniside; chlorogenic acid; loganin; luteolin-7-O-glucoside; paeonol; 23-acetate alisol C; 23-acetate alisol B

杞菊地黃膠囊收載于2020年版《中華人民共和國藥典》一部，處方系由枸杞子、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓和鹽澤瀉八味藥組成，其中枸杞子、菊花、熟地黃為君藥，熟地黃滋陰補(bǔ)腎，枸杞子補(bǔ)腎益精、養(yǎng)肝明目;菊花善清利頭目、宣散肝經(jīng)之熱。配伍山茱萸養(yǎng)肝澀精，山藥補(bǔ)脾固精，兩藥都可協(xié)助熟地黃以充復(fù)腎中陰精，共為臣藥。又配澤瀉瀉腎利濕，并防熟地黃之滋膩;牡丹皮清瀉肝火，并制山茱萸之溫澀;茯苓健脾滲濕，以助山藥之補(bǔ)脾，共為佐藥。諸藥配伍，共湊滋腎養(yǎng)肝的功效，臨床主要用于肝腎陰虧、眩暈耳鳴、羞明畏光、迎風(fēng)流淚、視物昏花等癥[1]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對處方中的枸杞子、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓進(jìn)行了控制，其中含量測定項(xiàng)分別采用不同的高效液相色譜方法對方中臣藥酒萸肉和佐藥牡丹皮中單個有效成分進(jìn)行了定量測定，君藥菊花、熟地黃以及佐藥鹽澤瀉在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中并未進(jìn)行控制，故現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)存在一定的缺陷。本文首次采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法同時測定君藥菊花中的綠原酸和木犀草苷、臣藥酒萸肉中的莫諾苷和馬錢苷、佐藥牡丹皮中的丹皮酚以及鹽澤瀉中的23-乙酰澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C 7種有效成分，建立的方法對杞菊地黃膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善具有十分重要的意義。

1 主要儀器與試藥

LCMS-8050三重四級桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津有限公司）;Mettler Toledo MS105DU電子天平（梅特勒托利多集團(tuán)）;AS30600B型超聲波清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

莫諾苷（批號：111998-202104，純度：96.8%）、綠原酸（批號：110753-202018，純度：96.1%）、馬錢苷（批號：111640-201808，純度：99.0%）、木犀草苷（批號：111720-201810，純度：93.5%）、丹皮酚（批號：110708-201908，純度：99.8%）、23-乙酰澤瀉醇C（批號：12062-202102，純度：99.2%）、23-乙酰澤瀉醇B（批號：111846-202006，純度：98.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院;杞菊地黃膠囊共5批，分別來自湖南省湘中制藥有限公司（批號分別為190801、191001、191102）和通化茂祥制藥有限公司（批號：分別為20201001、20201203）。

水為娃哈哈純凈水;乙腈為色譜純，美國霍尼韋爾公司;甲醇為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 ?溶液制備

混合對照品溶液的制備：分別精密稱取莫諾苷、綠原酸、馬錢苷、木犀草苷、丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇C、23-乙酰澤瀉醇B對照品適量，加70%甲醇溶解并制成濃度依次分別為0.204 2、0.200 4、0.216 8、0.212 4、0.240 8、0.200 8、0.207 0 mg·mL-1的單個對照品儲備液，分別精密量取對照品儲備液適量，用70%甲醇稀釋20、25、50、200、400、2000倍，制成系列濃度的混合對照品溶液，即得。

供試品溶液制備：精密稱取本品0.3 g，置100 mL量瓶中，加70%甲醇約80 mL，超聲處理30 min，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2 ?儀器分析條件

2.2.1 ?液相色譜條件[2] ?色譜柱為ACQUITY UPLC[R][○]HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～12 min，乙腈由3%變至100%;12～17 min，100%乙腈;17～17.1 min，乙腈變?yōu)?%;17.1～22 min，維持3%乙腈。流速：0.3 mL/min;柱溫：35 ℃。

2.2.2 ?質(zhì)譜條件[3-6] ?離子源：電噴霧離子源（ESI）;源電壓4 KV;氮?dú)饬魉伲? L·min-1;加熱氣流速：10 L·min-1;干燥器氣流速：10 L·min-1;接口溫度：300 ℃;離子傳輸管溫度：250 ℃;加熱模塊溫度：400 ℃;各成分質(zhì)譜分析參數(shù)詳見表1，混合對照品溶液和供試品溶液的典型圖譜見圖1。

2.3 ?方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 ?線性關(guān)系 ?分別精密量取“2.1”項(xiàng)下的系列濃度混合對照品溶液3 μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，依法測定。以定量離子的峰面積對濃度進(jìn)行回歸分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，7種有效成分在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.999 0。

2.3.2 ?檢出限和定量限 ?精密量取線性最低點(diǎn)的混合對照品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取3 μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖，以3倍信噪比估算各組分的檢測限，以10倍信噪比估算各組分的定量限，7種有效成分的檢測限為0.23～0.52 ng·mL-1，定量限為0.77～1.73 ng·mL-1。各成分檢測限、定量限見表2。

2.3.3 ?重復(fù)性試驗(yàn) ?精密稱取同一杞菊地黃膠囊樣品（批號：190801）6份，按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)儀器條件下進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算各組分的含量，結(jié)果可知，莫諾苷、綠原酸、馬錢苷、木犀草苷、丹皮酚、23-乙酰澤瀉醇C、23-乙酰澤瀉醇B平均含量依次分別為0.93、0.27、1.02、0.73、2.06、0.14、0.51 mg·g-1，RSD在0.82%～1.93%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 ?精密度試驗(yàn) ?取重復(fù)性項(xiàng)下的同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，各組分峰面積的RSD在0.98%～1.87%，表明該方法精密度良好。

2.3.5 ?穩(wěn)定性試驗(yàn) ?取重復(fù)性項(xiàng)下的同一供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)儀器分析條件下，分別于0、3、5、8、12、18 h進(jìn)樣測定，以各組分的峰面積為指標(biāo)計算RSD，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果各組分峰面積RSD在0.81%～2.04%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 ?加樣回收率 ?取已知含量的供試品（批號：190801）0.15 g，精密稱定，共6份，分別精密加入對照品貯備液適量（莫諾苷0.70 mL、綠原酸0.20 mL、馬錢苷0.70 mL、木犀草苷0.50 mL、丹皮酚1.20 mL、23-乙酰澤瀉醇C 0.10 mL、23-乙酰澤瀉醇B 0.40 mL），按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依法測定，計算回收率，各組分的平均回收率（n=6）在97.72%～99.12%，RSD在0.61%～2.01%之間，詳見表3。

2.4 ?樣品測定

采用上述方法對5批杞菊地黃膠囊中的7種有效成分進(jìn)行檢測。結(jié)果5批樣品中莫諾苷含量在0.28～0.35 mg·粒-1，綠原酸含量在0.08～0.11 mg·粒-1，馬錢苷含量在0.30～0.48 mg·粒-1，木犀草苷含量在0.21～0.48 mg·粒-1，丹皮酚含量在0.62～0.76 mg·粒-1，

23-乙酰澤瀉醇C含量在0.04～0.08 mg·粒-1，23-乙酰澤瀉醇B含量在0.15～0.32 mg·粒-1。詳見表4。

3 討論

現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)并未對杞菊地黃膠囊的君藥菊花及佐藥鹽澤瀉進(jìn)行質(zhì)量控制，本文建立的UPLC-MS/MS方法同時測定了君藥菊花、臣藥酒萸肉、佐藥牡丹皮和鹽澤瀉中7種有效成分，方法簡單、快速、重復(fù)性好，符合中藥制劑的相關(guān)分析要求，可用于杞菊地黃膠囊的質(zhì)量控制，對現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善具有十分重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)曾嘗試將君藥枸杞子中的甜菜堿、熟地黃中的地黃苷D納入本系統(tǒng)同時測定，但因甜菜堿極性較大，在反相色譜柱中基本不保留，并且甜菜堿為小分子物質(zhì)，干擾較大;而地黃苷D在本系統(tǒng)中一直未找到合適的質(zhì)譜條件，參考文獻(xiàn)報道的質(zhì)譜條件[7]，對照品和樣品中幾乎無響應(yīng)，故以上兩種成分不適合在本系統(tǒng)中與其它成分同時測定。

有文獻(xiàn)報道，杞菊地黃膠囊及其同系列品種中有效成分的含量測定采用的均為HPLC法[8-12]，并且有采用HPLC法同時測定杞菊地黃口服液中12種成分的報道[13]。但因不同成分在紫外檢測器的最大吸收波長不一致，要在同一高效液相色譜系統(tǒng)中同時兼顧不同成分的檢測靈敏度比較困難，同時紫外檢測器與質(zhì)譜檢測器相比靈敏度低、專屬性差，不能有效區(qū)分同保留時間的不同物質(zhì)。而中成藥因其處方組成復(fù)雜，背景干擾較嚴(yán)重，因此在中成藥的質(zhì)量分析中靈敏度和專屬性尤為重要。特別在靈敏度和專屬性要求非常高的藥物療效、藥動學(xué)等相關(guān)研究中紫外檢測器基本不適用，而本文建立的UPLC-MS/MS法具有靈敏度高和專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，不僅可以為杞菊地黃膠囊的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐，也可以為該制劑的藥物療效、藥動學(xué)等相關(guān)研究提供一定的參考。

本文建立的液質(zhì)聯(lián)用方法采用的三重四級桿質(zhì)譜儀作為檢測器，具有靈敏度高和專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，因此，其不僅可以為杞菊地黃膠囊的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐，也可以為該制劑的藥物療效、藥動學(xué)等相關(guān)研究提供一定的參考。

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