減肥類保健食品中非法添加物快速測(cè)定分析

胡飛杰，王 迪，余恒琳，朱毛毛，徐 寧，王超璠，戴彩霞

（南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 210019）

近些年減肥類保健食品熱銷，面對(duì)巨大的市場和利益的誘惑，一些不法廠商為了追求療效，在保健食品生產(chǎn)過程中盲目添加一些非法添加藥物［1-2］。西布曲明最早是用于治療抑郁癥的藥品，后來無意中被發(fā)現(xiàn)其減重作用更強(qiáng)，于是被藥企用于減肥藥研發(fā)［3］。長期過量或?yàn)E用西布曲明可使血糖升高，血鉀降低，會(huì)引起厭食、內(nèi)分泌紊亂、心律不齊、高血壓、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、肝功能異常等不良癥狀，后果非常嚴(yán)重［4-6］。儲(chǔ)蓉等［7］通過對(duì)84批減肥類保健食品中非法添加化學(xué)物質(zhì)的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：減肥類保健食品中非法添加的化學(xué)物質(zhì)以鹽酸西布曲明、酚酞比較常見。減肥類的保健食品近幾年檢出率較高的添加的違禁藥物還有鹽酸西布曲明衍生物等［8-10］。

目前有很多關(guān)于減肥類保健食品中鹽酸西布曲明和酚酞的檢測(cè)方法的研究，主要的檢驗(yàn)方法有液相色譜法［11］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［12］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［13］、離子遷移譜法［14］等。質(zhì)譜雖然檢測(cè)靈敏度高，但也有弊端。據(jù)有關(guān)報(bào)道，不法商販?zhǔn)菓{感覺隨意添加西布曲明等非法添加藥物，一旦檢出，其含量就比較高［15］，直接進(jìn)氣相色譜質(zhì)譜或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，儀器極易污染，而質(zhì)譜儀器價(jià)格昂貴，成本明顯增高。若多次稀釋再進(jìn)質(zhì)譜，則會(huì)造成誤差大定量不準(zhǔn)確。涂鳳蓮等［16］利用液相色譜測(cè)定西布曲明及其兩種衍生物、酚酞，檢測(cè)分析時(shí)間較長，色譜峰的分離度不好。減肥類中成藥和保健食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件2012005［17］中，液相色譜儀器條件表述不明確，且很少對(duì)液相色譜法進(jìn)行優(yōu)化，色譜峰有拖尾現(xiàn)象。本研究針對(duì)檢出率較高的鹽酸西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明和酚酞這四種物質(zhì)建立高效液相色譜法。對(duì)液相色譜儀器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳色譜儀器條件，并利用光譜進(jìn)行確證。另外還對(duì)液質(zhì)色譜法中離子對(duì)進(jìn)行優(yōu)化，選用3～4離子對(duì)進(jìn)行校驗(yàn)，進(jìn)一步提高液質(zhì)色譜確證的準(zhǔn)確度。從技術(shù)方面進(jìn)行突破，為市場監(jiān)管節(jié)約時(shí)間與成本，對(duì)保證保健食品的質(zhì)量安全具有非常重要的意義。

1 儀器與試劑

1.1 試驗(yàn)儀器

1260-液相色譜儀（美國安捷倫公司）；6470-液相色譜-質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；KQ-500DE型-數(shù)控超聲波（昆山市超聲儀器有限公司）；IKA Vor?tex2-渦旋儀器（德國IKA公司）；Milli-Q-超純水儀（默克化工技術(shù)（上海）有限公司）；SQP-電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司公司）；TDZ5-臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)材料與試劑

兩種不同劑型市售的聲稱減肥類保健品。

膠囊劑產(chǎn)品名稱：美林康牌左旋肉堿綠茶膠囊，生產(chǎn)廠家：威海南波灣生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：A03200915A。

茶劑產(chǎn)品名稱：碧生源?牌常菁茶，生產(chǎn)廠家：北京澳特舒爾保健品開發(fā)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：04200602。

超純水，乙腈、甲醇（色譜級(jí)，上海安普科技股份有限公司），乙酸（≥99.5%，分析純，上海泰坦化學(xué)有限公司），乙酸銨（≥98.0%，特優(yōu)級(jí)，上海泰坦化學(xué)有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：酚酞（99.8%，北京曼哈格生物科技有限公司）、鹽酸西布曲明（99.5%，中國食品藥品檢定研究院）、鹽酸N-單去甲基西布曲明（99.4%，北京曼哈格生物科技有限公司）、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明（98.9%，北京曼哈格生物科技有限公司），見表1。

表1 4種非法添加物的基本信息Table 1 Basic information of four illegal additions

2 研究方法

2.1 樣品的制備

減肥膠囊：取20粒膠囊內(nèi)容物充分混勻；減肥茶：取20 g袋裝茶充分混勻；精密稱取混勻的樣品1.0000 g，于25 mL容量瓶中，加15 mL甲醇，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放置室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻后離心，取上清液，即得。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

分別精密稱取鹽酸西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、酚酞4種標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL棕容量瓶中，加入5 mL甲醇，超聲溶解20 min，放冷至室溫，用甲醇定容至刻度，渦旋混勻，配置成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃冰箱中保存。

2.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液

吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液200μL置于10 mL棕容量瓶中，用甲醇稀釋配置成混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。其中四種物質(zhì)的濃度均為200.0μg/mL，于4℃以下冰箱中保存。

2.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

精密吸取2.2.2的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液用甲醇稀釋至樣品檢測(cè)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的最終濃度為5.0、10.0、2 0.0、50.0、100.0μg/mL。

2.3 色譜儀器條件的單因素實(shí)驗(yàn)

影響液相色譜出峰時(shí)間、峰形和分離度的因素主要有色譜柱種類、柱溫、流動(dòng)相配比和流速等。通過單因素分別考察色譜柱種類、柱溫、流動(dòng)相配比和流速對(duì)四種非法添加物的分離效果和峰形的影響。色譜柱對(duì)分離效果和峰形的影響：分別使用Agilent Eclipse Plus C18（5μm，4.6×250 mm）和GL Sciences Inc.InertSustain C18（5μm，4.6×250 mm）對(duì)鹽酸西布曲明等4種物質(zhì)進(jìn)行分離效果的比較；色譜柱柱溫對(duì)分離效果和峰形的影響：考察不同柱溫（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）對(duì)4種非法添加物質(zhì)分離效果；流動(dòng)相不同配比對(duì)分離效果和峰形的影響：流動(dòng)相A，乙腈；流動(dòng)相B，0.02 mol/L乙酸銨水溶液（用乙酸調(diào)pH至4.0±0.2），比較不同流動(dòng)相配比B：A為41：59、44：56、47：53、50：50、53：47的分離效果；流速的選擇對(duì)分離效果和峰形的影響：流速分別選擇0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min四個(gè)流速進(jìn)行比較。

2.4 質(zhì)譜色譜條件

液相條件：色譜柱，InertSustain C18（2μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫40℃；進(jìn)樣體積5.0μL；流動(dòng)相A為0.01 mol/L乙酸銨（0.1%甲酸），B為乙腈；流速0.3 mL/min。洗脫梯度見表2。酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明在正離子模式下進(jìn)行全掃面和單離子掃描得到母離子并優(yōu)化碎裂電壓，使母離子的豐度達(dá)到最優(yōu)，再進(jìn)行子離子掃描。選擇3～4個(gè)特征碎片離子對(duì)，優(yōu)化相對(duì)應(yīng)的碰撞電壓，并選取豐度相對(duì)較高的子離子作為定量離子。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure

2.5 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y，mAu×s）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

重復(fù)性試驗(yàn)和回收試實(shí)驗(yàn)：選取減肥膠囊，減肥茶的空白基質(zhì)樣品，每種樣品稱1 g，分別添加低、中、高3個(gè)水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平測(cè)定做6次平行實(shí)驗(yàn)。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 液相色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 色譜柱的選擇

在同一流動(dòng)相條件下，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱上4種物質(zhì)均能實(shí)現(xiàn)很好的分離，而且峰形更尖銳，靈敏度更高，比補(bǔ)充檢測(cè)方法［18］中峰分離度更好。而在GL Sciences Inc.InertSustain C18的條件下，酚酞和鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明完全重合成一個(gè)峰，分離效果很差，且峰寬都較大，有拖尾現(xiàn)象。因此，選擇Agilent Eclipse Plus C18（5μm，4.6×250 mm）作為分離色譜柱，4種物質(zhì)的高效液相色譜圖見圖1。

3.1.2 色譜柱柱溫的選擇

柱溫升高可以降低流動(dòng)相粘度、提高傳質(zhì)效率、縮短分析時(shí)間，但溫度太高影響色譜柱的使用壽命。由于4種物質(zhì)中酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明分離效果并不理想，因此考慮溫度對(duì)分離度的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同一色譜條件下，隨著溫度的升高，酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明和鹽酸N-單去甲基西布曲明的分離度越來越好。但是當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí)，基線波動(dòng)開始增大，在濃度較低時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響，因此選擇50℃的柱溫，分離效果最好，基線最穩(wěn)，圖譜見圖1。

3.1.3 流動(dòng)相配比選擇

試驗(yàn)比較流動(dòng)相A，乙腈；流動(dòng)相B，0.02 mol/L乙酸銨水溶液（用乙酸調(diào)pH至4.0±0.2）不同配比分離效果。當(dāng)乙腈比例為44時(shí)，4種物質(zhì)集中在一起，無法分離。隨著乙腈比例的增大，4種物質(zhì)的分離度逐漸增大。當(dāng)流動(dòng)相B：A比例為47：53等度洗脫時(shí)，此條件下4種物質(zhì)明顯分開，分離度增大，且出峰時(shí)間穩(wěn)定。最終選擇乙酸銨水溶液：乙腈為47：53，圖譜見圖1。

圖1 225 nm下酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明的高效液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of phenolphthalein，N-didesmethyl sibutramine hydrochloride，didesmethyl sibutramine，sibutratmine hydrochloride monohydrate

3.1.4 流速的選擇

流速分別選擇四個(gè)不同流速進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)流速為0.5 mL/min、0.8 mL/min時(shí)4種物質(zhì)出峰順序?yàn)辂}酸N，N-雙去甲基西布曲明、酚酞、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明，酚酞出峰在兩種衍生物出峰中間且峰與峰相互連接，分離度不好液相色譜難以定量。當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)4種物質(zhì)出峰順序?yàn)榉犹Ⅺ}酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明，酚酞最先出峰且4種物質(zhì)明顯分開，分離度增大。當(dāng)流速為1.2 mL/min時(shí)4種物質(zhì)雖都能分開但分離度不如1.0 mL/min時(shí)，所以流速選擇1.0 mL/min。

3.1.5 色譜峰的定性

酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明的高效液相色譜最大吸收波長見圖2。通過將樣品圖譜與4種非法添加藥物標(biāo)準(zhǔn)品的光譜比對(duì)進(jìn)行排除雜質(zhì)的干擾進(jìn)行確證。

圖2 酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明的高效液相色譜光譜圖Fig.2 Wavelength spectrograms of phenolphthalein，N-didesmethyl sibutramine hydrochloride，didesmethyl sibutramine，sibutrat?mine hydrochloride monohydrate on photodiode array detector

3.2 線性關(guān)系、方法檢出限及定量限

配制系列的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到線性回歸方程。結(jié)果表明，各目標(biāo)化合物在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；配制標(biāo)準(zhǔn)溶液混標(biāo)，用空白基質(zhì)溶液稀釋到適量濃度，以儀器3倍和10倍性噪比確定方法檢出限和方法定量限，結(jié)果見表3。

表3 4種非法添加物的線性關(guān)系Table 3 Linear relationship of four illegal additions

3.3 重復(fù)性和回收率

重復(fù)性和回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，三個(gè)不同添加水平的回收率在80.4%～104.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%～9.5%，都控制在10%以內(nèi)。說明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。均符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》中要求。

表4 4種非法添加物不同濃度添加水平回收率結(jié)果Table 4 Recovery results of four illegal additions at different concentrations

3.4 用液質(zhì)方法進(jìn)行確證

質(zhì)譜參數(shù)：AJS-ESI電離源，正離子電離模式，監(jiān)測(cè)模式：MRM。通過對(duì)4種非法添加物的離子對(duì)優(yōu)化得到的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)見表5。液相中確認(rèn)有非法添加物后，再通過液質(zhì)儀器與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定量離子和定性離子進(jìn)行對(duì)比，若定量離子和定性離子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一致，則該樣品確認(rèn)含有該非法添加物。參考圖譜見圖3和圖4，分別為4種化合物的總離子流圖、定量離子和定性離子圖。

表5 4種非法添加物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)Table 5 Multi reaction monitoring mass spectrum parameters of four illegal additions

圖3 酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明的總離子流圖Fig.3 Total ion current diagram of phenolphthalein，N-didesmethyl sibutramine hydrochloride，didesmethyl sibutramine，sibutrat?mine hyclrochloride monohydrate

圖4 酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜疊加圖及離子對(duì)比圖Fig.4 MRM mass spectrogram stack and ion contrast diagram of phenolphthalein，N-didesmethyl sibutramine hydrochloride，dides?methyl sibutramine，sibutratmine hydrochloride monohydrate

3.5 實(shí)際樣品分析

按照本研究中液相色譜法對(duì)市售30批次減肥類保健品進(jìn)行分析，其中3批次檢測(cè)出與鹽酸西布曲明色譜峰出峰時(shí)間一致，對(duì)比液相光譜圖確定為鹽酸西布曲明，其含量極高，進(jìn)一步稀釋樣品進(jìn)行液質(zhì)核對(duì)，此3批次確為鹽酸西布曲明。該方法可用于實(shí)際減肥類保健食品樣品的快速定性定量，大大提高了檢測(cè)效率。

4 討論

經(jīng)過近兩年的保健食品檢測(cè)，減肥類保健品中檢出率較高的非法添加為酚酞和西布曲明及其衍生物，監(jiān)督部門需要重點(diǎn)關(guān)注。本研究建立了一種利用高效液相色譜技術(shù)于15 min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明的檢測(cè)方法，并優(yōu)化了質(zhì)譜方法中的離子對(duì)。從研究試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，各物質(zhì)成分的線性關(guān)系良好，回收率均較高，展現(xiàn)出了分離能力強(qiáng)，靈敏度高，分析速度快，定量分析準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，可用于減肥類保健食品中非法添加化學(xué)藥物的定性篩查和定量檢測(cè)，為保健食品中減肥類非法添加監(jiān)管提供檢測(cè)技術(shù)。然而本研究是一次性檢測(cè)4種物質(zhì)，檢測(cè)物質(zhì)數(shù)量稍少，今后的研究將增加檢測(cè)物質(zhì)的數(shù)量，往高通量檢測(cè)方向上開展研究。