莪術(shù)二酮通過VEGF/VEGFR2信號通路對肝癌HepG2細(xì)胞微環(huán)境下HHSEC增殖的影響

曹如柔 周堅 王其美 章茜 王容容 陳茂

〔摘要〕 目的 探討莪術(shù)二酮對肝癌HepG2細(xì)胞微環(huán)境下的人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（human hepatic sinusoidal endothelial cells， HHSEC）增殖的抑制作用，并闡明其可能機制。方法 CCK-8法檢測不同濃度（0.5%、1%、2%、4%、8%）的HepG2細(xì)胞上清液處理HHSEC后的細(xì)胞增殖率;HHSEC分為空白組、陽性對照組及莪術(shù)二酮低、中、高劑量組，分別予以M199培養(yǎng)基、含1 μg/L順鉑注射液的M199培養(yǎng)基、0.5、1、2 μg/L濃度的莪術(shù)二酮工作液培養(yǎng)。應(yīng)用RT-PCR法和Western blot法檢測不同濃度莪術(shù)二酮干預(yù)后HHSEC內(nèi)的VEGF、VEGFR2 mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 2%、4%及8%的HepG2細(xì)胞上清液可促進(jìn)HHSEC的增殖（P<0.05）;在4% HepG2細(xì)胞上清液作用下，0.5、1、2 μg/L莪術(shù)二酮均可抑制HepG2細(xì)胞上清液對HHSEC的增殖作用（P<0.05），隨著濃度的增加，HHSEC增殖率降低明顯，不同濃度組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在HepG2細(xì)胞微環(huán)境下，與空白組相比，莪術(shù)二酮高劑量組HHSEC中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01），莪術(shù)二酮中、高劑量組VEGFR2 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯降低（P<0.01）。結(jié)論 莪術(shù)二酮對HepG2細(xì)胞微環(huán)境下的HHSEC具有抗增殖活性，其作用機制可能與抑制HepG2細(xì)胞微環(huán)境下HHSEC中VEGF和VEGFR2的表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 肝癌;莪術(shù)二酮;VEGF/VEGFR2;HepG2細(xì)胞;人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.004

The Effect of the Curdione on the Proliferation of HHSEC Under the Microenvironment of

HepG2 Cells via VEGF/VEGFR2 Signaling Pathway

CAO Rurou1， ZHOU Jian2*， WANG Qimei2， ZHANG Xi2， WANG Rongrong2， CHEN Mao2

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Department of Oncology，

The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the inhibitory effect of curdione on the proliferation of human hepatic sinusoidal endothelial cells （HHSEC） in the microenvironment of liver cancer HepG2 cells， and to clarify its possible mechanism. Methods CCK-8 method was used to detect the cell proliferation rate of HepG2 cells supernatants of different concentrations （0.5%， 1%， 2%， 4%， 8%） after HHSEC treatment; HHSEC was divided into blank group， positive control group and curdione low， medium， and high-dose groups， and were cultured with M199 medium， M199 medium containing 1 μg/L cisplatin injection， and working solution of curdione at 0.5， 1， and 2 μg/L. RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of VEGF and VEGFR2 mRNA and protein in HHSEC after the intervention of different concentrations of curdione. Results 2%， 4% and 8% of HepG2 cells supernatants can promote the proliferation of HHSEC （P<0.05）; under the action of 4% HepG2 cells supernatants， 0.5， 1， 2 μg/L curdione can inhibit the proliferation effect of HepG2 cells supernatant on HHSEC （P<0.05）. With the increase of concentration， the proliferation rate of HHSEC decreased significantly， and the differences between groups of different concentrations were statistically significant （P<0.05）. In the microenvironment of HepG2 cells， compared with the blank group， the expression of VEGF mRNA and protein in HHSEC of the curdione high-dose group was significantly reduced （P<0.01）， and the expression of VEGFR2 mRNA and protein in curdione middle and high-dose group were both decreased （P<0.01）. Conclusion Curdione has anti-proliferative activity on HHSEC in HepG2 cells microenvironment， and its mechanism of action may be related to inhibiting the expression of VEGF and VEGFR2 in HHSEC in HepG2 cells microenvironment.

〔Keywords〕 hepatic carcinoma; curdione; VEGF/VEGFR2; HepG2 cells; human hepatic sinusoidal endothelial cells

原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性消化道腫瘤，我國每年約有40萬以上的原發(fā)性肝癌患者，占世界肝癌總?cè)藬?shù)的一半以上[1-2]。莪術(shù)二酮作為莪術(shù)中含量最高的倍半萜類物質(zhì)，其藥理作用廣泛，具有抗血小板聚集、減輕化療不良反應(yīng)等活性，還能降低人乳腺癌HCC1937細(xì)胞的遷移和侵襲能力[3-5]，但其抗癌機制尚未明確。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是促進(jìn)血管生成的調(diào)節(jié)因子[6]，其高表達(dá)對誘導(dǎo)腫瘤血管生成，加速肝癌的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移起重要作用[7-8]。VEGF基因沉默可抑制肝癌細(xì)胞HepG2的遷移和侵襲的能力[9]，提示了腫瘤微血管生成對肝細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展的重要意義。故課題組推測莪術(shù)二酮抑制肝癌細(xì)胞生長的作用可能也與抑制腫瘤微血管生成有關(guān)，因此，本研究主要就莪術(shù)二酮干預(yù)肝癌細(xì)胞促進(jìn)人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（human hepatic sinusoidal endothelial cells， HHSEC）增殖的機制進(jìn)行初步探討。

1 材料

1.1 ?細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治實驗室贈予;HHSEC購自北京裕恒豐科技有限公司。

1.2 ?藥物、試劑與儀器

莪術(shù)二酮（上海雅吉生物科技有限公司，批號：13657-68-6，純度>98%）;DMEM培養(yǎng)基（批號：AF29494674）、青鏈霉素（批號：J200029）、胰酶（批號：25200072）、胎牛血清（批號：SAG-01U-02）、M199培養(yǎng)基（批號：11875093）、BCA蛋白測定試劑盒（批號：SF249041）均購自美國Thermo Fisher公司;RT-PCR試劑盒（美國ABI公司，批號：A1A1169）。

SW-CJ-2F型垂直超凈工作臺（中國蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;HERAcell 240i型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）;EIX808U型全自動酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）;powerpac型電泳儀、Mini Trans-Blot C型轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）;G：BOX Chemi XRQ型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Syngene公司）。

2 方法

2.1 ?細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2采用10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和 100 g/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天傳代1次。

HHSEC采用5%胎牛血清、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的M199培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次，3天傳代1次。

2.2 ?藥物處理

將匯合度達(dá)95%以上的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基吸出，通過截留分子量為5000 Da的超濾管3000 r/min，離心半徑5 cm，離心15 min，濃縮回收細(xì)胞上清液，每10 mL上清液濃縮成100 μL，用M199培養(yǎng)基稀釋配制成含0.5%、1%、2%、4%、8% HepG2細(xì)胞上清液的M199工作液培養(yǎng)基。以10 mL M199培養(yǎng)基濃縮成100 μL作為空白組工作液，用不同濃度M199工作液培養(yǎng)基培養(yǎng)HHSEC，選取最佳濃度。將莪術(shù)二酮單體溶于DMSO，配制成1 μg/mL的母液，無菌微孔濾膜過濾，-20 ℃保存。實驗時用2%的M199工作液培養(yǎng)基稀釋成0.5、1、2 μg/L濃度的藥液。

2.3 ?CCK-8檢測莪術(shù)二酮對HHSEC增殖的影響

取對數(shù)生長期的HHSEC，制成單細(xì)胞懸液，均勻接種于96孔板，每孔1×104個細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，棄舊培養(yǎng)基，HHSEC分為空白組、陽性對照組及莪術(shù)二酮低、中、高劑量組，每孔分別加入100 μL M199培養(yǎng)基、含1 μg/L順鉑注射液的M199培養(yǎng)基、0.5、1、2 μg/L濃度的莪術(shù)二酮工作液，每組設(shè)置5個復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按說明書每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度。

2.4 ?建立非接觸式細(xì)胞共培養(yǎng)模型

參照非接觸式體外血腦屏障模型[10]，建立HepG2-HHSEC共培養(yǎng)模型。運用transwell 3412細(xì)胞培養(yǎng)池，在上孔中接種2.5×105個HepG2細(xì)胞，下孔中接種1×105個HHSEC，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.5 ?RT-PCR法檢測莪術(shù)二酮對HHSEC中VEGF、VEGFR2 mRNA表達(dá)的影響

細(xì)胞分組及培養(yǎng)同“2.3”項，按試劑盒說明書分別提取transwell 3412細(xì)胞培養(yǎng)池下孔中HHSEC總RNA、逆轉(zhuǎn)錄cDNA，RT-PCR分別檢測VEGF、VEGFR2 mRNA的相對表達(dá)量。引物序列由華大基因公司合成，VEGF引物為：正向引物5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，反向引物5'-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3';VEGFR2引物為：正向引物 5'-AAGAGATTTGT?TCCGGATGG-3'，反向引物5'-CGGCAGATAGCT?

CAATTTCA-3'。

2.6 ?Western blot法檢測莪術(shù)二酮對HHSEC中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞分組及培養(yǎng)同“2.3”項，按試劑盒說明書提取transwell 3412細(xì)胞培養(yǎng)池下孔中HHSEC的總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。Western blot進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜及成像，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

2.7 ?統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0分析，結(jié)果以“x±s”表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性時，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD方法。數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性時，使用非參數(shù)檢驗進(jìn)行分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?HepG2細(xì)胞對HHSEC增殖的影響

在相同培養(yǎng)條件下，與0% HepG2相比，2%～8%的HepG2細(xì)胞上清液促進(jìn)了HHSEC的增殖（P<0.05）。與2% HepG2細(xì)胞上清液相比，4%、8% HepG2細(xì)胞上清液均明顯促進(jìn)HHSEC的增殖（P<0.05）。選取4% HepG2細(xì)胞上清液加入M199培養(yǎng)基以促進(jìn)HHSEC增殖。見圖1。

3.2 ?莪術(shù)二酮對HepG2細(xì)胞微環(huán)境下的HHSEC增殖的影響

在相同的作用條件下，與空白組相比，陽性對照組及莪術(shù)二酮低、中、高劑量組均可抑制HHSEC的增殖（P<0.05）;隨著莪術(shù)二酮濃度的增加，HHSEC抑制率增加，不同濃度組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與陽性對照組比較，莪術(shù)二酮低、中劑量組HHSEC抑制率升高（P<0.05），莪術(shù)二酮高劑量組抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

3.3 ?莪術(shù)二酮對HepG2細(xì)胞微環(huán)境下HHSEC中VEGF、VEGFR2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

在HepG2細(xì)胞微環(huán)境下，與空白組比較，陽性對照組、莪術(shù)二酮高劑量組的HHSEC中VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01），莪術(shù)二酮中劑量組中VEGFR2 mRNA和蛋白表達(dá)降低（P<0.05），莪術(shù)二酮低劑量組中VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表達(dá)輕度降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與陽性對照組比較，莪術(shù)二酮低、中劑量組VEGF mRNA及蛋白表達(dá)、莪術(shù)二酮低劑量組VEGFR2 mRNA及蛋白表達(dá)、莪術(shù)二酮中劑量組VEGFR2蛋白表達(dá)升高（P<0.05），莪術(shù)二酮高劑量組VEGF、VEGFR2 mRNA及VEGF蛋白表達(dá)降低差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），莪術(shù)二酮高劑量組VEGFR2蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。隨著莪術(shù)二酮濃度的增加，HHSEC中VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低，除莪術(shù)二酮低劑量組與中劑量組VEGF蛋白表達(dá)比較無差異外，其余組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3-5。

4 討論

肝癌作為世界第四大惡性腫瘤，肝內(nèi)血管豐富，新生血管形成能促進(jìn)瘤體的生長，從而導(dǎo)致腫瘤組織增生及轉(zhuǎn)移，引起疾病惡化[11]。目前，針對肝癌的治療主要是通過外科或局部放化療，損傷腫瘤組織的同時也嚴(yán)重影響了自身細(xì)胞，中藥作為中醫(yī)學(xué)的瑰寶，其在肝癌的防治中發(fā)揮著十分重要的作用，研究[12]表明，臭牡丹提取物可能通過提高Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

中藥莪術(shù)味辛、苦，性溫，歸肝、脾經(jīng)，具有破血行氣、消積止痛、活血化瘀等功效。多應(yīng)用于癥瘕痞塊、瘀血經(jīng)閉、胸痹心痛、食積氣滯等病癥。其藥用活性成分主要為揮發(fā)油類成分、姜黃素類及多糖，具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗血小板聚集、抗血栓等作用[13]，用于腫瘤的治療療效確切。莪術(shù)二酮作為其含量最高的倍半萜類物質(zhì)，研究[14-15]表明其對肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、凋亡有顯著影響，而其是否引起腫瘤組織微環(huán)境的改變，降低血管生成目前并不明確。本研究探討莪術(shù)二酮對HepG2肝癌細(xì)胞干預(yù)下HHSEC增殖作用的影響，試圖闡明其對肝癌細(xì)胞微環(huán)境中血管新生的影響及其可能的作用機制。

本研究首先證實2%～8%的肝癌HepG2細(xì)胞的上清濃縮液均可促進(jìn)HHSEC增殖，提示肝癌細(xì)胞可生成促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的物質(zhì)，該物質(zhì)可能起到促進(jìn)肝內(nèi)血管生成的作用，而0.5、1、2 μg/L的莪術(shù)二酮明顯抑制了該增殖效應(yīng)，藥物濃度越高，抑制效應(yīng)越明顯，呈正相關(guān)趨勢。

VEGF是生理和病理情況下血管生成的主要調(diào)節(jié)者，VEGF與其受體VEGFR2的相互作用在肝癌微血管新生過程中均扮演著重要角色，是機體中最重要且最直接的促血管生成通路。通過復(fù)雜的信息傳導(dǎo)通路直接促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，為腫瘤組織增殖、轉(zhuǎn)移提供適合的微環(huán)境[16-20]。本研究結(jié)果顯示莪術(shù)二酮抑制了HHSEC自身對VEGF的合成并降低了HHSEC中VEGFR2的表達(dá)，莪術(shù)二酮濃度越高，抑制作用越明顯，并且莪術(shù)二酮高劑量組的抑制作用接近于順鉑，提示莪術(shù)二酮對HHSEC具有直接抑制作用，降低了肝癌微環(huán)境下HHSEC的增殖。

綜上所述，莪術(shù)二酮對HepG2細(xì)胞微環(huán)境下的HHSEC具有抗增殖活性，其作用機制可能是直接抑制了HHSEC中VEGF和VEGFR2的表達(dá)。此外，該體外實驗不僅為莪術(shù)二酮用于肝癌治療提供了實驗基礎(chǔ)，同時也為肝癌臨床藥物研究提供了新的方向。

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〔收稿日期〕2020-10-24

〔基金項目〕湖南省中醫(yī)藥研究院科研課題（201711）。

〔作者簡介〕曹如柔，女，在讀碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治惡性腫瘤。

〔通信作者〕*周 ?堅，男，副主任醫(yī)師，碩士，E-mail：15973124870@163.com。